李 萬 李 成 程 敏 吳 芳

1 商洛學院生物醫(yī)藥與食品工程學院, 陜西商洛 726000; 2 西安潤壯稼農(nóng)業(yè)科技有限公司, 陜西西安 710003; 3 商洛學院科技處, 陜西商洛 726000; 4 商洛學院國內(nèi)合作與校友工作處, 陜西商洛 726000

磷元素(Pi)是植物不易獲取的、天然土壤中稀有的營養(yǎng)元素之一[1]。研究表明, 植物體內(nèi)的分解作用、呼吸作用、光合作用、物質運輸和信號轉導等理化反應都離不開磷元素的參與, 其對植物的生長發(fā)育、產(chǎn)量、品質和抗逆性具有重要影響[2]。植物對磷元素的獲取主要通過磷轉運蛋白(phosphate transporters)實現(xiàn), 磷轉運蛋白能夠通過增強植物對磷素營養(yǎng)的吸收和轉運, 為植物提供充足磷元素, 從而促進植物的生長發(fā)育, 提高產(chǎn)量、品質和抗逆性。

磷轉運蛋白包括6 類: PHT1、PHT2、PHT3、PHT4、PHT5 和PHO1[3], PHT1 亞家族是高親和力轉運蛋白。擬南芥PHT1 亞家族PHT1;1、PHT1;2、PHT1;6和PHT1;8等4 個基因的表達量降低會導致植物對磷的攝取和轉運能力下降[4-5]; 在磷元素缺乏時, 有5 個基因(PHT1;1、PHT1;4、PHT1;5、PHT1;8和PHT1;9)在根部的表達量上調[6]。缺磷或磷充足條件下, 水稻PHT1 亞家族基因OsPT8的沉默會降低其對磷元素的攝取和轉運, 降低結實率[7]。在水稻中過表達番茄PHT1 家族基因LePT1和LePT2, 在缺磷環(huán)境下, 水稻根系和葉肉細胞中LePT1和LePT2的表達量上調, 增強水稻對磷元素的吸收, 促進植株生長; 磷過量條件下, 過表達LePT1和LePT2會抑制水稻生長發(fā)育, 降低株高, 減少分蘗[8]。這些結果均表明PHT1 亞家族在根系統(tǒng)從土壤獲取磷過程中的關鍵作用。PHT2、PHT3 和PHT4 這3 個亞家族成員都是低親和力轉運蛋白[3]。PHT2 亞家族成員對磷元素在植物體內(nèi)的分配和光合作用有影響, 例如,在小麥中抑制PHT2 亞家族成員的表達, 能夠降低小麥葉片和葉綠體中的磷元素濃度, 且無論磷元素缺乏或充足, 該小麥植株都呈現(xiàn)出矮小、光合能力弱等表型[9]。大豆GmPHT2;1和GmPHT2;2基因具有響應低磷脅迫的能力, 在低磷脅迫下, 大豆GmPHT2;2的表達量顯著高于GmPHT2;1; 此外,GmPHT2;1可能還在響應低溫脅迫中發(fā)揮著一定的功能[10]。線粒體合成的ATP 進入其他細胞器時需要磷元素的協(xié)助, PHT3 亞家族則負責介導調控該部分磷元素的轉運[11]。過表達擬南芥PHT3 亞家族成員PHT3;3的植株對鹽脅迫更為敏感[12]。PHT4 亞家族對酵母中的磷元素轉運具有高度特異性, 同時也介導了植物細胞質和葉綠體、異養(yǎng)質體和高爾基體之間的磷元素的轉運[2-3]。在馬鈴薯中, 過表達PHT4亞家族基因StPHT4;2的轉基因植株, 其塊莖產(chǎn)量更高, 類胡蘿卜素含量也更高, 表明StPHT4;2 可能與馬鈴薯產(chǎn)量和品質相關[13]。PHT5 亞家族能夠增加植物耐低磷脅迫的能力[2-3]。在甘藍型油菜中, 基因BnPHT5;1a和BnPHT5;1b均影響油菜磷穩(wěn)態(tài), 但BnPHT5;1b適應磷波動能力顯著降低,BnPHT5;1a則與耐低磷脅迫能力密切相關[14]。PHO1 亞家族負責磷酸鹽的攝取和分配, 參與磷酸鹽饑餓狀態(tài)下的信號傳導[15-17]。過表達草莓 PHO1 亞家族基因FaPHO1;H9的擬南芥植株磷含量顯著高于野生型植株, 表明FaPHO1;H9在磷轉運中起作用[18]。Liu等[19]研究發(fā)現(xiàn), 馬鈴薯磷轉運蛋白PHO1 亞家族的StPHO1.1、StPHO1.2 和StPHO1.3 對磷元素的吸收和轉運, 以及馬鈴薯耐熱性具有重要作用。

