田春艷 邊 芯 郎榮斌 俞華先 桃聯(lián)安 安汝東 董立華張 鈺 經(jīng)艷芬,*

1 云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院甘蔗研究所 / 云南省甘蔗遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 云南開遠(yuǎn) 661699; 2 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部甘蔗生物學(xué)與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(云南), 云南開遠(yuǎn) 661699

甘蔗是世界上最主要的糖料作物, 甘蔗糖約占全球食糖產(chǎn)量的80%, 占我國食糖產(chǎn)量的90%[1]。提高甘蔗蔗莖產(chǎn)量和莖稈中蔗糖分含量是提高蔗糖產(chǎn)量的關(guān)鍵[2-3]。根據(jù)蔗莖理論產(chǎn)量[4]和蔗糖分[5]的計(jì)算公式, 甘蔗株高、莖徑是甘蔗產(chǎn)量的主要構(gòu)成因子, 與甘蔗產(chǎn)量密切相關(guān); 蔗汁錘度與甘蔗糖分性狀密切相關(guān), 是甘蔗蔗糖分性狀評(píng)價(jià)的重要指標(biāo)之一。因此, 對(duì)這些重要構(gòu)成因子進(jìn)行遺傳研究對(duì)提高甘蔗蔗莖產(chǎn)量和蔗糖產(chǎn)量具有重要意義。然而,這些構(gòu)成因子均屬于數(shù)量性狀, 受到多個(gè)基因數(shù)量性狀位點(diǎn)的控制, 遺傳基礎(chǔ)非常復(fù)雜, 且表現(xiàn)型與基因型間的相互對(duì)應(yīng)關(guān)系也不明確, 因此, 研究較為困難[6]。了解和研究這些主要構(gòu)成因子的遺傳規(guī)律, 鑒定與甘蔗產(chǎn)量和糖分相關(guān)農(nóng)藝性狀關(guān)聯(lián)的分子標(biāo)記對(duì)培育高產(chǎn)高糖甘蔗新品種具有重要意義和應(yīng)用價(jià)值。

SSR (simple sequence repeats)標(biāo)記, 因其具有共顯性遺傳特征、重復(fù)性好、基因組中分布廣泛和多態(tài)性豐富等優(yōu)點(diǎn), 已被廣泛應(yīng)用于甘蔗遺傳多樣性研究、種質(zhì)資源和雜交后代鑒定、遺傳圖譜構(gòu)建等研究[7-10]。關(guān)聯(lián)分析是基于在不同基因座等位變異(基因)間存在的連鎖不平衡關(guān)系, 能夠識(shí)別群體內(nèi)目標(biāo)性狀與遺傳標(biāo)記或候選基因之間的關(guān)系, 是一種鑒定與數(shù)量性狀關(guān)聯(lián)的遺傳標(biāo)記的有效方法[11-12]。已被廣泛應(yīng)用于玉米[13]、水稻[14]、大麥[15]、大豆[16]等多種作物。

目前, 有關(guān)甘蔗農(nóng)藝性狀的關(guān)聯(lián)分析也有了相關(guān)研究報(bào)道。Pinto 等[17]利用43 個(gè)SSR 標(biāo)記與甘蔗產(chǎn)量和品質(zhì)相關(guān)性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析, 檢測到與株高關(guān)聯(lián)的標(biāo)記20 個(gè), 與莖徑關(guān)聯(lián)的6 個(gè)。Banerjee 等[18]以102 個(gè)甘蔗品種為研究材料, 基于989 個(gè)SSR 標(biāo)記利用MLM 模型檢測與甘蔗蔗糖分及其他產(chǎn)量構(gòu)成因子關(guān)聯(lián)的分子標(biāo)記, 結(jié)果鑒定出與莖徑顯著關(guān)聯(lián)的標(biāo)記4 個(gè), 與蔗糖分顯著關(guān)聯(lián)的標(biāo)記6 個(gè)。Bilal等[19]采用20 對(duì)SSR 標(biāo)記對(duì)蔗莖重和分蘗數(shù)性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析, 共發(fā)現(xiàn)與蔗莖產(chǎn)量顯著關(guān)聯(lián)的標(biāo)記3個(gè), 與分蘗數(shù)極顯著關(guān)聯(lián)的標(biāo)記2 個(gè)。Siraree 等[20]通過關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)與甘蔗株高相關(guān)的SSR 標(biāo)記2 個(gè),與莖徑相關(guān)的3 個(gè), 與錘度相關(guān)的1 個(gè), 與蔗糖分相關(guān)的 3 個(gè), 對(duì)表型變異的解釋率范圍為 1.6%～37.5%。朱專為[21]以80 份甘蔗品種為研究對(duì)象, 利用AFLP 和SSR 標(biāo)記對(duì)甘蔗10 個(gè)重要農(nóng)藝性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析, 篩選到一批與株高、莖徑、錘度、單莖重等性狀關(guān)聯(lián)的標(biāo)記。Barreto 等[22]以134 份巴西甘蔗種質(zhì)資源為材料, 利用SSR 標(biāo)記進(jìn)行標(biāo)記-性狀關(guān)聯(lián)分析, 結(jié)果鑒定出與甘蔗株高關(guān)聯(lián)的SSR 標(biāo)記3個(gè), 與分蘗數(shù)相關(guān)的SSR 標(biāo)記7 個(gè), 與單莖重相關(guān)的4 個(gè), 與蔗莖產(chǎn)量關(guān)聯(lián)的3 個(gè)。這些研究獲得了與甘蔗產(chǎn)量、蔗糖分相關(guān)性狀關(guān)聯(lián)的一批分子標(biāo)記,為甘蔗農(nóng)藝性狀與分子標(biāo)記的關(guān)聯(lián)分析奠定了較好的基礎(chǔ), 但都停留在位點(diǎn)或標(biāo)記水平(找到關(guān)聯(lián)標(biāo)記), 未涉及表型效應(yīng)解析。而進(jìn)行等位變異的表型效應(yīng)解析, 以特定等位變異的形式在性狀表型和基因型間建立起聯(lián)系, 這直接關(guān)乎到這些優(yōu)異關(guān)聯(lián)位點(diǎn)在育種上的實(shí)際應(yīng)用潛力。因此, 亟需加強(qiáng)發(fā)掘與相關(guān)農(nóng)藝性狀關(guān)聯(lián)的新標(biāo)記, 尤其重要的是對(duì)獲得的優(yōu)良關(guān)聯(lián)標(biāo)記進(jìn)行表型效應(yīng)解析, 弄清這些等位變異與表現(xiàn)型的具體對(duì)應(yīng)關(guān)系, 發(fā)掘?qū)Ρ硇椭地暙I(xiàn)較大的優(yōu)異等位變異。

