聶曉玉 李 真 王天堯 周元委 徐正華 王 晶 汪 波蒯 婕,* 周廣生

1 華中農(nóng)業(yè)大學植物科學技術(shù)學院 / 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部長江中游作物生理生態(tài)與耕作重點實驗室, 湖北武漢 430070; 2 荊州農(nóng)業(yè)科學院, 湖北荊州 434000; 3 宜昌市農(nóng)業(yè)科學研究院, 湖北宜昌 420500

菜籽油是世界上使用量僅次于大豆油的食用性植物油, 也是我國主要的食用植物油之一[1-2]。我國油菜種植區(qū)域面積廣泛分布于西南及長江流域地區(qū),其中長江流域冬油菜面積占全國90%[3]。據(jù)統(tǒng)計,該產(chǎn)區(qū)太陽輻射每十年下降1.4%～2.7%[4], 油菜生長期內(nèi)連續(xù)陰雨、光照不足的天氣時常發(fā)生。遮陰下, 油菜種子數(shù)量及重量減少而減產(chǎn)[5]。油菜開花前后遮陰影響生殖器官的發(fā)育、碳水化合物累積與轉(zhuǎn)運和籽粒脂質(zhì)代謝, 從而導致籽粒含油量降低, 蛋白質(zhì)含量增加[6], 角果期遮陰導致籽粒含油量下降達到44.2%[7-8]?？梢? 光照不足已成為限制長江流域產(chǎn)區(qū)油菜產(chǎn)量和品質(zhì)的主要環(huán)境因子。

前人圍繞弱光下作物的光合作用、物質(zhì)積累、產(chǎn)量品質(zhì)做了大量研究。一般認為, 弱光提高了淀粉類種子蛋白質(zhì)含量, 減少了脂肪含量[9-11]。然而,弱光對油料種子成分的影響更加復雜。有研究表明弱光降低了大豆[12]和蓖麻[13]種子的含油量, 且影響大小隨遮陰水平[14]或植株部位不同[15]而變化; 也有研究表明弱光降低了大豆產(chǎn)量, 但不影響種子蛋白質(zhì)或粗脂肪含量[16]。遮陰改變了田間微環(huán)境, 影響了植株的光合進而影響產(chǎn)量形成[17], 而籽粒成分受源庫關系的影響[12]。葉片(源)的光合作用產(chǎn)物以可溶性糖的形式輸送到果實、種子和根(庫)[18]; 可溶性糖通過一系列的生理和生化過程轉(zhuǎn)化為淀粉、蛋白質(zhì)和脂肪, 并儲存在庫中, 源強庫小有利于粗脂肪的積累。研究表明, 輕度遮陰延遲了油用牡丹‘鳳丹’葉片衰老, 增加了光合產(chǎn)量, 通過增加種子重量提高了種子產(chǎn)量, 提高種子發(fā)育緩慢生長期和成熟期脂肪酸去飽和酶基因的表達促進不飽和脂肪酸含量累積而改善品質(zhì)[14,19], 而中度或重度遮光由于光照強度不足, 其光合速率遠低于正常光照下的光合速率, 導致光合產(chǎn)量和種子產(chǎn)量降低[14]。水稻中, 籽粒灌漿前期遮陰不僅減少了葉片光合產(chǎn)物形成, 也抑制了源庫器官中的蔗糖轉(zhuǎn)運蛋白基因表達, 引起籽粒產(chǎn)量和品質(zhì)的下降[20]; 棉花中, 遮陰則降低了葉綠素含量、凈光合速率、棉花葉片的蔗糖合成酶和蔗糖磷酸合成酶的活性和基因表達也下降, 導致蔗糖含量和蔗糖轉(zhuǎn)化率降低。而且在遮陰的棉葉中觀察到較少的淀粉、蔗糖、葡萄糖和果糖含量, 不利于產(chǎn)量和品質(zhì)的形成[21-22]。在實際生產(chǎn)中, 為了提高弱光脅迫下作物產(chǎn)量、改善品質(zhì), 前人圍繞施肥等開展了研究, 明確了光照和施肥、種植密度間對作物光合作用存在互作效應[23-25]。遮陰下, 低氮處理下早熟禾植株體內(nèi)光合產(chǎn)物碳代謝較強, 碳水化合物含量較高; 施氮量增加, 光合產(chǎn)物向氮素代謝轉(zhuǎn)運增多, 碳代謝減弱, 糖含量降低[26]。小麥遮陰下, 適當增加施氮量, 可有效增源擴庫, 促進同化物的運輸, 導致籽粒淀粉含量顯著下降, 蛋白質(zhì)含量顯著增加, 影響籽粒品質(zhì)[27]。遮陰下, 種植密度過高, 小麥和玉米葉片的葉綠素含量和凈光合速率均顯著降低[28-29]。