馬鈴薯(SolanumtuberosumL.)是小麥、水稻和玉米之后的第四大糧食作物, 高溫易使馬鈴薯減產(chǎn)甚至絕收[20]。本研究以提高馬鈴薯耐熱性為出發(fā)點,利用農(nóng)桿菌介導, 在馬鈴薯中過表達基因StPHO1.2,比較轉基因株系和野生型株系在高溫脅迫下的生長差異, 闡明StPHO1.2 對馬鈴薯生長和耐熱性的影響;利用酵母雙雜交和雙分子熒光互補(BiFC)技術篩選StPHO1.2 的互作蛋白, 為進一步探究StPHO1.2 影響馬鈴薯耐熱性的分子機制奠定基礎, 對培育出耐高溫、高產(chǎn)、優(yōu)質的馬鈴薯新品種提供理論依據(jù)和數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 載體構建

過表達載體pBI121 和熒光表達載體p1300-RFP由本課題組保存, 酵母雙雜交相關載體pNubG-Fe65、pTSU2-APP、pPR3N、pOST1-NubI、pBT3-STE、pBT3-SUC、pBT3-N、pBT3-C, BiFC 載體NY、CY, 以及膜系統(tǒng)文庫質粒均由西北農(nóng)林科技大學吳云鋒教授提供。

從Phytozome (https://phytozome-next.jgi.doe.gov/)下載基因StPHO1.2序列(PGSC0003DMT400044207),設計特異性引物(表1), 通過PCR 從馬鈴薯cDNA 中擴增基因StPHO1.2, 根據(jù)北京全式金生物技術有限公司的一步法無縫克隆試劑盒(CU201)操作說明書,構建相關載體。

1.2 構建過表達StPHO1.2 的馬鈴薯轉基因株系

1.2.1 農(nóng)桿菌介導的馬鈴薯轉化 采用農(nóng)桿菌介導的馬鈴薯轉化技術構建過表達StPHO1.2的馬鈴薯轉基因株系。試驗所用馬鈴薯品種為“Desiree” (野生型, 對照), 用于轉化的外植體為馬鈴薯葉片。愈傷誘導培養(yǎng)基和芽誘導培養(yǎng)基的配制參照張超[21]的方法。

轉化重組質粒pBI121-StPHO1.2 至根癌農(nóng)桿菌感受態(tài)細胞GV3101, 篩選陽性克隆并置于含有抗生素(Kan、Rif)的LB 液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)(20 mL), 待菌液OD600為0.6～0.8 時, 離心收菌, 使用同體積無抗性LB 液體培養(yǎng)基重懸菌體, 待用。將生長良好的馬鈴薯葉片置于含有20%蔗糖的MS 液體培養(yǎng)基中(MS2), 用手術刀切除葉柄和葉尖, 在葉片背面劃出數(shù)道傷口并加入待用菌液, 輕輕搖晃5～10 min 后,暗培養(yǎng)2 d。轉移暗培養(yǎng)完成的轉化葉片至愈傷誘導培養(yǎng)基培養(yǎng), 10 d 后轉移至芽誘導培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)(每7～10 d 更換一次), 約4～6 周會形成芽。待芽長至1～3 cm 時剪下置于含有抗生素(Kan amycin)的MS2 培養(yǎng)基中培養(yǎng)。

