譚 丹 陳家婷 郜 鈺 張曉軍 李 欣 閆貴云 李 銳 陳 芳 常利芳 張樹偉 郭慧娟 暢志堅(jiān) 喬麟軼

山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院 / 作物遺傳與分子改良山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 / 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部有機(jī)旱作農(nóng)業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(部省共建), 山西太原 030031

穗是小麥的重要器官。小麥穗部形態(tài)與穗長(zhǎng)、小穗數(shù)等農(nóng)藝性狀密切相關(guān), 直接影響植株產(chǎn)量。小麥穗型的建立可分為3 個(gè)階段, 即開花轉(zhuǎn)變期、小穗起止期和小花起止期[1]。其中, 小穗起止期是花序結(jié)構(gòu)形成的關(guān)鍵階段, 涉及小穗的起始、排布和終止, 最終決定了小穗數(shù)目[2]。生長(zhǎng)素是調(diào)控該時(shí)期小穗發(fā)育的主要內(nèi)源激素之一, 可通過濃度梯度和信號(hào)傳導(dǎo)兩個(gè)方面來調(diào)節(jié)小穗的分化和排列[1,3]。

植物生長(zhǎng)素一般由色氨酸(tryptophan, TRP)通過色胺(tryptamine, TRA)途徑或非色胺途徑合成[4]。在大麥小穗起止期, 色胺途徑受到基因調(diào)控而增強(qiáng), 合成的生長(zhǎng)素在小穗中從上到下濃度逐漸升高, 這種梯度分布影響大麥穗部棱型和側(cè)小穗發(fā)育, 增加了每穗小穗數(shù)和小穗密度進(jìn)而提高產(chǎn)量[5-7]。此外, 生長(zhǎng)素還作為信號(hào)分子進(jìn)入細(xì)胞核, 通過激活生長(zhǎng)素響應(yīng)因子(Auxin Response Factors,ARFs)來促進(jìn)或抑制下游靶基因的表達(dá), 進(jìn)而調(diào)控小穗發(fā)育[3,8]。ARFs 在決定小穗分生組織命運(yùn)和花序結(jié)構(gòu)方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用[2,9]。在小麥小穗出現(xiàn)雙脊(double ridge)之前,ARFs 就已經(jīng)開始受到生長(zhǎng)素誘導(dǎo)而上調(diào)[8]。小麥品種科農(nóng)9204 幼穗中的ARFs 在逆境環(huán)境下整體保持了較高的轉(zhuǎn)錄水平, 其單株穗數(shù)和小穗數(shù)顯著高于對(duì)照品種[10]。

為了進(jìn)一步發(fā)掘小麥穗型相關(guān)的生長(zhǎng)素通路基因,本研究選擇了2 個(gè)穗部形態(tài)差異明顯的小麥品系SY95-71和CH7034, 對(duì)其小穗起止期幼穗的內(nèi)源生長(zhǎng)素含量和轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行了比較分析, 從中鑒定候選基因; 并利用SY95-71 和CH7034 的RILs 群體及其多年多點(diǎn)穗部表型數(shù)據(jù)對(duì)候選基因開展關(guān)聯(lián)分析驗(yàn)證, 以期為穗型發(fā)育機(jī)制解析提供參考, 并為小麥理想穗型改良提供分子標(biāo)記。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

小麥品系SY95-71 和CH7034 在GS24 時(shí)期(Growth Stage 24)[11]的幼穗用于內(nèi)源生長(zhǎng)素測(cè)定、轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和qRT-PCR。其中, SY95-71 由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)舒煥麟副研究員和電子科技大學(xué)楊足君教授共同選育[12]; CH7034 由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)(原山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院)暢志堅(jiān)研究員選育[13]。SY95-71 和CH7034 的RIL 遺傳群體(含184 家系)及其在6 個(gè)大田環(huán)境下(2014 年成都、2015 年成都、2016 年運(yùn)城兩點(diǎn)、2015 年臨汾和2016 年臨汾)的穗長(zhǎng)、每穗小穗數(shù)和穗密度數(shù)據(jù)用于候選基因與穗型的相關(guān)性分析。上述材料均由作物遺傳與分子改良山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 生長(zhǎng)素含量測(cè)定

將樣本研磨后取50 mg 溶于1 mL 加有內(nèi)標(biāo)混合溶液的甲醇∶水∶甲酸 (15∶4∶1, v/v/v)提取劑, 離心取上清液濃縮, 再復(fù)溶于100 μL 80%甲醇中, 過濾后上樣, 利用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)系統(tǒng)檢測(cè)生長(zhǎng)素合成途徑中的 5 個(gè)化合物含量, 包括色氨酸 TRP、吲哚乙酸(Indole-3-acetic acid, IAA)、以及色胺途徑的色胺TRA、非色胺途徑的吲哚乙酰胺(Indole-3-acetamide, IAM)和吲哚已腈(Indole-3-acetonitrile, IAN)。設(shè)置3 個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