鑒于此, 本研究以62 份甘蔗常用雜交親本或品種(系)、以及本單位自育創(chuàng)新種質(zhì)為材料, 對(duì)與甘蔗產(chǎn)量和蔗糖分密切相關(guān)的3 個(gè)育種性狀在4 個(gè)種植環(huán)境下的表現(xiàn)型進(jìn)行調(diào)查和分析, 利用37 對(duì)SSR 標(biāo)記對(duì)群體材料進(jìn)行遺傳多樣性分析、群體結(jié)構(gòu)分析和關(guān)聯(lián)分析, 篩選與甘蔗株高、莖徑和錘度顯著關(guān)聯(lián)的SSR 標(biāo)記, 并鑒定出優(yōu)異關(guān)聯(lián)標(biāo)記進(jìn)行表型效應(yīng)解析, 挖掘與這3 個(gè)育種性狀表型變異密切相關(guān)的優(yōu)異等位變異及典型載體材料, 掌握產(chǎn)量和蔗糖分性狀的表型和遺傳標(biāo)記間的關(guān)系, 為甘蔗雜交組合親本選配和分子育種提供指導(dǎo)和參考依據(jù), 為甘蔗高產(chǎn)高糖育種奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

以我國甘蔗育種常用雜交親本(包括國內(nèi)栽培種、國外引進(jìn)種)、以及本單位自育的核心創(chuàng)新種質(zhì)共62 份甘蔗種質(zhì)資源為研究材料, 材料信息詳見附表1。

附表1 參試材料信息Table S1 Tested materials used in this study

表1 3 個(gè)育種性狀的方差分析結(jié)果和廣義遺傳力Table 1 MANOVA and broad-sense heritability of three breeding traits

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)和材料種植

本試驗(yàn)于2020 年在云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院甘蔗研究所瑞麗育種站進(jìn)行, 共4 個(gè)種植環(huán)境條件。包括大田和桶栽2 種方式, 其中大田種植設(shè)2 個(gè)點(diǎn), 云南省德宏州隴川縣南多和弄門2 個(gè)甘蔗品種選育基地,桶栽種植設(shè)正常供水和干旱脅迫2 種水分環(huán)境。

大田種植采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì), 每個(gè)材料種植1行, 3 個(gè)重復(fù), 行長2.0 m, 行距為1.1 m。桶栽于2020年2 月20 日進(jìn)行單芽種植, 每只桶裝土18 kg, 每桶8 個(gè)芽, 每份材料種植6 桶, 正常澆水管理使其生長1 個(gè)月后進(jìn)行出苗調(diào)查和補(bǔ)栽以保證苗量。于8 月7日將材料分成2 組, 每組3 桶, 每桶留有長勢基本一致的5 株苗, 拔除多余植株。第1 組繼續(xù)正常供水,第2 組進(jìn)行干旱脅迫處理。通過控制澆水次數(shù)進(jìn)行干旱脅迫, 即進(jìn)入抗旱大棚前, 第1 組每隔2 d 澆1次水, 第2 組每隔4 d 澆1 次水, 進(jìn)入抗旱大棚后,由于氣溫升高, 為保證干旱脅迫組的基本生長需求,將干旱脅迫組澆水頻率調(diào)整為每隔3 d 澆1 次水, 每次澆水量為桶底有大量水溢出。