目前, 前人的研究大多集中在弱光脅迫和栽培方式對淀粉類種子生長和產(chǎn)量的影響, 關于種植密度與光照互作對油菜籽粒含油量和油脂累積的研究報道不多見。前期研究表明, 直播油菜密度由傳統(tǒng)的低于15 萬株 hm–2增加至45 萬株 hm–2時, 具有“以密增產(chǎn)、以密補遲、以密省肥、以密控草、以密適機”的效果, 但尚缺乏籽粒品質(zhì), 特別是含油量的相關研究[30]?；诖? 本試驗模擬光照不足的環(huán)境條件, 在油菜角果期進行遮陰處理, 研究種植密度對弱光條件下油菜籽粒含油量的影響, 從籽粒碳、油脂代謝角度, 明確油菜角果期遮陰條件下影響含油量的關鍵過程, 初步闡明種植密度調(diào)控角果期遮陰條件下籽粒含油量、產(chǎn)油量形成機理, 研究結(jié)果為光照不足地區(qū)油菜耐陰品種的選育和栽培技術(shù)的優(yōu)化提供了理論依據(jù)和技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況

試驗于2018—2020 年在華中農(nóng)業(yè)大學(湖北省武漢市, 地理位置: 30.52°N, 114.31°E, 海拔23.3 m,亞熱帶季風性濕潤氣候)試驗田內(nèi)進行。2018 年土壤養(yǎng)分狀況為全氮1.43 g kg–1、堿解氮119.63 mg kg–1、速效磷18.35 mg kg–1、速效鉀168.65 mg kg–1;2019 年土壤養(yǎng)分狀況為全氮 1.3 g kg–1、堿解氮102.79 mg kg–1、速效磷 20.11 mg kg–1、速效鉀188.16 mg kg–1。

1.2 試驗設計

選用華油雜62 和灃油520 為材料, 進行大田裂區(qū)試驗。2 個品種為主區(qū), 3 個種植密度水平[15×104株 hm–2(D1)、30×104株 hm–2(D2)、45×104株 hm–2(D3)]為裂區(qū), 2 個光照強度[自然光照處理(LT-100%)、遮光30%處理(LT-70%)]為裂裂區(qū)。油菜群體中50%植株主花序開花時, 在每個小區(qū)選取長勢一致的植株, 對其主花序當日所開相同部位的花進行掛牌標記, 使用3 層白色60 目遮陰網(wǎng)在10～35 DAF (days after flowering, DAF)遮光, 高度為2.5 m,北側(cè)開放, 方便空氣流通; 3 次重復, 共36 個小區(qū)。氮、磷、鉀、硼肥分別為尿素(含N 46%)、過磷酸鈣(含P2O512%)、硫酸鉀(含K2O 52%)和硼砂(含B 10.6%)。N 用量為240 kg hm–2, P2O5、K2O 用量均為150 kg hm–2, 硼砂用量11.25 kg hm–2。2018 年、2019年分別在9 月30 日、10 月2 日播種, 分別在次年5月12 日、5 月1 日收獲。采用直播方式播種, 行距設定為25 cm。出苗后去窩堆苗, 三葉期至五葉期定苗,小區(qū)面積為20 m2(2 m×10 m)。其他同常規(guī)管理。

1.3 測定項目與方法

1.3.1 千粒重、單株產(chǎn)量和群體產(chǎn)量 油菜80%左右角果皮呈淡黃色, 籽粒變褐時, 收獲并測定小區(qū)產(chǎn)量, 同時調(diào)查收獲株數(shù), 計算單株產(chǎn)量和群體產(chǎn)量; 千粒重采用自動考種分析儀(SC-G 型, 杭州萬深檢測科技有限公司, 中國杭州)進行測定。