1.3 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序

利用Illumina 平臺(tái)對(duì)樣品進(jìn)行測(cè)序, 測(cè)序數(shù)據(jù)經(jīng)篩選后比對(duì)小麥品種中國春基因組參考序列(IWGSC_RefSeq_v1.1), 將比對(duì)上的reads 進(jìn)行組裝和定量。采用FPKM 值作為衡量基因表達(dá)水平的指標(biāo)。以|log2(FPKMSY/FPKMCH)|≥1 和 probability ≥0.8 為標(biāo)準(zhǔn)篩選差異表達(dá)基因(differentially expressed genes, DEGs), 相關(guān)結(jié)果用MeV 輸出?；诎龠~客云服務(wù)器工具(https://international.biocloud.net/)獲得DEGs 的功能注釋和GO 富集等信息。設(shè)置3 個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

1.4 qRT-PCR

使用RNA 提取試劑盒(北京天漠)提取樣品總RNA, 利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(大連寶生物)將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA。使用TB GreenTaqII 酶(大連寶生物)在QuantStudio 3 定量PCR儀(美國ABI)上完成qRT-PCR 反應(yīng), 內(nèi)參基因?yàn)樾←淎ctin,相關(guān)引物A1-q 和A2-q 列于表1。每個(gè)反應(yīng)重復(fù)3 次, 所得結(jié)果采用2–ΔΔCT法進(jìn)行分析。設(shè)置5 個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

表1 TaARF23 相關(guān)引物Table 1 Primers related TaARF23

1.5 標(biāo)記開發(fā)

采用CTAB 法提取SY95-71、CH7034 及其RILs 群體葉片的基因組DNA。利用Taq酶(大連寶生物)以及引物P1 和P2 擴(kuò)增親本中的候選基因, 將PCR 產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳后挖膠測(cè)序。根據(jù)基因在 SY95-71 和CH7034 中的序列差異開發(fā)分子標(biāo)記擴(kuò)增RILs 群體DNA,產(chǎn)物用8%非變性聚丙烯酰胺凝膠(Acr∶Bis=29∶1)電泳檢測(cè)、硝酸銀染色, 記錄標(biāo)記型。

1.6 關(guān)聯(lián)分析

RILs 群體的每個(gè)家系種植1 行, 行長(zhǎng)2 m, 共種植15株。待植株成熟后每行隨機(jī)選擇5 株, 鑒定主穗最底部小穗至最頂部小穗的距離(不含芒長(zhǎng))計(jì)為穗長(zhǎng)、主穗所有小穗數(shù)目計(jì)為小穗數(shù), 將小穗數(shù)除以穗長(zhǎng)獲得穗密度。利用t檢驗(yàn)對(duì)RILs 群體穗部表型和候選基因標(biāo)記型之間的相關(guān)性進(jìn)行分析, 設(shè)P<0.05 為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 SY95-71 和CH7034 幼穗中生長(zhǎng)素含量差異顯著

SY95-71 與CH7034 具有不同的穗型, 前者為長(zhǎng)芒、紡錘型穗, 后者為無芒、圓形密穗(圖1)。對(duì)2 份材料幼穗中的生長(zhǎng)素含量進(jìn)行測(cè)定, 結(jié)果顯示, 吲哚乙酸IAA 和底物色氨酸TRP 的含量沒有顯著差異; 非色胺途徑中的吲哚乙酰胺IAM 和吲哚已腈IAN 在幼穗中含量較低, 也沒有顯著差異; 色胺途徑中的關(guān)鍵物質(zhì)色胺 TRA 在SY95-71 幼穗中含量為98.58 ng g–1, 極顯著高于CH7034中的18.63 ng g–1(P=0.001, 圖2)。據(jù)此推測(cè), 色胺途徑可能是SY95-71 與CH7034 幼穗中生長(zhǎng)素合成的主要來源;由于TRA 是IAA 的前體, 其在幼穗中的含量差異可能是造成兩者不同穗型的原因之一。

圖1 小麥品系SY95-71 和CH7034 的穗型Fig.1 Spike morphology of wheat lines SY95-71 and CH7034

圖2 生長(zhǎng)素合成通路中5 個(gè)化合物在SY95-71 和CH7034 幼穗間的含量比較Fig.2 Comparison of the content of five compounds in the auxin synthesis pathway between young spikes of SY95-71 and CH7034