1.3 表型數(shù)據(jù)調(diào)查和統(tǒng)計(jì)分析

于甘蔗生理成熟期對(duì)株高、莖徑、錘度3 個(gè)性狀進(jìn)行調(diào)查。大田種植的, 每行材料隨機(jī)調(diào)查5 株,桶栽種植的, 每個(gè)材料調(diào)查3 桶, 每桶選取長勢均勻的4 株進(jìn)行調(diào)查。利用DPS 7.05 對(duì)表型數(shù)據(jù)進(jìn)行描述性統(tǒng)計(jì)分析, 利用GenStat12 進(jìn)行方差和互作效應(yīng)分析, 并按照Basnayake 等[23]方法計(jì)算廣義遺傳力。

1.4 基因組DNA 提取

取0.2 g 嫩葉, 利用植物基因組DNA 提取試劑盒(Tiangen DNAsecure, DP320-02)提取甘蔗基因組DNA, 具體操作步驟參考試劑盒說明書。使用微量紫外分光光度計(jì)NanoDrop (Thermo, ND1000)檢測DNA 質(zhì)量及濃度, 用 1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA 完整性, 主帶清晰且不大量拖尾的DNA 用于后續(xù)SSR 分型實(shí)驗(yàn)。

1.5 毛細(xì)管電泳檢測及條帶統(tǒng)計(jì)

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[24-26]選擇SSR 標(biāo)記, 合成熒光引物。PCR 反應(yīng)總體積為15 μL, 其中, DNA 模板1 μL,Buffer 1.5 μL,TaqDNA 聚合酶 (TransGen Phi29 DNA Polymerase, LP101-01) 0.3 μL, 10 mmol L–1dNTPs 0.3 μL, 25 mmol L–1MgCl21.5 μL, 正反向引物各0.15 μL (濃度10 μmol μL–1), ddH2O 10.1 μL。PCR 擴(kuò)增程序設(shè)置為94℃預(yù)變性5 min; 94℃變性30 s, 50～60℃ (根據(jù)引物信息調(diào)整)退火45 s, 72℃延伸30 s, 這3 個(gè)階段循環(huán)32 次; 最后72℃延伸5 min,4℃保存擴(kuò)增產(chǎn)物。PCR 擴(kuò)增結(jié)束后, 根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果估計(jì)PCR 產(chǎn)物濃度, 并將產(chǎn)物稀釋10倍后與ROX500 內(nèi)標(biāo)混勻, 置于ABI3730 測序儀樣本架上進(jìn)行毛細(xì)管電泳檢測(委托安徽通用生物技術(shù)有限公司完成)。測序完成后導(dǎo)出SSR 基因分型文件, 利用GeneMarker v2.7 軟件對(duì)毛細(xì)管電泳輸出圖譜進(jìn)行擴(kuò)增片段統(tǒng)計(jì), 根據(jù)需要設(shè)定每個(gè)SSR 標(biāo)記的等位基因panel, 系統(tǒng)將根據(jù)所設(shè)定的panel 進(jìn)行條帶統(tǒng)計(jì), 某一位點(diǎn)上有條帶記為“1”, 無條帶記為“0”, 系統(tǒng)將自動(dòng)根據(jù)內(nèi)標(biāo)ROX 計(jì)算片段大小, 最后進(jìn)行人工校準(zhǔn)。

1.6 遺傳多樣性和群體結(jié)構(gòu)分析

利用Power marker V3.25[27]分析各標(biāo)記所檢測到的等位基因數(shù)、主要等位基因頻率(major allele frequency, MAF)、多態(tài)性信息含量(polymorphism information content, PIC)和基因多樣性等參數(shù)。

利用Structure 2.3.1[28]進(jìn)行群體遺傳結(jié)構(gòu)分析。設(shè)定群體數(shù)目從k=1 到k=10, 并假定位點(diǎn)都是獨(dú)立的, 將開始時(shí)MCMC 的不作數(shù)迭代設(shè)為10,000 次,再將不作數(shù)迭代后的設(shè)為100,000 次, 10 個(gè)重復(fù)。利用在線評(píng)估軟件Structure Harvester (http://taylor0.biology.ucla.edu/structureHarvester/)確定最佳k值。利用CLUMPP2.0[29]將Structure 運(yùn)行得到的對(duì)應(yīng)k值的多次重復(fù)結(jié)果進(jìn)行合并, 得到合并的Q值矩陣,應(yīng)用distruct1.1[30]繪制Q-plot 圖。

1.7 關(guān)聯(lián)分析及優(yōu)異等位變異發(fā)掘

TASSEL 2.1[31]軟件可提供2 種關(guān)聯(lián)分析模型,即混合線性模型(mixed linear model, MLM)和一般線性模型(general linear model, GLM)。前人研究表明:利用MLM 模型將各個(gè)體Q值作為協(xié)變量納入SSR標(biāo)記與表型性狀變異的回歸分析, 可以矯正亞群混合造成的偽關(guān)聯(lián), 減少假陽性結(jié)果[32-34]。因此, 本研究利用MLM 模型, 分別對(duì)4 個(gè)種植環(huán)境條件下3個(gè)育種性狀與SSR 標(biāo)記進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析, 其中, MLM分析需要的Q 矩陣來自STRUCTURE 軟件的結(jié)果,Kinship 矩陣由TASSEL2.1 軟件計(jì)算得到。為增強(qiáng)結(jié)果可靠性和檢測穩(wěn)定性, 本研究進(jìn)一步將同時(shí)在2 個(gè)及以上環(huán)境下都檢測到的標(biāo)記認(rèn)為是優(yōu)異關(guān)聯(lián)標(biāo)記。

