郭 輝,陳 燦,夏秀忠,楊行海,梁樹輝,張曉麗,徐志健,農(nóng)保選,張宗瓊,馮 銳

(廣西壯族自治區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻研究所/廣西水稻遺傳育種重點實驗室,南寧 530007)

【研究意義】褐飛虱是我國南方水稻生產(chǎn)中的主要害蟲,具有遠(yuǎn)距離遷飛性、爆發(fā)性、突發(fā)性等特點,是造成水稻產(chǎn)量減少和經(jīng)濟(jì)損失的重要原因。2006—2015年,平均每年褐飛虱造成實際稻谷損失1.20×106t[1]。實踐表明,發(fā)掘利用抗性基因,發(fā)展利用抗蟲品種控制蟲害,減少甚至不用農(nóng)藥,是農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的趨勢與時代需求[2]。因此,發(fā)掘和鑒定新的抗性基因資源具有重要意義。野生稻作為栽培稻的天然基因庫,蘊藏著無數(shù)栽培稻沒有或已削弱的特異優(yōu)良基因,是現(xiàn)代農(nóng)業(yè)的寶貴遺傳資源[3-4],若能轉(zhuǎn)育利用,不僅可提高水稻抗性,還可拓寬水稻的遺傳背景,充分發(fā)揮雜種優(yōu)勢,提高水稻品種的產(chǎn)量、品質(zhì)等綜合性狀。因此,開展廣西普通野生稻抗褐飛虱評價與遺傳多樣性分析,可為水稻抗性育種中抗源的選擇與利用提供重要參考信息?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】抗褐飛虱水稻種質(zhì)資源的鑒定評價是水稻抗性基因研究與利用的基礎(chǔ),研究人員已在野生稻和栽培稻中篩選到許多抗性種質(zhì)。顧正遠(yuǎn)等[5]對1700余份稻種資源進(jìn)行抗褐飛虱鑒定,篩選出抗性品種23份,其中多數(shù)為外國品種;段永紅等[6]從湖南省種質(zhì)資源庫收集保存的12 000余份稻種中篩選到我國的抗褐飛虱材料70余份;黃鳳寬等[7]對主要來源于國際水稻所的383份稻種資源進(jìn)行褐飛虱和白背飛虱抗性鑒定,篩選出107份兼抗2種害蟲的材料;李青等[8]對202份廣西藥用野生稻鑒定發(fā)現(xiàn),高抗至中抗材料占94.06%。在水稻抗褐飛虱評價中,對每種褐飛虱生物型有抗性的資源在野生稻中所占的比例是栽培稻中的30倍[9],野生稻擁有比栽培稻更廣譜的抗性,可能蘊藏著更多抗性基因位點。目前已報道的水稻抗褐飛虱基因位點不少于46個[10-13],這些基因中有21個來自亞洲栽培稻(Oryzasativa),1個來自非洲栽培稻(O.glaberrima),其余分別來自6種不同野生稻,而從普通野生稻中發(fā)掘的抗褐飛虱位點占已知抗性位點的23%。從廣西普通野生稻中發(fā)現(xiàn)的抗褐飛虱基因bph29也被成功克隆[14]?！颈狙芯壳腥朦c】普通野生稻與栽培稻同屬AA型基因組,兩者間沒有生殖隔離,普通野生稻中的優(yōu)異基因更容易轉(zhuǎn)入栽培稻進(jìn)行育種利用。而野生稻的遺傳多樣性豐富,對其進(jìn)行全面研究,并篩選出具有重要育種價值的種質(zhì)資源對水稻育種具有重要意義。【擬解決的關(guān)鍵問題】本研究對篩選到的76份廣西普通野生稻資源進(jìn)行抗褐飛虱評價,并基于SSR分子標(biāo)記進(jìn)行分子水平遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)評估,加強對其遺傳基礎(chǔ)的了解,為優(yōu)異抗性種質(zhì)資源的合理利用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試材料是從廣西普通野生稻中篩選出的76份種質(zhì)資源,分別來自8個居群(表1)。