1.3.2 籽粒碳代謝相關生理指標 分別于 25 DAF (遮陰15 d)、35 DAF (遮陰25 d), 在上午09:00—12:00 取各個小區(qū)掛牌標記的角果30 個, 室內(nèi)冰浴(4℃)條件下迅速將角果皮和籽粒分開。籽粒經(jīng)液氮固定后置-80℃超低溫冰箱保存, 用于以下生理生化指標測定。

(1) 葉綠素含量 稱取0.2 g 左右籽粒鮮樣置于研缽內(nèi), 向研缽內(nèi)滴入95%的乙醇后, 將籽粒研磨至勻漿狀并迅速轉(zhuǎn)移至15 mL 離心管中, 向離心管中加入10 mL 95%乙醇密封, 在黑暗條件下, 室溫提取18～24 h, 提取完成后搖勻, 在4000 轉(zhuǎn) min–1的轉(zhuǎn)速下離心5 min, 取上清液, 采用分光光度法測定葉綠素含量[31]。

(2) 蔗糖、果糖、葡萄糖含量 稱取0.1 g 左右鮮樣, 放入15 mL 離心管中, 以80%的乙醇作為提取液, 在 80℃水浴條件下提取 40 min 后, 于4000×g離心5 min 后取上清液, 以上提取步驟重復2 次, 并以80%的乙醇定容至25 mL。加入0.2 g 活性炭進行脫色, 離心取上清液。具體參考Hendrix(1993)方法測定蔗糖、果糖、葡萄糖含量[32]。

(3) 淀粉含量 80%乙醇提取后的沉淀即可視為淀粉和纖維素的混合物, 因而將淀粉經(jīng)過糊化反應裂解為單糖的含量換算成淀粉含量。具體過程如下: 乙醇提取殘留物在冰浴和避光條件下加入2 mL 濃度為9.6 N 的高氯酸, 15 min 后離心得到上清液, 殘留物質(zhì)加入2 mL 濃度為4.8 N 的高氯酸, 合并上清液即為淀粉裂解為單糖的提取液, 提取液稀釋至25 mL。采用蒽酮法測定淀粉含量[33]。

(4) 碳水化合物代謝關鍵酶活性 采用酶聯(lián)免疫法測定SuSy、SPS、Rubisco、G6PDH、PPase活性, 試劑盒購于上海晶抗生物工程有限公司(中國,上海)。稱取0.10 g 研磨好的籽粒鮮樣, 使用1 mL提取液, 進行冰浴勻漿, 離心取上清, 根據(jù)制造商提供的說明書進行酶反應。SuSy、SPS、Rubisco、G6PDH、PPase 分別在A480、A480、A700、A450、A700 記錄吸收值。

1.3.3 籽粒含油量 油菜籽粒含油量測定參照農(nóng)業(yè)農(nóng)村部行業(yè)標準《油料種籽含量的測定: 殘余法》進行。將半徑為6 cm 濾紙折成油包, 編號后105℃烘干稱重, 記m1; 取約1 g 的籽粒放入油包后包好,105℃烘干稱重, 記m2; 將油包放入索氏抽提器抽提8 h, 取出晾干, 105℃烘干稱重, 記m3。

1.4 數(shù)據(jù)處理

利用Microsoft Excel 2016 軟件進行數(shù)據(jù)處理,SPSS 18.0 軟件統(tǒng)計分析, 最小顯著法(LSD)檢驗試驗數(shù)據(jù)的差異顯著性水平(P<0.05), 采用Origin 9.0軟件制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 千粒重及產(chǎn)量

種植密度增加和角果期遮陰, 均導致兩品種千粒重、單株產(chǎn)量降低, 群體產(chǎn)量則隨密度增加而增加, 隨光照強度減弱而降低。方差分析表明, 品種、遮陰、種植密度對單株產(chǎn)量和產(chǎn)量的影響均達到顯著水平, 種植密度和遮陰對單株產(chǎn)量的互作效應達到顯著水平。隨種植密度增加, 遮陰導致產(chǎn)量降幅逐漸降低。種植密度為D1、D2、D3 時, 遮陰導致華油雜 62 單株產(chǎn)量降幅分別為 31.5%～36.5%、26.5%～30.5%、24.3%～25.6%, 產(chǎn)量降幅分別為31.6%～34.3%、25.0%～28.7%、23.7%～23.8%; 灃油520 的單株產(chǎn)量降幅分別為 31.5%～31.7%、22.0%～22.8%、21.2%～21.5%, 產(chǎn)量降幅分別為27.7%～30.7%、23.8%～23.9%、21.2%～23.1% (表1)。