為發(fā)掘優(yōu)異等位變異, 對(duì)上述鑒定出的優(yōu)異關(guān)聯(lián)標(biāo)記, 參照錢能[35]的方法計(jì)算各位點(diǎn)的表型效應(yīng)值, 逐一進(jìn)行各等位變異的表型效應(yīng)解析。SSR 位點(diǎn)等位變異表型效應(yīng)的計(jì)算公式為:

式中,ai代表第i個(gè)等位變異的表型效應(yīng)值,xij為攜帶第i個(gè)等位變異的第j個(gè)材料的性狀表型測定值,ni為具有第i等位變異的材料數(shù)目。Nk為所有材料的性狀表型測定值,nk為所有試驗(yàn)材料數(shù)目。若ai值為正, 則該等位變異為增效等位變異, 反之為減效等位變異。本研究以發(fā)掘甘蔗高產(chǎn)高糖等位變異為目的, 所以具有增效效應(yīng)的等位變異被認(rèn)為是優(yōu)異等位變異, 而攜帶該等位變異, 且對(duì)應(yīng)表型測定值最大的材料為該等位變異的典型載體材料。

2 結(jié)果與分析

2.1 方差和廣義遺傳力分析

多變量方差分析(MANOVA)和廣義遺傳力分析結(jié)果(表1)顯示, 甘蔗3 個(gè)性狀基因型(種質(zhì))間存在極顯著差異(P<0.001), 環(huán)境(4 個(gè)種植環(huán)境)對(duì)3 個(gè)性狀也具有極顯著影響(P<0.001), 基因型與環(huán)境間存在極顯著的互作效應(yīng)(P<0.001)。3 個(gè)性狀的廣義遺傳力排序依次為莖徑(0.76)>錘度(0.72)>株高(0.68),廣義遺傳力較高, 說明這3 個(gè)性狀具有較穩(wěn)定的遺傳特性, 且莖徑和錘度的遺傳穩(wěn)定性大于株高。因此, 雖然環(huán)境、基因型×環(huán)境互作對(duì)株高、莖徑和錘度具有極顯著影響, 但主要取決于種質(zhì)材料本身,也就是主要由基因型決定。

2.2 3 個(gè)育種性狀的表型變異分析

62份甘蔗種質(zhì)3個(gè)農(nóng)藝性狀的表型變異分析結(jié)果(表2)顯示: 4個(gè)不同種植環(huán)境條件下, 株高的變異系數(shù)范圍為10.72%～19.89%, 平均值為14.64%;莖徑的變異系數(shù)介于11.91%～14.89%之間, 均值為13.36%; 錘度的變異系數(shù)范圍為6.73%～12.11%, 平均值為9.9%。株高變異系數(shù)最大, 其次是莖徑, 錘度的變異系數(shù)最小, 表明群體的株高性狀遺傳變異最豐富。對(duì)于株高, 干旱對(duì)其影響較大, 干旱脅迫下的株高平均值顯著低于其余3 個(gè)環(huán)境下的平均值,表明干旱脅迫對(duì)甘蔗株高影響較大。而莖徑在大田和桶栽2 種種植方式間差異較大, 這主要是由于桶栽種植環(huán)境空間小、群體密度大, 因此對(duì)蔗莖的生長影響較大。對(duì)于錘度, 在桶栽種植正常澆水條件下平均值最低, 這可能是由于土壤中水分過多引起蔗汁中蔗糖濃度降低導(dǎo)致的。

表2 4 個(gè)種植環(huán)境下供試甘蔗3 個(gè)農(nóng)藝性狀變異Table 2 Variation of three agronomic traits in tested sugarcane accessions under four planting environments

對(duì)3 個(gè)性狀在4 個(gè)種植環(huán)境下進(jìn)行頻數(shù)分布分析發(fā)現(xiàn), 本研究的3 個(gè)性狀均符合正態(tài)分布(圖1),呈典型的數(shù)量性狀分布特征。從偏度和峰度值看, 3個(gè)性狀的偏度介于-1.49～0.43 之間, 峰度介于-0.65～1.89 之間, 偏度和峰度較小, 也符合近正態(tài)分布, 可用于后續(xù)關(guān)聯(lián)分析。

圖1 62 份甘蔗種質(zhì)資源3 個(gè)育種性狀的頻數(shù)分布Fig.1 Frequency distribution of three breeding traits in 62 sugarcane germplasm entries