2.2 生長(zhǎng)素相關(guān)GO 富集分析

對(duì)SY95-71 和CH7034 幼穗中的DEGs 進(jìn)行GO 富集,從中篩選生長(zhǎng)素相關(guān)條目。結(jié)果顯示(圖3), 在SY95-71中高表達(dá)的DEGs 被富集到14 個(gè)生長(zhǎng)素相關(guān)條目, 其中生物進(jìn)程類(biological process, BP) 11 個(gè)、分子功能類(molecular function, MF) 3 個(gè); 在CH7034 中高表達(dá)的DEGs 被富集到12 個(gè)生長(zhǎng)素相關(guān)條目, 其中BP 類8 個(gè)、MF 類4 個(gè)。

圖3 SY95-71 和CH7034 幼穗中生長(zhǎng)素通路相關(guān)的GO 富集Fig.3 GO enrichment related to auxin pathway in young spike of SY95-71 and CH7034

在高置信區(qū)間(P<0.01)范圍內(nèi), 只有SY95-71 中富集到5 個(gè)生長(zhǎng)素相關(guān)條目, 即 BP 類別中的吲哚乙酸代謝(indoleacetic acid metabolic process, GO:0009683)、吲哚乙酸生物合成(indoleacetic acid biosynthetic process, GO:0009684)和生長(zhǎng)素生物合成(auxin biosynthetic process, GO:0009851),以及MF 類別中的吲哚乙酰胺水解酶活性(indoleacetamide hydrolase activity, GO:0043864)和吲哚-3-甘油-磷酸合酶活性(indole-3-glycerol-phosphate synthase activity, GO:0004425)。除了GO:0004425 以外, 其余4 個(gè)條目均是SY95-71 中富集到的特有條目, 猜測(cè)這些特有條目可能與SY95-71 幼穗中較高的TRA 含量有關(guān)。

2.3 SY95-71 幼穗中的生長(zhǎng)素通路DEGs

我們從SY95-71 幼穗轉(zhuǎn)錄水平顯著高于CH7034 的DEGs 中篩選了與生長(zhǎng)素生物合成和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的5 類基因(圖4), 分別是TDC(TryptophanDecarboxylase)、ARF、Aux/IAA(Auxin/IndoleAceticAcid)、SAUR(Small AuxinUpRNA)和GH3(Gretchen-Hagen3)。其中,TDC編碼色氨酸脫羧酶, 負(fù)責(zé)將色氨酸TRP 轉(zhuǎn)化為色胺TRA;ARF編碼生長(zhǎng)素響應(yīng)因子, 可調(diào)控下游原初響應(yīng)基因Aux/IAA、SAUR和GH3的表達(dá)水平。與CH7034 相比, 上述DEGs 在SY95-71 中極顯著高表達(dá)的有1 個(gè)TDC基因(TraesCS4A02G43150)、2 個(gè)ARF基因(TraesCS7A02 G475700、TraesCS7A02G475600)和 3 個(gè)SAUR基因(TraesCS7D02G456500、TraesCS7D02G456400、TraesCS7 A02G468700)。

圖4 SY95-71 幼穗中生長(zhǎng)素通路相關(guān)DEGsFig.4 DEGs related to auxin pathway in young spike of SY95-71

2.4 TaARF23-A 的qRT-PCR 驗(yàn)證

ARF 既是生長(zhǎng)素的響應(yīng)因子, 又能在信號(hào)傳導(dǎo)路徑中作為轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控下游基因網(wǎng)絡(luò)。因此, 我們進(jìn)一步分析了在SY95-71 幼穗中轉(zhuǎn)錄水平最高的2 個(gè)ARF基因。在中國春參考基因組中,TraesCS7A02G475600和TraesCS7A02G475700是位于7A 染色體長(zhǎng)臂上同一位點(diǎn)的一對(duì)串聯(lián)重復(fù)基因(圖5-a), 根據(jù)小麥ARF 家族成員編號(hào)[14], 將其分別命名為TaARF23-A1和TaARF23-A2。

圖5 TaARF23-A 分析Fig.5 Analysis of TaARF23-A

TaARF23-A1和TaARF23-A2在啟動(dòng)子區(qū)、外顯子和內(nèi)含子的序列完全相同, 但具有不同的轉(zhuǎn)錄本。與TaARF23-A1相比,TaARF23-A2的第1 個(gè)外顯子在剪切過程中缺少了9 bp, 據(jù)此開發(fā)特異定量引物A1q 和A2q (圖5-a)。qRT-PCR 結(jié)果表明, SY95-71 幼穗中TaARF23-A1和TaARF23-A2的表達(dá)量極顯著高于CH7034 (圖5-b～c), 與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果一致。