1.2.2 陽性轉基因株系鑒定 待芽組織生長至完整植株時, 采用CTAB 法[22]提取DNA, 設計擴增抗性標記基因(Kan+)的特異性引物(KanF: 5′-GCTATG ACTGGGCACAACAG-3′; KanR: 5′-ATACCGTAA AGCACGAGGAA-3′), 利用PCR 初步鑒定陽性植株。提取初步鑒定的陽性植株的RNA 并反轉錄得到cDNA, 設計定量引物(DLStPHO1.2F: 5′-GCCAAGT CGATGCAATTCCT-3′; DLStPHO1.2R: 5′-GAGGAA GTAGAAGCGCGTTG-3′), 以ubi3為內(nèi)參基因[23],對轉基因株系和野生型株系中StPHO1.2的基因表達量進行定量分析[24]。

1.3 StPHO1.2 對馬鈴薯耐熱性的影響

利用植物組織培養(yǎng)技術擴繁轉基因株系和野生型株系組培苗, 待生長4～6 周后, 選擇長勢一致的植株分別置于高溫(35℃)和常溫(22 ℃± 1 ℃)條件下培養(yǎng), 每種溫度下的轉基因或野生型植株各9 株。將不同溫度下培養(yǎng)的9 株植株, 平均分成3 組, 分別用無磷(0 mmol L–1Pi)、缺磷(0.1 mmol L–1Pi)和富含磷(1.0 mmol L–1Pi)的Hoagland 營養(yǎng)液培養(yǎng)(青島海博生物技術有限公司, HB8870-3、HB8870-2、HB8870-1), 3 周后觀察生長差異。

1.4 StPHO1.2 的互作蛋白篩選

1.4.1 StPHO1.2 的亞細胞定位 種植本氏煙草,待其生長4～6 周后用于亞細胞定位試驗。轉化重組質粒p1300-RFP-StPHO1.2 至根癌農(nóng)桿菌感受態(tài)細胞GV3101, 篩選陽性克隆并置于10 mL 的LB 液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)16 h 左右, 離心收菌。用重懸液(含5%蔗糖和0.02% silwet L-77)重懸菌體并調整OD600值為1.0, 黑暗中放置3 h, 備用。用針頭在煙草葉片背面輕觸產(chǎn)生創(chuàng)口, 將準備好的菌液通過創(chuàng)口注射進煙草, 覆膜保濕培養(yǎng)2 d, 在激光共聚焦掃描顯微鏡下(日本Olympus, IX83-FV1200)觀察熒光。

1.4.2 酵母雙雜交篩選互作蛋白 按照表2 組合共轉酵母感受態(tài)細胞NMY51, 分別涂布于SD-TL培養(yǎng)基(0.67% YNB, 2%葡萄糖, 0.064% SD-Trp/-Leu,1.5%瓊脂粉)和SD-TLHA 培養(yǎng)基(0.67% YNB, 2%葡萄糖, 0.06% SD-Trp/-Leu/-His/-Ade, 1.5%瓊脂粉)培養(yǎng), 根據(jù)生長情況篩選出最適合的載體(本試驗最適合的載體為pBT3-STE)。

表2 載體篩選Table 2 The selection of vector

YNB (無氨基酵母氮源培養(yǎng)基, Y8040)購買于北京索萊寶科技有限公司, SD-Trp/-Leu (色氨酸和亮氨酸氨基酸缺失混合物, 630417)和 SD-Trp/-Leu/-His/-Ade (色氨酸、亮氨酸、組氨酸和腺嘌呤氨基酸缺失混合物, 630428)購買于寶日醫(yī)生物技術(北京)有限公司。

轉化重組質粒pBT3-STE-StPHO1.2 至酵母感受態(tài)細胞NMY51, 篩選陽性克隆后制備含有pBT3-STE-StPHO1.2 的酵母感受態(tài)細胞[25], 取10 μL 膜系統(tǒng)文庫質粒轉化該感受態(tài)細胞, 涂布于SD-TLHA培養(yǎng)基, 2～3 d 后, 挑取單克隆菌落轉移至SD-TLHA培養(yǎng)基(含X-α-Gal)再培養(yǎng)3 d, 選取顯藍色的菌落,PCR 鑒定并送于西安擎科澤西生物科技有限責任公司測序。