2.3 遺傳多樣性和群體結(jié)構(gòu)分析

PCR 擴(kuò)增結(jié)果顯示, 37 對(duì)引物共檢測到204 個(gè)等位基因(表3), 變幅為2～10 個(gè), 每個(gè)標(biāo)記平均檢測到5.5135 個(gè), 主等位基因頻率平均值為0.4151, 多態(tài)性信息含量變化范圍為 0.3749～0.8319。根據(jù)Botstein[36]等的劃分依據(jù): PIC>0.50 為高度多態(tài)性信息引物, PIC<0.25 為低度多態(tài)性信息引物, PIC 值介于0.25 和0.50 之間, 為中度多態(tài)性信息引物。本研究所選用的引物, PIC 平均值為0.6252, PIC>0.50 的標(biāo)記有33 個(gè), 占總量的89.19%, 平均基因多樣性為0.6779, 表明本研究群體材料遺傳多樣性較豐富, 37對(duì)SSR 標(biāo)記的多態(tài)性較高。

利用Structure 2.3.1 軟件對(duì)62 份供試甘蔗種質(zhì)進(jìn)行群體結(jié)構(gòu)分析, 當(dāng)K=3 時(shí), ?K出現(xiàn)明顯的峰值(圖2-A), 即參試的62 份甘蔗種質(zhì)群體存在3 個(gè)亞群, 分別命名為POP1、POP2 和POP3 (圖2-C)。其中POP1 有37 份材料(圖2-B), 包括品種/親本21 份,云瑞創(chuàng)新種質(zhì)16 份,Q>0.8 的有28 份,Q<0.6 的有1份; POP2 有21 份材料, 包含云瑞創(chuàng)新種質(zhì)16 份, 品種/親本5 份,Q>0.8 的有12 份,Q<0.6 的有6 份; POP3的4 份材料都是云瑞創(chuàng)新種質(zhì),Q>0.8 的3 份,Q<0.6的1 份。62 份種質(zhì)僅有8 份種質(zhì)的Q值小于0.6, 表明群體材料的遺傳組成較為簡單。所獲得的Q值矩陣將用于后續(xù)關(guān)聯(lián)分析作為協(xié)變量, 以消除群體結(jié)構(gòu)對(duì)關(guān)聯(lián)分析結(jié)果的影響。

圖2 62 份甘蔗種質(zhì)資源的群體結(jié)構(gòu)Fig.2 Population structure of 62 sugarcane germplasm entries

2.4 甘蔗株高、莖徑和錘度與SSR 標(biāo)記的關(guān)聯(lián)分析

通過MLM 方法(表4), 在4 個(gè)環(huán)境下共檢測到與株高關(guān)聯(lián)的標(biāo)記6 個(gè), 對(duì)表型變異的解釋率范圍為10.57%～14.95%; 與莖徑關(guān)聯(lián)的標(biāo)記7 個(gè), 表型變異解釋率為5.04%～26.29%; 與錘度關(guān)聯(lián)的標(biāo)記7 個(gè),表型變異解釋率為16.90%～27.98%。

表4 與3 個(gè)育種性狀顯著關(guān)聯(lián)到的SSR 標(biāo)記情況總概Table 4 General overview of SSR markers associated with three breeding traits

為提高關(guān)聯(lián)標(biāo)記的可靠性, 本研究把在2 個(gè)及以上環(huán)境下同時(shí)檢測到的標(biāo)記認(rèn)為是優(yōu)異關(guān)聯(lián)位點(diǎn)(表5)。因此, 與株高關(guān)聯(lián)的 6 個(gè)標(biāo)記中, 只有SCB190 為株高優(yōu)異關(guān)聯(lián)位點(diǎn), 同時(shí)在2 個(gè)環(huán)境下檢測到。與莖徑關(guān)聯(lián)的7 個(gè)位點(diǎn)中, 只有DBF/Arb1、SMC486CG、SMC1752 和IISR306 為優(yōu)異關(guān)聯(lián)位點(diǎn),其中DBF/Arb1 和SMC486CG 同時(shí)在3 個(gè)環(huán)境下檢測到, 且SMC486CG 與莖徑在3 個(gè)環(huán)境下均為極顯著相關(guān)。與錘度關(guān)聯(lián)的優(yōu)異位點(diǎn)有SMC851MS 和SMC119CG 兩個(gè)。

表5 在2 個(gè)及以上環(huán)境下都檢測到的與農(nóng)藝性狀顯著關(guān)聯(lián)的SSR 標(biāo)記Table 5 SSR markers associated with agronomic traits under two or more planting environments

2.5 優(yōu)異關(guān)聯(lián)位點(diǎn)的表型效應(yīng)解析

為發(fā)掘優(yōu)異等位變異, 在基因型與表現(xiàn)型間建立對(duì)應(yīng)關(guān)系, 本研究進(jìn)一步對(duì)上述鑒定出的7 個(gè)優(yōu)異關(guān)聯(lián)位點(diǎn)進(jìn)行表型效應(yīng)解析。由于本研究主要為發(fā)掘與甘蔗高產(chǎn)高糖相關(guān)的等位變異, 因此, 本試驗(yàn)將在多個(gè)環(huán)境下表型效應(yīng)值均為正值(增效)的等位變異認(rèn)定為優(yōu)異等位變異。表6 列出了上述獲得的7 個(gè)優(yōu)異關(guān)聯(lián)位點(diǎn)在4 個(gè)不同環(huán)境條件下各等位變異的表型效應(yīng)值及典型載體材料, 表7 列出了鑒定出來的優(yōu)異等位變異及其對(duì)應(yīng)的典型載體材料。分析發(fā)現(xiàn):