表1 種植密度對遮陰下油菜千粒重及產(chǎn)量的影響Table 1 Effects of planting density and shading on 1000-seed weight and yield of directly seeding rapeseed

2.2 籽粒碳代謝

2.2.1 葉綠素含量 華油雜62 籽粒葉綠素含量高于灃油520。方差分析可得, 種植密度和遮陰對籽葉綠素含量和葉綠素a/b值的影響均達顯著水平,花后35 d 時互作效應達顯著水平。種植密度增加、角果期遮陰下, 籽粒葉綠素含量和葉綠素a/b值均下降。在2019—2020 年度, 與對照相比, 種植密度為D1、D2、D3 時, 遮陰導致花后35 d 華油雜62籽粒葉綠素含量降幅分別為11.8%～17.1%、9.8%～12.9%、3.3%～4.0%; 灃油520 籽粒葉綠素含量降幅分別為16.1%～19.4%、13.8%～26.9%、8.0%～17.4%(圖1)。

圖1 種植密度對角果期遮陰油菜籽粒葉綠素含量和葉綠素a/b 的影響Fig.1 Effect of planting density and pod shading on seed chlorophyll content and chlorophyll a/b ratio of directly seeding rapeseed

2.2.2 碳代謝相關酶活性 華油雜62 籽粒的Rubisco、SPS 和SuSy 活性均高于灃油520。種植密度增加, 花后25、35 d 籽粒的Rubisco 活性降低。方差分析可得, 種植密度和遮陰對籽粒的Rubisco、SPS、SuSy 活性的影響達到顯著水平, 且在花后35 d時互作效應達到顯著水平。在35DAF 時, 種植密度為15×104、30×104、45×104株 hm-2, 與對照相比, 遮陰導致華油雜62 籽粒的Rubisco 活性下降幅度分別為12.2%～15.2%、9.3%～10.6%、5.6%～8.1%, SPS 活性下降幅度分別為 15.2%～25.1%、9.0%～25.0%、6.5%～19.3%, SuSy 活性下降幅度分別為 12.1%～31.7%、11.2%～29.7%、5.3%～22.8%。而灃油520 籽粒 Rubisco 活性下降幅度分別為 13.8%～17.7%、9.8%～11.4%、4.8%～7.0%, SPS 活性下降幅度分別為17.8%～25.9%、14.8%～28.3%、5.1%～22.7%, SuSy 活性下降幅度分別為16.0%～30.5%、15.3%～25.4%、8.9%～17.6% (圖2)。

圖2 種植密度對角果期遮陰油菜籽粒Rubisco、SPS 和SuSy 活性的影響Fig.2 Effect of planting density and pod shading on seed Rubisco activity of directly seeding rapeseed

圖3 種植密度對角果期遮陰油菜籽粒碳水化合物含量的影響Fig.3 Effect of planting density and pod shading on seed carbohydrates content of directly seeding rapeseed

2.3 籽粒脂質(zhì)代謝

2.3.1 含油量和產(chǎn)油量 種植密度增加和角果期遮陰, 均導致兩品種籽粒含油量下降, 產(chǎn)油量則隨密度增加而增加, 隨光照強度減弱而降低。方差分析表明, 品種、種植密度和遮陰對2 個時期籽粒含油量、產(chǎn)油量的影響達到顯著水平, 花后35 d 種植密度和遮陰對含油量的互作效應達到顯著水平。在35DAF時種植密度為15×104、30×104、45×104株 hm–2,遮陰引起的華油雜 62 籽粒含油量降幅分別為4.9%～6.0%、5.6%～7.9%、9.7%～11.8%, 產(chǎn)油量降幅分別為34.7%～35.3%、32.6%～32.8%、27.0%～28.6%;灃油520 籽粒含油量降幅分別為4.1%～5.3%、2.1%～9.1%、6.6%～10.4%, 產(chǎn)油量降幅分別為33.8%～34.5%、29.2%～30.8%、27.9%～30.4% (圖4)。