利用NCBI 網(wǎng)站序列比對分析測序結果, 構建該序列與 pPR3N 的重組質粒, 并與 pBT3-STEStPHO1.2 共轉酵母感受態(tài)細胞NYM51。菌液涂布于SD-TL 和SD-TLHA 培養(yǎng)基上培養(yǎng)3 d, 挑取單克隆菌落移至SD-TLHA 培養(yǎng)基(含X-α-Gal), 觀察顯色情況。

1.4.3 BiFC 驗證蛋白互作 構建互作蛋白的CY 載體, 與NY-StPHO1.2 分別轉化至根癌農(nóng)桿菌感受態(tài)細胞 GV3101, 參照陸孫杰的方法[19]進行BiFC 驗證。

2 結果與分析

2.1 構建過表達StPHO1.2 的馬鈴薯轉基因株系

提取轉化植株和野生型植株(Desiree)的基因組DNA, 利用抗性標記基因(Kan+)的特異性引物進行PCR 擴增(圖1)。結果顯示, 從pBI121 空載質粒和轉化StPHO1.2的植株基因組DNA 均擴增得到600 bp 左右的條帶, 但Desiree 基因組DNA 并未擴增出條帶, 表明pBI121-StPHO1.2 成功轉入了Desiree。

圖1 抗性基因PCR 鑒定陽性轉基因株系Fig.1 Identification of positive transgenic lines of resistance gene by PCR

提取轉化植株和Desiree 的RNA 并反轉錄得到cDNA, 利用定量引物和ubi3內(nèi)參基因分析StPHO1.2的基因表達量變化。結果顯示, 相比于Desiree, 轉化植株中StPHO1.2的基因表達量升高了10 倍以上, 表明StPHO1.2成功在Desiree 中過表達(僅展示StPHO1.2基因表達量最高的陽性轉基因植株) (圖2)。將過表達StPHO1.2的馬鈴薯轉基因株系命名為StPHO1.2-Desiree。

圖2 定量PCR 鑒定陽性轉基因株系Fig.2 Identification of positive transgenic lines by qPCR

2.2 StPHO1.2 對馬鈴薯耐熱性的影響

無磷(0 mmol L–1Pi)條件下(圖3-A), 高溫(35 ℃)和常溫(22℃±1 ℃)下的StPHO1.2-Desiree 和Desiree的長勢無顯著差異。缺磷(0.1 mmol L–1Pi)條件下(圖3-B)和富含磷(1.0 mmol L–1Pi)條件下(圖3-C), 高溫和常溫下的 StPHO1.2-Desiree 的長勢均優(yōu)于Desiree。此外, 相比于無磷和缺磷條件, 磷元素充足時, StPHO1.2-Desiree 和Desiree 具有更為良好的生長。因此, 過表達StPHO1.2能夠增強馬鈴薯耐熱性,且磷元素越充足, 轉基因植株生長的越好。

圖3 StPHO1.2-Desiree 和Desiree 的表型分析Fig.3 Phenotypic analysis of StPHO1.2-Desiree and Desiree

2.3 StPHO1.2 的互作蛋白篩選

2.3.1StPHO1.2的亞細胞定位及酵母雙雜交篩選互作蛋白 將OD600為1.0 的含有重組質粒p1300-RFP-StPHO1.2 的農(nóng)桿菌菌液注射進本氏煙草葉片中, 保濕培養(yǎng)2 d 后, 在激光共聚焦掃描顯微鏡下觀察熒光。結果顯示, 陰性對照組的煙草熒光信號雜亂無規(guī)則, 試驗組煙草細胞膜上可見熒光信號, 表明StPHO1.2在細胞膜上表達(圖4)。

圖4 StPHO1.2 的亞細胞定位Fig.4 Subcellular localization of StPHO1.2

由圖5 可知, 共轉pNubG-Fe65 和pTSU2-APP(陽性對照)的 NMY51 酵母菌株能在 SD-TL 和SD-TLHA 培養(yǎng)基上良好生長。NMY51 (陰性對照)在SD-TL 和SD-TLHA 培養(yǎng)基上均無法生長。共轉pPR3N 與重組質粒pBT3-STE-StPHO1.2 (自激活檢測)的NMY51 能在SD-TL 培養(yǎng)基上生長, 但無法在SD-TLHA 培養(yǎng)基上生長。共轉 pOST1-NubI 和pBT3-STE-StPHO1.2 (功能檢測)的NMY51 在SD-TL和SD-TLHA 培養(yǎng)基上均能正常生長。表明重組質粒pBT3-STE-StPHO1.2 功能良好, 且無自激活現(xiàn)象,因此, 選擇pBT3-STE-StPHO1.2 進行酵母篩庫試驗。