表6 7 個(gè)優(yōu)異關(guān)聯(lián)位點(diǎn)及其所有等位變異對(duì)應(yīng)的表型效應(yīng)值Table 6 Alleles of seven related elite markers and their phenotypic effect value

表7 優(yōu)異等位變異及其相應(yīng)環(huán)境下對(duì)應(yīng)的典型載體材料Table 7Excellent alleles and typical carrier materials in corresponding environments

(1) 株高優(yōu)異關(guān)聯(lián)位點(diǎn)SCB190, 共檢測到5 個(gè)等位變異, 其中SCB190_263 bp 在2 個(gè)種植環(huán)境條件下均為增效效應(yīng), 屬株高優(yōu)異等位變異, 典型材料是云瑞164。其余4 個(gè)為減效效應(yīng), 減效效應(yīng)最大的等位變異是SCB190_250 bp。

(2) 莖徑關(guān)聯(lián)的4 個(gè)優(yōu)異位點(diǎn)中, DBF/Arb1 同時(shí)在3 個(gè)環(huán)境下都檢測到, 包含3 個(gè)等位變異。其中, DBF/Arb1_217 bp 在3 個(gè)種植環(huán)境條件下均為增效等位變異, 屬優(yōu)異等位變異, 典型材料分別是云瑞15-566、粵糖86-368、粵糖60 號(hào)。位點(diǎn)SMC486CG檢測到7 個(gè)等位變異, 其表型效應(yīng)介于-0.18 ～ +0.06之間, 其中SMC486CG_222 bp 和SMC486CG_232 bp在3 個(gè)種植環(huán)境下均為增效等位變異, 屬優(yōu)異等位變異, 典型材料有云蔗08-1609、粵糖86-368、粵糖93-159 和桂糖11 號(hào), SMC486CG_234 bp、SMC486CG_236 bp、SMC486CG_237 bp 和SMC486CG_238 bp 在3 種環(huán)境下均為減效效應(yīng)。位點(diǎn)SMC1752 檢測到4個(gè)等位變異, 表型效應(yīng)范圍為–0.03 ～ +0.02, IISR306檢測到8個(gè)等位變異, 表型效應(yīng)范圍為-0.92 ～ +2.04。

(3) 錘度關(guān)聯(lián)的2 個(gè)優(yōu)異位點(diǎn)中, SMC851MS 具有6 個(gè)等位變異, 表型效應(yīng)值為-0.26 ～ +0.22, 平均增效效應(yīng)為+0.08, 減效效應(yīng)為-0.13。等位變異SMC851MS_133 bp 和SMC851MS_134 bp 在2 個(gè)種植環(huán)境條件下均為增效效應(yīng), 屬優(yōu)異等位變異, 典型材料有云蔗 08-1609、福農(nóng) 15 號(hào)。等位變異SMC851MS_129 bp、SMC851MS_131 bp和SMC851MS_137 bp 為減效效應(yīng), 典型材料有云瑞17-114、云瑞17-124、云瑞15-566。位點(diǎn)SMC119CG 檢測到5 個(gè)等位變異, 表型效應(yīng)范圍為-5.27 ～ +0.51, 平均增效效應(yīng)為+0.28, 減效效應(yīng)為-1.59。其中SMC119CG_116 bp、SMC119CG_122 bp 在2 個(gè)環(huán)境下均為增效效應(yīng), 屬優(yōu)異等位變異, 增效效應(yīng)最大的是SMC119CG_122 bp (+0.51), 典型載體材料是粵糖00-236。這些增效(減效)效應(yīng)明顯或穩(wěn)定的等位變異(在多個(gè)環(huán)境下都檢測到)可在今后甘蔗育種中根據(jù)具體的育種目標(biāo)性狀進(jìn)行選擇性地利用, 而攜帶這些等位變異的典型載體材料可考慮作為甘蔗雜交的優(yōu)異親本資源。