圖4 種植密度對角果期遮陰油菜籽粒含油量和油脂產(chǎn)量的影響Fig.4 Effect of planting density and pod shading on seed oil and oil yield of directly seeding rapeseed

3 討論

弱光脅迫是影響油菜生長和產(chǎn)量的主要非生物脅迫[7], 光合作用下降是弱光下作物生長受限、產(chǎn)量下降的主要原因[25,34]。角果(角果皮和籽粒)是油菜花后重要的光合器官[35], 擬南芥中角果皮的衰老和葉綠素的分解先于種子發(fā)生, 籽粒維持光合作用的時間更長[36]。為了使籽粒能夠進行光合作用, 靠近角果室內(nèi)側(cè)具有厚壁細胞層, 具有輸送CO2的功能,發(fā)育中的種子能夠固定這些CO2, 并產(chǎn)生能量用于合成種子的儲存物質(zhì)[37-38], 可見弱光下籽粒碳代謝對穩(wěn)定其產(chǎn)量和品質(zhì)具有重要意義。葉綠體是光合作用的重要場所, 葉綠體中的葉綠素是光合作用催化劑, Rubisco 是控制光合作用碳代謝的關鍵酶, 均受種植密度和光照強度影響[39-40]。本研究結(jié)果表明,種植密度增加和遮陰均導致籽粒葉綠素含量、葉綠素a/b比值、Rubisco 活性逐漸降低, 光合產(chǎn)物葡萄糖含量降低; 種植密度增加引起棉花植株間蔭蔽程度增加, 植株下層葉片和角果等光合器官的光照輻射減少, 葉綠素合成能力減弱, 光合作用關鍵酶Rubisco活性降低, 是光合速率下降的重要原因[21]。遮陰后, 油菜角果皮葉綠素b和葉綠素總含量下降,葉綠素a/b值較小, Rubisco活性減少, 凈光合速率下降[40], 與本研究結(jié)果類似。油菜籽粒在弱光條件下有較低的葉綠素a/b, 使它們能夠捕獲更多的可用光線[37-38]。優(yōu)化綜合農(nóng)藝管理措施 (栽培方式、種植密度、施肥管理等)可以調(diào)整冠層結(jié)構(gòu), 增加光截獲,減少光損失[41]。光照和種植密度對光合作用存在互作效應。本試驗中隨密度增加, 遮陰后籽粒的葉綠素含量、葉綠素a/b比值、Rubisco活性下降幅度逐漸減少。而在玉米中, 高密度遮陰后植株的葉綠素含量、葉綠素a/b值下降顯著, 光合速率降低[29]。兩者結(jié)果不同原因可能是玉米中所采用的密度高于所用品種的適宜密度, 而本研究中采用的45萬株 hm–2的密度已證實是現(xiàn)有油菜品種密植增產(chǎn)的適宜密度[30],密植改善了角果期冠層結(jié)構(gòu); 另外, 前期高密度引起的田間蔭蔽也提高了油菜角果期耐陰性。