1.2 褐飛虱抗性鑒定

抗褐飛虱種質(zhì)苗期鑒定參照劉光杰等[15]的方法,將每份待鑒定種質(zhì)取適量種子,催芽后選取已發(fā)芽種子播于盤內(nèi),每行按22～25粒播種,3次重復(fù),待秧苗3葉期時,選取2～3齡若蟲進(jìn)行苗期接蟲鑒定,每株苗接蟲7～10頭,TN1為感蟲對照品種,Ptb33為抗蟲對照品種,當(dāng)TN1死亡7 d后進(jìn)行調(diào)查。按國際水稻研究所標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行抗性分級,1級：高抗(0.1～1.9),不受損害或第1葉梢變黃;3級：抗(2.0～3.9),第1、2葉變黃;5級：中抗(4.0～5.9),第1～3葉變黃或植株呈矮化;7級：中感(6.0～7.9),植株開始凋萎;9級：高感(8.0～9.0),植株死亡。

表1 76份野生稻來源與抗性評價

鑒定蟲源取自廣西南寧市周邊稻田,飼養(yǎng)于廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻研究所網(wǎng)室,在TN1稻株上繁殖,為混合生物型。

1.3 DNA提取

采集新鮮野生稻葉片,先用液氮低溫處理后再研磨,采用CTAB法提取葉片DNA,溶解后于4 ℃保存?zhèn)溆肹16]。

1.4 分子標(biāo)記引物篩選及分子標(biāo)記檢測

從120對引物中篩選出對野生稻擴增效果好、多態(tài)性高的62對引物進(jìn)行分析,引物基本信息見表2。水稻PCR擴增、電泳檢測參考趙鳳民等[17]的方法,PCR反應(yīng)體系10.0 μL：10×PCR buffer(含Mg2+)1.0 μL,10 μmol/L dNTP 0.2 μL,5 U/μLTaqDNA聚合酶0.1 μL,10 μmol/L上、下游引物各0.2 μL, DNA模板1 μL,ddH2O補足至10 μL。擴增程序：94 ℃預(yù)變性5 min,94 ℃ 35 s,55 ℃退火35 s,72 ℃ 45 s,進(jìn)行35個循環(huán);最后72 ℃延伸10 min,擴增產(chǎn)物4 ℃保存。擴增產(chǎn)物在7%非變性聚丙烯酰胺凝膠中恒壓電泳(8 V/cm),銀染檢測記錄基因型數(shù)據(jù)。

1.5 統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)采用Excel 2017整理,不同軟件的數(shù)據(jù)格式采用DataFormater軟件進(jìn)行轉(zhuǎn)換[18]。群體遺傳多樣性采用軟件PowerMarker ver 3.25進(jìn)行相關(guān)指數(shù)分析統(tǒng)計,包括主要等位基因頻率(MAF)、平均等位基因數(shù)(Na)、雜合度和多態(tài)信息含量(PIC)、Nei’s基因多樣性指數(shù)(He)[19],基于Nei’s遺傳距離采用Neighbor-joining法構(gòu)建聚類圖,系統(tǒng)發(fā)育樹采用MEGA 11編輯[20]。群體的遺傳結(jié)構(gòu)采用Structure ver 2.3.4軟件進(jìn)行分析[21]。利用GenAlEx 6.5分析居群間的遺傳分化系數(shù)(Fst)和基因流(Nm),并進(jìn)行不同類群的分子方差分析[22]。

2 結(jié)果與分析

2.1 廣西普通野生稻苗期褐飛虱抗性鑒定

76份廣西普通野生稻苗期抗褐飛虱鑒定結(jié)果顯示(表1),表現(xiàn)高抗的材料有7份,分別為YD-4、YD-40、YD-44、YD-45、YD-48、YD-65和YD-71,占總鑒定材料數(shù)的9.21%;表現(xiàn)為抗、中抗的材料有34和31份,分別占鑒定材料的44.74%和40.79%;中感材料有4份,占鑒定材料的5.26%;無高感材料。另外,由于普通野生稻的雜合性,在中感材料中也有抗級達(dá)3級的單株分離,為后期利用提供了豐富抗源材料。