3 討論

高產(chǎn)高糖是甘蔗育種的兩個(gè)重要目標(biāo)。根據(jù)甘蔗理論產(chǎn)量和理論蔗糖分計(jì)算公式, 甘蔗株高、莖徑和錘度是這兩大育種目標(biāo)的主要構(gòu)成因子[4-5]。常規(guī)甘蔗育種依賴表型選擇優(yōu)良性狀以實(shí)現(xiàn)育種目標(biāo),但易受到環(huán)境因素的影響。因此, 摸清常用種質(zhì)資源重要育種性狀的遺傳變異和遺傳規(guī)律, 不僅可提高選擇效率, 而且可增強(qiáng)對(duì)雜交后代表現(xiàn)型的預(yù)見性[37]。本研究62 份材料在4 個(gè)種植環(huán)境下的表型遺傳變異分析表明, 3 個(gè)育種性狀的變異系數(shù)范圍為6.73%～19.89%, 其中變異系數(shù)大小排序依次為株高>莖徑>錘度。徐志軍等[38]對(duì)甘蔗F1群體農(nóng)藝性狀遺傳分析的結(jié)果顯示, 甘蔗F1群體的性狀變異系數(shù)為莖徑(12.53%)>株高(10.51%)>錘度(8.23%)。劉家勇等[3]研究顯示, 甘蔗新植和宿根的蔗糖分變異系數(shù)較小, 介于9.56%到11.65%之間。楊昆等[39]對(duì)甘蔗家系經(jīng)濟(jì)性狀的遺傳變異分析結(jié)果表明, 6 個(gè)性狀中株高的遺傳變異系數(shù)最大(14.25%), 錘度最小(4.12%)。這些研究都表明甘蔗錘度性狀的變異系數(shù)較小。除變異系數(shù)外, 性狀的遺傳力也是植物遺傳改良和育種工作中的重要遺傳參數(shù), 反映的是根據(jù)表型值選擇基因型值的可靠程度[40-41]。本研究的3個(gè)育種性狀廣義遺傳力范圍介于0.68 至0.76 之間,表現(xiàn)為較高的遺傳力, 這與楊昆等[39]的研究結(jié)果一致, 說明在育種中, 根據(jù)表型值對(duì)性狀進(jìn)行優(yōu)劣選擇是比較有效的。然而, 本研究方差分析顯示基因型、環(huán)境、基因型×環(huán)境對(duì)甘蔗株高、莖徑和錘度的影響為極顯著, 說明種植環(huán)境對(duì)這3 個(gè)性狀的影響也較大。因此, 除表型選擇外, 亟需建立更有效、更可靠的分子標(biāo)記輔助選擇方法。

關(guān)聯(lián)分析, 是在性狀表現(xiàn)型和基因型或遺傳標(biāo)記間建立起聯(lián)系, 以便利用遺傳標(biāo)記預(yù)見表現(xiàn)型的重要方法之一。本研究利用多態(tài)性SSR 標(biāo)記, 獲得與株高、莖徑和錘度關(guān)聯(lián)的SSR 標(biāo)記數(shù)分別為6 個(gè)、7 個(gè)和7 個(gè), 一個(gè)性狀檢測到多個(gè)關(guān)聯(lián)標(biāo)記。Ukoskit等[42]對(duì)甘蔗蔗糖分相關(guān)性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)與錘度極顯著關(guān)聯(lián)的標(biāo)記3 個(gè)。Siraree 等[18]鑒定出與甘蔗株高關(guān)聯(lián)的SSR 標(biāo)記2 個(gè), 與莖徑關(guān)聯(lián)的標(biāo)記3個(gè)。與本研究結(jié)果一致, 都表明一個(gè)性狀可檢測到多個(gè)關(guān)聯(lián)標(biāo)記, 表明這些性狀是由多基因控制的。同時(shí), 一個(gè)標(biāo)記也可以與多個(gè)性狀關(guān)聯(lián)。如本研究中的SMC851MS 同時(shí)與莖徑和錘度關(guān)聯(lián), SMC219與株高和錘度2 個(gè)性狀同時(shí)關(guān)聯(lián)。這種情況也體現(xiàn)在其他作物中。張力嵐等[43]通過SSR 標(biāo)記與黃麻纖維產(chǎn)量性狀的相關(guān)性分析, 發(fā)現(xiàn)與黃麻株高相關(guān)的SSR 標(biāo)記37 個(gè), Kraakman 等[44]利用AFLP 標(biāo)記發(fā)現(xiàn)與大麥產(chǎn)量相關(guān)的標(biāo)記共有8 個(gè)。劉其寶[45]等利用MLM 方法檢測到17 個(gè)與陸地棉葉片葉綠素含量顯著關(guān)聯(lián)。Abbasi 等[46]利用104 個(gè)SSR 標(biāo)記對(duì)甜菜的性狀進(jìn)行相關(guān)分析, 結(jié)果發(fā)現(xiàn)FDSB502 標(biāo)記與甜菜的糖提取系數(shù)、糖含量、糖漿、葉片鉀含量均相關(guān)。這些結(jié)果表明, 一個(gè)SSR 標(biāo)記可以與多個(gè)性狀具有相關(guān)性, 張力嵐等[42]推測這可能是由于這個(gè)標(biāo)記對(duì)應(yīng)的多效性QTL 引起的。

