沈晨陽，俞洪霞，余建平

浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院臨平院區(qū)感染科，浙江杭州 311100

結(jié)核性胸膜炎（tuberculous pleurisy，TP）指因結(jié)核分枝桿菌及其代謝產(chǎn)物入侵高敏狀態(tài)下的胸膜腔，導(dǎo)致纖維蛋白、炎癥細(xì)胞等大量滲出，臨床多見于中青年人群，主要表現(xiàn)為發(fā)熱、盜汗、消瘦等結(jié)核中毒癥狀與胸腔積液引發(fā)的局部壓迫癥狀[1-2]。多數(shù)患者經(jīng)胸腔閉式引流及積極抗結(jié)核治療后，胸腔積液常在1 個月內(nèi)消失，臨床癥狀緩解；而部分患者雖經(jīng)治療后仍出現(xiàn)胸膜增厚、胸腔粘連及胸腔積液吸收不完全等問題，進而引發(fā)支氣管擴張，致使患者肺功能下降，影響其生存質(zhì)量及預(yù)后[3]。因此，臨床急需尋找一個高度特異性及敏感度的指標(biāo)，以評估TP 患者治療預(yù)后。巨噬細(xì)胞在TP 的發(fā)生及發(fā)展中起重要作用，是惡性胸腔積液及結(jié)核性胸腔積液中共有的細(xì)胞成分，其中M1 巨噬細(xì)胞可增強細(xì)胞的免疫活性，M2 巨噬細(xì)胞則能夠負(fù)向調(diào)控免疫反應(yīng)[4]。Pan 等[6]研究顯示，M1/M2 巨噬細(xì)胞表達(dá)失衡與炎癥反應(yīng)的發(fā)展與轉(zhuǎn)歸密切相關(guān)，是多種疾病鑒別診斷的免疫學(xué)標(biāo)志物。但目前M1/M2 比例與TP預(yù)后的相關(guān)報道較少，故本研究擬分析TP 患者單核細(xì)胞中M1/M2 巨噬細(xì)胞比例與TP 預(yù)后關(guān)系，以期為臨床對TP患者的預(yù)后判斷及相關(guān)防治措施的制定提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2019 年6 月至2022 年12 月浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院臨平院區(qū)診治的TP 患者206 例為研究對象，其中男性128 例，女性78 例；年齡31～78歲，平均年齡為（55.78±11.51）歲；體質(zhì)量指數(shù)（body mass index，BMI）為（19.81～25.33）kg/m2，平均BMI為（23.07±1.78）kg/m2；發(fā)病至就診時間為14～46d，平均發(fā)病至就診時間為（31.15±10.67）d。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合《結(jié)核病實驗室檢驗規(guī)程》[6]中TP 的相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)；②初次確診，且入組前未接受過相關(guān)治療；③年齡不低于18 歲；④入組前未接受氟喹諾酮類抗生素治療；⑤病歷及隨訪資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①長期接受免疫抑制劑治療；②伴有其他細(xì)菌感染性疾?。虎酆蠋陨窠?jīng)、免疫和血液系統(tǒng)疾病；④伴有嚴(yán)重的心臟、肝臟、肺等重要臟器疾病。本研究通過浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)（倫理審批號：倫審研20190620003），患者均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 M1 和M2 巨噬細(xì)胞表達(dá)水平檢測 所有患者入院時均檢測其胸腔積液中M1 和M2 巨噬細(xì)胞表達(dá)水平[7-8]：①入院時，抽取患者胸腔積液10ml，幵置于肝素抗凝管內(nèi)；②采取密度梯度離心法分離胸腔積液內(nèi)的單核細(xì)胞：將采集的胸腔積液，以1500r/min，離心10min，吸取下層的細(xì)胞沉淀與磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution，PBS）均勻混合后，將其小心、緩慢加入到Ficoll 分離液表面（切勿攪動），以2500r/min 離心20min 后，使用移液管將中間“云霧層”的單核細(xì)胞仔細(xì)、小心地抽出，再加入PBS 溶液，以1500r/min 離心10min 后，底層沉淀即為研究所需的胸腔積液單核細(xì)胞（mononuclear cells in pleural effusion，PFMC），使用PBS 溶液將所得的PFMC 洗滌2 次，以進行純化，之后在液氮中儲存；③常規(guī)復(fù)蘇PFMC，置于含有10%胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）的RP-MI1640細(xì)胞培養(yǎng)液中，在37℃、5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30min，取出，將細(xì)胞密度調(diào)節(jié)到1×105個/ml，吸取2ml 置于流式管，以800r/min 離心5min 后，棄去上清液，幵加入0.1ml 的PBS 重懸細(xì)胞，以抗人F4/80-APC、抗人CD86-FITC與抗人CD206-PE/Cy5.5標(biāo)記巨噬細(xì)胞，于4℃下避光培養(yǎng)30min，加入2 ml的PBS 洗滌細(xì)胞，以800r/min 離心10min 后，棄去上清液，幵加入0.2ml 的PBS 重懸細(xì)胞，混勻后使用0.22μm 的濾膜過濾，然后使用FACS Vantage SE流式細(xì)胞儀進行檢測分析，F(xiàn)4/80+CD86+為M1 巨噬細(xì)胞的表面分子標(biāo)志物，F(xiàn)4/80+CD206+為M2 巨噬細(xì)胞的表面分子標(biāo)志物，M1 和M2 巨噬細(xì)胞表達(dá)水平以陽性細(xì)胞比例表示。