2.2 廣西普通野生稻種質(zhì)資源的SSR遺傳多樣性分析

選取62對多態(tài)性較好的SSR標(biāo)記,對76份普通野生稻材料進(jìn)行遺傳多樣性檢測,結(jié)果如表2所示,圖1為引物RM3740對32份普通野生稻材料的擴增結(jié)果。所有分子標(biāo)記均表現(xiàn)出多態(tài)性,76份材料中共檢測到669個等位基因,平均每個位點含10.79個等位基因,其等位基因數(shù)變幅為4～19個;其中等位基因頻率小于0.05的稀有等位基因348個,占總數(shù)的52.02%,平均每個位點含5.613個。各SSR位點中等位基因頻率最高的為主要等位基因,其頻率變異范圍為0.158(RM333)～0.855(RM436),平均為0.373。He變異范圍為0.260(RM436)～0.894(RM333),平均為0.754。雜合度變異范圍為0.000～0.947,平均為0.434,其中僅2個位點為純合位點(RM205和RM474)。PIC變異范圍為0.248(RM436)～0.885(RM333),平均為0.727。說明供試普通野生稻材料的遺傳多樣性非常豐富。

表2 62對SSR引物的信息統(tǒng)計

續(xù)表2 Continued table 2

續(xù)表2 Continued table 2

圖1 引物RM3740對32份廣西普通野生稻材料的擴增結(jié)果Fig.1 Electrophoretic profiles of 32 wild rice germplasms amplified with primer RM3740

2.3 水稻居群褐飛虱抗性與遺傳多樣性的相關(guān)性

對廣西8個水稻居群的抗褐飛虱鑒定表明,各居群的平均抗級由大到小依次為：臨桂>貴港>博白>橫州>玉林>邕寧>防城港>扶綏,總體表現(xiàn)為來自桂北(臨桂)和桂東(貴港)材料的平均抗性高于桂南(防城港);而防城港居群的3個遺傳多樣性指標(biāo)Na、He和PIC值均高于其它居群,說明其遺傳多樣性較豐富;各居群He表現(xiàn)為防城港>邕寧>貴港>博白>扶綏>橫州>玉林>臨桂;按各居群的地理位置,緯度由大到小依次為臨桂>貴港>邕寧>橫州>扶綏>玉林>博白>防城港(表3)。相關(guān)分析結(jié)果表明,居群平均抗級與居群He的相關(guān)系數(shù)r為0.510,未達(dá)顯著水平(P>0.05,下同);居群平均抗級與居群緯度相關(guān)系數(shù)r為-0.549,未達(dá)顯著水平;居群緯度與居群He的相關(guān)系數(shù)r為-0.822,達(dá)顯著水平(P<0.05)。

表3 不同居群普通野生稻褐飛虱抗性與遺傳多樣性

2.4 廣西普通野生稻種質(zhì)資源的遺傳結(jié)構(gòu)分析

根據(jù)SSR多態(tài)性標(biāo)記分析結(jié)果,采用Structure ver 2.3.4軟件對76份種質(zhì)進(jìn)行群體遺傳結(jié)構(gòu)分析,設(shè)置分析群體數(shù)K(Truenumber of clusters)為1～10,Length of burnin Peiiod為50 000和 Number of MCMC Reps after Burnin為100 000,每個K值運行5次,分析結(jié)果顯示lnP(D)值在K=3時出現(xiàn)小拐點,之后隨K值的持續(xù)增加而一直增加。再進(jìn)一步估算ΔK值,發(fā)現(xiàn)ΔK值在K=3時出現(xiàn)峰值(圖2),說明可以將供試種質(zhì)劃分為3個類群(圖3)。其中第Ⅰ類群包括42份普通野生稻材料,分別來源于防城港、博白、玉林、貴港、橫州、邕寧和臨桂;第Ⅱ類群包括25份材料,分別來源于扶綏、貴港、邕寧、橫州和防城港;第Ⅲ類群包括9份材料,分別來源于玉林、扶綏、橫州和臨桂。從地理來源上分析,3個不同類群材料之間存在地理來源上的相互滲透現(xiàn)象。另外,K=3、4、5、6時,來自扶綏與貴港的類群及來自玉林的類群不隨K值的增加而改變,屬于比較獨特的類型;雖然博白與玉林地理位置相鄰,但分化明顯。