2.5 TaARF23-A 與穗部表型的關(guān)聯(lián)分析

基于中國春參考基因組, 我們?cè)O(shè)計(jì)了2 對(duì)引物P1 和P2 來擴(kuò)增CH7034 和 SY95-71 中TaARF23-A基因組序列。測(cè)序結(jié)果顯示, P1 和P2 的擴(kuò)增產(chǎn)物均沒有雜峰(圖5-d),表明在 CH7034 或者 SY95-71 中,TaARF23-A1和TaARF23-A2也具有完全相同的基因組序列。

通過比對(duì)CH7034 和 SY95-71 中的TaARF23-A序列,在第一個(gè)外顯子中鑒定到3 個(gè)多態(tài)性位點(diǎn), 包括2 個(gè)SNP和1 個(gè)InDel (圖5-a)。在InDel 位點(diǎn), CH7034 具有12 bp的序列插入, SY95-71 中則缺失。據(jù)此開發(fā)了InDel 標(biāo)記,該標(biāo)記在CH7034 和SY95-71 中分別擴(kuò)增出82 bp 和70 bp的條帶(圖5-e)。

利用InDel 標(biāo)記鑒定CH7034 和SY95-71 的RILs 群體獲得標(biāo)記型, 將其與群體穗部表型進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析, 結(jié)果顯示(圖6), 除了1 個(gè)環(huán)境(15L)以外, 該InDel 標(biāo)記在其余5 個(gè)環(huán)境下與群體穗密度表型顯著相關(guān)(P<0.05), 在所有環(huán)境數(shù)據(jù)平均值下呈極顯著相關(guān)(P=5.57E-07); 進(jìn)一步分析穗密度表型的2 個(gè)組分(穗長(zhǎng)和小穗數(shù)), 發(fā)現(xiàn)InDel 標(biāo)記與群體穗長(zhǎng)不相關(guān)(P>0.05), 而與每穗小穗數(shù)呈極顯著相關(guān)(P<0.0001), 表明TaARF23-A與小穗數(shù)相關(guān)。

圖6 RILs 群體中InDel 標(biāo)記型與6 個(gè)環(huán)境下穗部表型的相關(guān)性分析Fig.6 Correlation analysis between genotypes of InDel marker and phenotypes of spike in RILs population under six environments

3 討論

3.1 小麥穗型受生長(zhǎng)素通路調(diào)控

生長(zhǎng)素是調(diào)控小麥小穗發(fā)育的重要激素之一[1]。在本研究中, SY95-71 和CH7034 幼穗中的生長(zhǎng)素主要由色胺途徑合成, 并在SY95-71 中富集到了特有的、與生長(zhǎng)素合成和代謝相關(guān)的高置信 GO 條目。與 CH7034 相比,SY95-71 幼穗中的色氨酸脫羧酶基因TDC具有更高的轉(zhuǎn)錄水平, 可將底物色氨酸轉(zhuǎn)化為更高含量的色胺, 進(jìn)而合成生長(zhǎng)素。之后, 生長(zhǎng)素通過TIR1/AFB 途徑[15]激活A(yù)RF,后者進(jìn)一步調(diào)控原初響應(yīng)基因Aux/IAA、SAUR和GH3的表達(dá), 最終形成與CH7034 不同的穗型。然而, 吲哚乙酸IAA 在SY95-71 和CH7034 幼穗中沒有顯著差異, 這可能是由于幼穗是合成生長(zhǎng)素的主要器官, 對(duì)IAA 濃度極為敏感, 過多的IAA 通常會(huì)被向下運(yùn)輸?shù)狡渌M織部位, 防止其對(duì)幼穗生長(zhǎng)發(fā)育造成抑制, 并使植株保持一定程度的頂端優(yōu)勢(shì)[16-17]。另外, 信號(hào)傳導(dǎo)通路也會(huì)對(duì)高濃度IAA產(chǎn)生負(fù)反饋機(jī)制, 如GH3編碼的酰基酰胺合成酶可催化IAA 與氨基酸結(jié)合而失活, 從而動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)IAA 的含量[18]。因此, 幼穗中生長(zhǎng)素含量差異可能會(huì)以其前體色胺的形式來體現(xiàn), 這個(gè)現(xiàn)象在一些研究中已有報(bào)道[19]。