碳水化合物是角果皮和籽粒中的重要物質(zhì)和能量來源, 并對籽粒的油脂形成和積累有顯著影響[42-43]。蔗糖是光合作用的最終產(chǎn)物, 作為主要的轉(zhuǎn)運糖起作用, 植株體內(nèi)大部分蔗糖被蔗糖合成酶(Sucrose synthase, SuSy)分解為果糖和葡萄糖[44]。果糖和葡萄糖可直接參與糖酵解等代謝途徑, 并參與籽粒脂質(zhì)代謝[45-46]。角果期籽粒雖能通過自身的光合作用合成有機物供籽粒發(fā)育, 但前人研究表明十字花科作物中, 籽粒合成的淀粉難以解釋觀察到的最終油的含量, 需從其他器官中(角果皮、莖稈)轉(zhuǎn)運碳水化合物(如蔗糖和己糖)供給籽粒發(fā)育[47]。調(diào)控同化物運輸?shù)阶蚜Ｖ械哪芰υ綇娫嚼诋a(chǎn)量的形成[48], 其中SuSy 在同化物由角果皮向籽粒的轉(zhuǎn)運中具有重要意義[49], 在蔗糖代謝過程中影響庫強、具有調(diào)控蔗糖的輸入和籽粒代謝蔗糖的能力, 從而影響作物產(chǎn)量[50]。前人研究表明, 種植密度增加, 棉花葉片SuSy 和SPS 活性降低, 抑制碳代謝, 蔗糖、可溶性糖含量降低[15]; 而遮陰后, 棉花葉片SuSy 和SPS 活性基因表達和酶活性降低, 導致蔗糖、果糖含量降低[21-22]。本研究中, 種植密度增加或降低光照強度, 25DAF、35DAF 籽粒的SPS、SuSy 活性降低, 降低了蔗糖含量和蔗糖轉(zhuǎn)化率, 導致可溶性糖、蔗糖、果糖含量降低。隨密度增加, 遮陰引起的籽粒SPS、SuSy 活性下降幅度減少, 可溶性糖、蔗糖、果糖含量降幅也逐漸減少, 通過增加種植密度, 穩(wěn)定弱光下油菜籽粒發(fā)育、油脂合成的碳源和調(diào)節(jié)物質(zhì), 緩解了弱光脅迫下籽粒千粒重、單株產(chǎn)量和群體產(chǎn)量的下降。

6-磷酸葡萄糖脫氫酶(Glucose-6-phosphate dehydrogenase, G6PDH)控制NADPH 生成量, 是磷酸戊糖途徑中的關鍵酶, 磷脂酸磷酸酯酶(Phosphatidate phosphatase, PPase)是控制三酰甘油合成限制酶, 影響籽粒含油量[51]。弱光下油料類作物籽粒含油量下降[12-13,14-16], 但其機理鮮有報道。種植密度對籽粒品質(zhì)的影響結(jié)論不盡相同。適當增加種植密度, 含油量增加; 同時導致籽粒蛋白質(zhì)含量降低[52-53]; 但也有研究表明, 種植密度增加, 油菜籽粒含油量減少,蛋白質(zhì)含量顯著增加[54]。密度增加, 油菜籽粒PPase活性上升提高了籽粒含油量[53]。本試驗研究表明,同一光照強度下, 種植密度增加, 籽粒的PPase 和G6PDH 活性減少, 抑制籽粒的脂質(zhì)代謝, 導致含油量降低, 與黃秀芳等[54]結(jié)果一致; 且增加密度加劇了弱光對籽粒的脂質(zhì)代謝的抑制作用, 導致籽粒含油量進一步降低, 但油脂產(chǎn)量因群體產(chǎn)量的增加而增加。方差分析表明, 種植密度和遮陰對籽粒油脂累積關鍵生理指標在花后35 d 時互作效應達到顯著水平。因此遮陰下, 通過高密度種植促進了籽粒碳代謝, 有效緩解了油菜籽粒產(chǎn)量和油脂產(chǎn)量的下降,且花后35 d 是關鍵調(diào)控時期。在油菜生產(chǎn)中, 適當?shù)脑黾臃N植密度可顯著提高油菜的群體產(chǎn)量從而緩解弱光脅迫下(光照不足地區(qū))產(chǎn)油量的損失。本試驗主要從影響籽粒光合作用、碳代謝和油脂代謝的關鍵物質(zhì)和關鍵酶活性方面, 初步闡明種植密度對角果期遮陰條件下籽粒含油量和產(chǎn)油量的影響, 但在角果期, 角果皮是另一重要的光合器官, 其光合特性對籽粒生長發(fā)育影響較大, 因此種植密度對遮陰條件下角果皮形態(tài)和光合特性的影響有待進一步深入研究。

4 結(jié)論

增加種植密度可以緩解油菜角果期遮陰籽粒Rubisco 和SuSy 活性以及果糖和葡萄糖含量的下降,穩(wěn)定種子碳水化合物的積累, 但加劇了種子G6PDH和PPase 活性的下降, 導致種子含油量進一步下降。然而, 由于群體產(chǎn)量的增加, 產(chǎn)油量的下降隨著密度的增加而緩解, 與花后25 d 相比, 花后35 d 是密度和遮光相互作用下影響種子發(fā)育的關鍵時期。