基于Nei’s遺傳距離,對76份試驗材料進(jìn)行Neighbor-joining聚類圖構(gòu)建,結(jié)果如圖4。相同居群多數(shù)為一類,有個別材料與其他居群相互滲透聚到一起。綠色線為第Ⅰ亞群,主要是來自博白與防城港的材料;紅色線為第Ⅱ亞群,主要是來自扶綏、邕寧與貴港的材料;藍(lán)色線為第Ⅲ亞群,主要是來自橫州、臨桂與博白的材料。

2.5 廣西普通野生稻抗褐飛虱種質(zhì)不同居群的遺傳分化水平

對不同水稻居群間進(jìn)行遺傳分化分析(圖5),8個居群間的Fst在0.044～0.167,其中85.71%居群間的Fst值為0.05～0.15,表現(xiàn)為中等程度的遺傳分化,博白與臨桂居群間顯示較高遺傳分化(Fst=0.167),防城港與博白、邕寧間及扶綏與貴港間的Fst小于0.05,遺傳分化可以忽略?；蛄鞣治鼋Y(jié)果顯示,Nm為1.246～5.474,其中21.43%居群間的Nm大于4,表現(xiàn)出高水平的基因流,即防城港、博白、邕寧居群間及貴港與扶綏間基因交流頻繁。臨桂與其他居群的基因流總體較小,表明臨桂與其他居群基因交流很少,這與Fst分析結(jié)果相同。

分別按8個居群、3個類群和4個抗性分群進(jìn)行分子方差分析(表4),群組間的變異比例較小,在3.41%～5.38%。變異主要來源為個體內(nèi),3個分群比例接近,分別占56.56%、56.18%和56.31%。個體間的變異比例分別為38.07%、40.26%和40.28%。說明廣西普通野生稻抗褐飛虱種質(zhì)存在豐富的個體遺傳變異。

3 討 論

優(yōu)異的抗性種質(zhì)資源是抗性育種的重要物質(zhì)基礎(chǔ)。本研究中76份廣西普通野生稻種質(zhì)對褐飛虱表現(xiàn)為高抗的材料占9.21%,抗與中抗分別占44.74%和40.79%。另有4份中感種質(zhì),這可能是由普通野生稻的雜合性引起的,廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院稻種資源中心在前期研究中發(fā)現(xiàn),通過遺傳純合在中抗材料中分離篩選出抗性級別更高的株系[23]。因此,抗級較低的材料對發(fā)掘與利用抗性基因仍具有重要意義。

圖2 ΔK值評估群體數(shù)目Fig.2 Estimation of the number of populations for K by calculating ΔK values

圖中BB、FCG、FS、GG、HZ、LG、YN和YL分別代表博白、防城港、扶綏、貴港、橫州、臨桂、邕寧和玉林。BB, FCG, FS, GG, HZ, LG, YN and YL in figure represented Bobai, Fangchenggang, Fusui, Guigang, Hengzhou, Lingui, Yongning and Yulin, respectively.圖3 76份廣西普通野生稻種質(zhì)群體結(jié)構(gòu)Fig.3 Population structure of 76 Guangxi common wild rice germplasms

圖4 基于Nei’s遺傳距離的Neighbor-joining聚類樹Fig.4 Neighbor-joining trees based on Nei’s genetic distance