3.2 TaARF23-A 與小穗數(shù)相關(guān)

通過穗型調(diào)控小穗數(shù)是優(yōu)化小麥產(chǎn)量的重要策略[20-21]。迄今已有多個(gè)小穗數(shù)基因被報(bào)道, 如WFZP[22]、WAPO1[23]、FT-D1[24]、TaCOL-B5[25]和TaNAC67[26]等。本研究鑒定出1 個(gè)與小穗數(shù)極顯著相關(guān)的生長(zhǎng)素響應(yīng)因子基因TaARF23-A。該基因包含2 個(gè)相鄰的串聯(lián)重復(fù)A1 和A2, 兩者具有完全相同的基因組序列, 但轉(zhuǎn)錄本不同, A1和A2 的表達(dá)量在不同穗型間均差異顯著。在小麥中, 某些基因經(jīng)歷串聯(lián)重復(fù)事件后拷貝數(shù)增加, 對(duì)表型的調(diào)控能力會(huì)增強(qiáng)。如Rht-D1b經(jīng)串聯(lián)重復(fù)后獲得2 個(gè)拷貝, 其降稈效應(yīng)是單個(gè)拷貝的3 倍[27];TaCYP81D具有5 個(gè)串聯(lián)拷貝, 該位點(diǎn)使植株對(duì)鹽脅迫的耐受性增強(qiáng)[28]。因此,TaARF23-A1和TaARF23-A2的編碼產(chǎn)物可能都參與了對(duì)小穗數(shù)的調(diào)控。

此外,TaARF23-A的外顯子在SY95-71 和CH7034 間存在序列多態(tài)性, 根據(jù)InDel 位點(diǎn)開發(fā)了分子標(biāo)記。在6個(gè)大田環(huán)境條件下,TaARF23-A的CH7034 型等位變異的小穗數(shù)為22.59, 比SY95-71 型等位變異(20.92)增加了1.67 個(gè)(P=2.12E-25)。該標(biāo)記可用于育種工作中的種質(zhì)篩選或分子輔助選擇。

3.3 TaARF23-A 可能的調(diào)控機(jī)制

本研究中,TaARF23-A在SY95-71 中比CH7034 具有更高的表達(dá)水平, 但SY95-71 型等位變異對(duì)應(yīng)的小穗數(shù)卻較低, 可能的調(diào)控機(jī)制有2 個(gè)。一是TaARF23-A 為正向調(diào)控因子, 誘導(dǎo)了Aux/IAA 等抑制子的表達(dá), 造成對(duì)小穗數(shù)的負(fù)調(diào)控, 例如啟動(dòng)子區(qū)包含ARF 結(jié)合元件AuxRE的TaIAA-3A(TraesCS3A02G108400)可能為抑制子(圖7-a)。類似于 TaARF25-TaIAA21 模型, TaARF25 誘導(dǎo)TaIAA21表達(dá), 但TaIAA21 負(fù)調(diào)控粒徑和粒重[29]。二是TaARF23-A 為負(fù)向調(diào)控因子, 抑制了SAUR等基因的表達(dá)(圖7-b)。SAUR 是生長(zhǎng)素調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)的主要效應(yīng)因子,saur19突變體的根部分生組織減少、側(cè)根數(shù)目減少[30], 因此猜測(cè)穗部SAUR基因受抑制后也可能會(huì)造成小穗數(shù)目減少。通常認(rèn)為當(dāng)ARF 中間區(qū)域(middle region)的谷氨酰胺Q-絲氨酸S-亮氨酸L 含量較高時(shí), ARF 激活靶基因; 當(dāng)MR 的絲氨酸S-脯氨酸P-甘氨酸G 含量較高時(shí), ARF 抑制靶基因[31]。TaARF23-A 的MR 區(qū)域(240～321 氨基酸)包含QSL 個(gè)數(shù)為18, SPG 個(gè)數(shù)為14, 其為正向調(diào)控因子的可能性較大。然而最新研究表明, ARF 對(duì)靶基因具有雙重功能,在不同生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期表現(xiàn)出特定的激活或抑制作用[32]。此外,TaARF23-A外顯子中的3 處序列多態(tài)性造成的蛋白水平變異, 也可能對(duì)其功能產(chǎn)生影響。這些需要后續(xù)大量試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。

圖7 TaARF23-A 的預(yù)測(cè)靶基因Fig.7 Predictive target genes for TaARF23-A

致謝: 電子科技大學(xué)楊足君教授、四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院楊恩年研究員和山西農(nóng)業(yè)大學(xué)鄭軍研究員在群體構(gòu)建、大田種植以及表型鑒定方面給予了大力支持, 謹(jǐn)致謝忱！