圖5 酵母雙雜質粒的篩選Fig.5 Screening of vector for yeast double-hybrid experiment

轉化pBT3-STE-StPHO1.2至NMY51, 挑取陽性克隆并制備含有重組質粒pBT3-STE-StPHO1.2 的酵母感受態(tài), 然后轉化膜系統(tǒng)文庫質粒至該感受態(tài)中,挑取在SD-TLHA 培養(yǎng)基上生長的單克隆菌落, 移至新鮮的SD-TLHA 培養(yǎng)基(含X-α-Gal)上生長, 結果如圖所示(圖6)。顯藍色的代表該蛋白與StPHO1.2具有強相互作用。經(jīng)過PCR、測序、序列比對分析發(fā)現(xiàn), 鈣離子轉運相關蛋白(StCAX1, PGSC0003 DMT400030772)和光系統(tǒng) II 蛋白亞基(StPsbR,PGSC0003DMT400057257)與StPHO1.2 互作。

圖6 酵母雙雜交篩選StPHO1.2 的互作蛋白Fig.6 Screening of interacting proteins of StPHO1.2 by yeast double-hybrid

構建重組質粒 pPR3N-StCAX1 和 pPR3NStPsbR, 分別與pBT3-STE-StPHO1.2 共轉NMY51酵母感受態(tài)。通過PCR 鑒定共轉成功的陽性酵母菌,挑取該菌斑溶于20 μL 無菌生理鹽水, 點樣3 μL 于SD-TLHA (含X-α-Gal)培養(yǎng)基上生長。結果顯示, 轉化后的NMY51 酵母菌能在SD-TLHA 培養(yǎng)基上生長,且能與 X-α-Gal 反應顯現(xiàn)藍色, 表明 StCAX1 和StPsbR 均與StPHO1.2 互作(圖7)。

圖7 StPHO1.2 與互作蛋白的“一對一”驗證Fig.7 “One-to-one” verification of StPHO1.2 and interacting proteins

2.3.2 BiFC 驗證蛋白互作 構建重組質粒CY-StCAX1 和CY-StPsbR, 分別與NY-StPHO1.2 在本氏煙草葉片中進行BiFC 驗證(圖8)。陰性對照(NY+CY、CY-StCAX1+NY、CY-StPsbR+NY 和CY+NY-StPHO1.2)無互作, 故熒光信號雜亂且不規(guī)則;StCAX1 和StPHO1.2、StPsbR 和StPHO1.2 均互作,因此, CY-StCAX1+NY-StPHO1.2 和CY-StPsbR+NYStPHO1.2 共注射煙草葉片后, 在顯微鏡下能夠觀察到熒光信號。結果顯示, 細胞膜和細胞質中都有熒光信號出現(xiàn), 表明StCAX1 和StPsbR 均與StPHO1.2互作。

圖8 StPHO1.2 與互作蛋白的BiFC 驗證Fig.8 BiFC identification of StPHO1.2 and interacting proteins

3 討論

植物在磷元素缺乏環(huán)境下, 其多個理化指標會發(fā)生變化, 從而影響到生長發(fā)育。磷元素是光合作用中不可缺少的底物或調節(jié)物, 缺磷則會嚴重影響植物的光合作用[26], 導致光合速率下降, 從而減少生長量、根系結構等[27]。水稻在磷元素缺乏時, 碳水化合物更多地運輸至根部, 從而增加根冠比[28],加劇膜脂過氧化程度加劇[29]。大豆在缺磷條件下,通過光合作用固定的碳更多的轉化成為了淀粉, 運輸至莖和根部的可溶性糖含量則急劇減少[30], 同時抗逆性明顯受到影響, 比如細胞膜透性增加, MDA含量升高, 保護酶活性下降等[31]。