對角線為居群名稱;對角線以下為Fst值,對角線以上為Nm值,顏色越深數(shù)值越大;Group中BB、FCG、FS、GG、HZ、LG、YN和YL分別代表博白、防城港、扶綏、貴港、橫州、臨桂、邕寧和玉林。Population’s name was in the diagonal; Fst values were below the diagonal and Nm values were above the diagonal, the darker the color the larger the value; BB, FCG, FS, GG, HZ, LG, YN and YL in Group represented Bobai, Fangchenggang, Fusui, Guigang, Hengzhou, Lingui, Yongning and Yulin, respectively.圖5 廣西普通野生稻抗褐飛虱種質(zhì)不同居群的Fst及NmFig.5 Fst and Nm between populations of Guangxi common wild rice germplasms with brown planthopper resistance

表4 AMOVA分子變異方差分析

廣西是我國野生稻資源最豐富的省區(qū),不僅是普通野生稻遺傳多樣性中心而且是栽培稻的起源中心[24]。本研究采用62對SSR標(biāo)記對72份廣西普通野生稻檢測,每對引物平均檢測到10.79個等位基因,He平均值為0.754,PIC平均值為0.727。分析結(jié)果中每對引物平均檢測等位基因數(shù)低于余萍等[25](24.91)與潘英華等[26](18.4375)對廣西普通野生稻的檢測結(jié)果,這是由于余萍等[25]的研究材料是中國普通野生稻初級核心種質(zhì)中廣西普通野生稻部分中的223份材料,潘英華等[26]的研究材料為廣西14個市283個居群4173份代表性材料,在材料分布與規(guī)模上差異較大;但與潘英華等[26]分析結(jié)果中的He(0.7182)相近。黃娟等[27]用36對SSR標(biāo)記檢測690份廣西普通野生稻,平均等位基因數(shù)為9.86,總遺傳多樣度為0.74;王興美等[28]同樣用36對SSR標(biāo)記檢測廣西普通野生稻256份,He為0.7859,PIC為0.7651;張曉麗等[29]對112份中國普通野生稻檢測表明,He為0.745;與本研究結(jié)果相符。本研究中He平均值(0.754)高于海南(0.2135)[30]、云南(0.1092)[31]、南亞與東南亞(0.684)[32]普通野生稻遺傳多樣性的評價;本研究中平均等位基因數(shù)(10.79)高于江西東鄉(xiāng)(5.83)[33]、福建漳浦(3.5238)[34]普通野生稻遺傳多樣性的評價;說明廣西普通野生稻遺傳多樣性水平較高;另外,居群緯度與居群He呈顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.822),符合緯度多樣性梯度格局(LDG),與前人研究結(jié)果相符[35-36]。

本研究中聚類分析與遺傳結(jié)構(gòu)分析都將供試種質(zhì)分為3個類群,同一居群在不同類群間有相互滲透現(xiàn)象,與潘英華等[26]的研究結(jié)果一致。不同居群間多數(shù)表現(xiàn)為中等程度的遺傳分化,臨桂居群與其他居群間表現(xiàn)出較高遺傳分化,基因交流也較低,這是由于臨桂的地理位置距其他居群較遠(yuǎn),與黃娟等[27]的研究結(jié)果基本一致。博白與玉林的基因交流有限,而與防城港、邕寧在地理位置上雖隔了六萬大山,但居群間基因交流頻繁,這與潘英華等[26]的研究結(jié)果相符,而黃娟等[27]認(rèn)為博白、玉林、北海一帶屬南流江流域,具有相對獨立的地理環(huán)境,區(qū)域聚類結(jié)果與本結(jié)果不完全相符。方差分析結(jié)果表明,本研究材料的遺傳變異主要來自類群內(nèi)個體間與個體內(nèi),類群間的變異較小,與前人對海南、廣東、江西普通野生稻不同居群間遺傳變異來源分析結(jié)果一致[37-39]。

4 結(jié) 論

廣西普通野生稻資源遺傳多樣性豐富,個體間遺傳差異大,本研究中大部分材料對褐飛虱表現(xiàn)出較好抗性。結(jié)合現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)鑒定新的抗性基因和優(yōu)異等位基因,并轉(zhuǎn)育創(chuàng)新抗性新種質(zhì),本研究篩選出的材料可用于培育多抗優(yōu)質(zhì)水稻品種。