掌握性狀的表型和基因型是育種工作的基礎(chǔ)和關(guān)鍵, 然而, 僅僅找到與表型相關(guān)的標(biāo)記還不足以滿足育種家的需求, 不足以為育種工作提供可利用的信息。因此, 深入分析關(guān)聯(lián)位點(diǎn)等位變異的效應(yīng)值, 發(fā)掘其中的有利等位變異, 在基因型與表現(xiàn)型間建立起對(duì)應(yīng)關(guān)系, 更有助于為分子標(biāo)記輔助育種提供更有價(jià)值的信息。在甘蔗中, 前人研究已定位到了一些與甘蔗產(chǎn)量和糖分性狀關(guān)聯(lián)的位點(diǎn)[15-20],但都僅限于找到關(guān)聯(lián)位點(diǎn), 未進(jìn)行表型效應(yīng)解析。本研究在獲得關(guān)聯(lián)位點(diǎn)后, 進(jìn)一步篩選出在2 個(gè)及以上環(huán)境下都檢測到的優(yōu)異關(guān)聯(lián)位點(diǎn), 并一一解析了各等位變異的表型效應(yīng), 在性狀的表現(xiàn)型與基因型之間用特定的等位變異建立起聯(lián)系, 發(fā)掘與甘蔗株高、莖徑和錘度性狀關(guān)聯(lián)的優(yōu)異等位變異。在株高方面, 發(fā)掘了對(duì)株高具有增效潛力的優(yōu)異等位變異SCB190_263 bp, 其表型效應(yīng)范圍為+0.10 ～ +2.02;在蔗莖方面, 發(fā)掘了對(duì)莖徑具有增效效應(yīng)的優(yōu)異等位變異 DBF/Arb1_217 bp、SMC486CG_222 bp、SMC486CG_232 bp, 這些等位變異在3 個(gè)環(huán)境下均表現(xiàn)為增效效應(yīng), 其表型效應(yīng)范圍為+0.01 ～ +0.07。在錘度方面, 發(fā)掘了對(duì)錘度具有增效效應(yīng)的優(yōu)異等位變異SMC851MS_133 bp、SMC851MS_134 bp、SMC119CG_116 bp、SMC119CG_122 bp 4 個(gè), 其表型效應(yīng)范圍為+0.01 ～ +0.51。表型效應(yīng)值變異范圍最大的性狀是錘度, 與其他作物相比, 本研究獲得的表型效應(yīng)值相對(duì)較小[15,45]。這主要是由物種間差異、研究性狀不同及表型效應(yīng)值的計(jì)算方法不同引起的。值得關(guān)注的是: (1) 典型載體材料如云蔗08-1609、粵糖86-368、粵糖93-159 都同時(shí)攜帶2個(gè)莖徑增效等位變異, 與其屬中大莖甘蔗品種的實(shí)際情況一致[47-49]。(2) 典型載體材料云蔗08-1609 (攜帶等位變異SMC851MS_133 bp、SMC851MS_134 bp和SMC119CG_116 bp)、粵糖00-236 (攜帶等位變異SMC119CG_116 bp 和SMC119CG_122 bp)、福農(nóng)15號(hào)(攜帶等位變異SMC851MS_133 bp 和SMC851MS_134 bp)同時(shí)攜帶2 個(gè)及以上錘度增效等位變異, 這3 個(gè)材料皆是高糖甘蔗品種[47-50]。這暗示著: 一是本研究發(fā)掘的對(duì)莖徑、錘度具有增效效應(yīng)的等位變異,其典型載體材料的實(shí)際表現(xiàn)型與其攜帶的等位變異的表型效應(yīng)一致, 進(jìn)一步說明利用MLM 方法關(guān)聯(lián)到的標(biāo)記結(jié)果可靠性較高; 二是這些等位變異與其性狀密切相關(guān), 有望作為對(duì)應(yīng)性狀的新選擇標(biāo)記,在后續(xù)研究中應(yīng)著重關(guān)注此類型的等位變異, 同時(shí)應(yīng)加大群體數(shù)量進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證; 最重要的是, 等位變異所對(duì)應(yīng)的表型效應(yīng)可能具有累加效應(yīng), 即攜帶的增效等位變異數(shù)量越多, 其對(duì)應(yīng)的性狀表型值越大。因此, 在育種上可優(yōu)先利用攜帶多個(gè)優(yōu)異等位變異的種質(zhì)材料; 此外, 在雜交組合選配時(shí)可根據(jù)要改良的性狀選擇攜帶相應(yīng)性狀等位變異的親本,通過雜交等方式將親本所攜帶的優(yōu)異等位變異聚合起來, 為甘蔗育種提供優(yōu)異種質(zhì)資源。

4 結(jié)論

本研究群體材料株高、莖徑和錘度3 個(gè)育種性狀具有豐富的遺傳變異, 環(huán)境、基因型與環(huán)境互作對(duì)其具有極顯著影響, 但其表現(xiàn)型主要由基因型決定。所選用的37 對(duì)SSR 標(biāo)記多態(tài)性較高, 群體表現(xiàn)出較高的遺傳多樣性。利用MLM 方法進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析, 共鑒定出與株高、莖徑和錘度關(guān)聯(lián)的SSR 標(biāo)記20 個(gè), 對(duì)表型的解釋率范圍為5.04%～27.98%, 其中7 個(gè)為優(yōu)異關(guān)聯(lián)位點(diǎn)。對(duì)這7 個(gè)優(yōu)異關(guān)聯(lián)位點(diǎn)進(jìn)行表型效應(yīng)解析, 獲得對(duì)甘蔗株高、莖徑和錘度具有增效效應(yīng)的優(yōu)異等位變異共8 個(gè)及其典型載體材料10 份。研究結(jié)果表明等位變異所對(duì)應(yīng)的表型效應(yīng)可能具有累加效應(yīng), 在育種上可優(yōu)先利用攜帶多個(gè)優(yōu)異等位變異的種質(zhì)材料, 可通過雜交將親本所攜帶的優(yōu)異等位變異聚合起來, 創(chuàng)制優(yōu)異種質(zhì)。