擬南芥 PHO1 亞家族包含 11 個成員(PHO1,PHO1;H1-H10), 缺失PHO1基因的擬南芥表現(xiàn)出典型缺磷表型[32], 但通過過表達PHO1或PHO1;H1能夠修復, 使擬南芥生長正常[33]。PHO1;H3 具有磷轉運的功能[34]; PHO1;H10 與生物和非生物脅迫有關[35-36]。在馬鈴薯中,StPHT1;7的過表達會降低馬鈴薯耐旱性[37], PHO1 亞家族成員不僅與磷轉運有關, 也涉及馬鈴薯的抗逆過程[19,38]。本研究中, 無磷條件下, StPHO1.2-Desiree 和Desiree 的生長都受到了明顯限制; 缺磷條件下, StPHO1.2-Desiree 能夠正常生長, 但 Desiree 生長受限; 富含磷條件下,StPHO1.2-Desiree 和Desiree 均能正常生長, 既表明磷元素對馬鈴薯生長的重要性, 也表明過表達StPHO1.2能夠影響馬鈴薯對磷元素的吸收和轉運,促進馬鈴薯生長, 增強馬鈴薯耐熱性, 這些結果與前人研究結果一致。

在高溫脅迫下, 植物體內(nèi)會通過一系列理化反應保護自身免受高溫侵害, 比如增加細胞膜流動性,增強抗氧化酶活性和光合速率, 產(chǎn)生脯氨酸、可溶性糖等滲透調節(jié)物質, 以及產(chǎn)生熱休克蛋白等應激蛋白[39]。本研究發(fā)現(xiàn), StPsbR 是光合系統(tǒng)II 蛋白亞基, 與植物光合作用相關; StCAX1 與鈣離子的轉運有關, 鈣離子作為第二信使, 其濃度會在高溫脅迫等逆境環(huán)境下升高, 對植物的生長發(fā)育具有十分重要的作用[40]。因此, StPHO1.2 與StCAX1 和StPsbR互作, 表明StPHO1.2 可能會影響信號轉導或光合作用, 從而對馬鈴薯耐熱性、生長發(fā)育產(chǎn)生影響, 這和磷元素的生理功能是一致的[2]。除StCAX1 和StPsbR外, 本研究還發(fā)現(xiàn)StPHO1.2 與抗氧化反應有關的Glu 蛋白(谷氧還蛋白, PGSC0003DMT400020793)互作(未展示圖片), 表明StPHO1.2 還可能通過提高馬鈴薯的抗氧化能力, 從而增強抵御高溫脅迫的能力,但該互作仍需進一步驗證。

綜上所述, 富含磷條件下, StPHO1.2 可能通過影響馬鈴薯光合作用、信號轉導、抗氧化能力等, 增強馬鈴薯耐熱性, 促進馬鈴薯生長。

4 結論

本研究構建了一系列重組質粒, 首先利用農(nóng)桿菌介導的馬鈴薯轉化技術, 在野生型馬鈴薯(Desiree)中過表達StPHO1.2, 鑒定獲得轉基因株系(StPHO1.2-Desiree)。其次, 分別在高溫(35 ℃)和常溫(22℃±1 ℃)環(huán)境下, 比較StPHO1.2-Desiree 和Desiree 在無磷(0 mmol L–1Pi)、缺磷(0.1 mmol L–1Pi)和富含磷(1.0 mmol L–1Pi)條件下的生長情況, 結果表明, 在富磷條件下, 過表達StPHO1.2能夠增強馬鈴薯耐熱性,對馬鈴薯生長也具有一定的促進作用。對StPHO1.2的亞細胞定位結果顯示, StPHO1.2 在細胞膜上表達,因此, 選擇膜系統(tǒng)文庫質粒篩選StPHO1.2 的互作蛋白; 對酵母雙雜交載體篩選后發(fā)現(xiàn), pBT3-STE 最符合本研究需求。最后, 通過酵母雙雜交試驗, 證明StPHO1.2 與鈣離子轉運相關蛋白(StCAX1)和光系統(tǒng)II 蛋白亞基(StPsbR)均有相互作用, 并通過BiFC技術進一步驗證了該互作。以上結果為深入理解磷轉運蛋白的功能及響應高溫脅迫的分子機制機理提供了參考, 對培育出高產(chǎn)、優(yōu)質、抗逆性強的馬鈴薯新品種具有促進作用。