1.2.2 預(yù)后判斷分組 所有患者出院后隨訪6 個月，采用胸部彩超檢查患者胸膜增厚及胸腔積液吸收情況。胸膜增厚：胸膜最厚處>3mm，胸腔積液吸收較差：胸腔積液最深處>5mm；胸膜增厚且胸腔積液吸收較差者提示預(yù)后不良（n=47）納入預(yù)后不良組，反之則提示預(yù)后良好（n=159）納入預(yù)后良好組[9]。

1.2.3 資料統(tǒng)計 收集可能導(dǎo)致TP 患者預(yù)后不良的相關(guān)因素：性別、年齡、BMI、發(fā)病至就診時間、吸煙、飲酒、糖尿病、胸腔積液部位、合幵肺結(jié)核、結(jié)核菌感染T 細(xì)胞斑點試驗（T-spot）結(jié)果、感染耐藥菌、胸腔積液量、胸腔積液蛋白、白細(xì)胞計數(shù)（white blood cell，WBC）、紅細(xì)胞沉降率（erythrocyte sedimentation rate，ESR）、乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）、M1 及M2 巨噬細(xì)胞表達(dá)水平、M1/M2 巨噬細(xì)胞比例。

1.2.4 觀察指標(biāo) ①單因素分析可能影響TP 患者預(yù)后的相關(guān)因素；②多因素Logistic 回歸分析影響TP患者預(yù)后的危險因素；③受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線評估M1/M2 巨噬細(xì)胞比例對TP 患者預(yù)后不良的預(yù)測價值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 24.0 統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，以獨立樣本t檢驗進行比較，計數(shù)資料以例數(shù)（百分率）[n（%）]表示，以χ2檢驗進行比較，多因素Logistic 分析明確影響TP 患者預(yù)后的危險因素，繪制ROC 曲線評估M1/M2 巨噬細(xì)胞比例對TP 患者預(yù)后不良的預(yù)測價值。以P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 單因素分析可能影響TP 患者預(yù)后的相關(guān)因素

兩組患者性別、年齡、BMI、吸煙、飲酒、糖尿病、高血壓、合幵肺結(jié)核與否、T-spot 試驗結(jié)果、胸腔積液量、胸腔積液蛋白、WBC、LDH 比較（P>0.05）。相較于預(yù)后良好組，預(yù)后不良組因延誤最佳診療時間，患者發(fā)病至醫(yī)院就診時間明顯更長，感染耐藥菌占比、ESR、M1 及M2 巨噬細(xì)胞表達(dá)水平明顯更高，M1/M2 巨噬細(xì)胞比例明顯更高，向M1 型極化增多（P<0.05），見表1。

表1 單因素分析可能影響TP 患者預(yù)后的相關(guān)因素

2.2 多因素Logistic 回歸分析影響TP 患者預(yù)后的危險因素

經(jīng)多因素Logistic 回歸分析顯示，發(fā)病至就診時間、感染耐藥菌、ESR、M1 及M2 巨噬細(xì)胞表達(dá)水平、M1/M2 巨噬細(xì)胞比例是影響TP 患者預(yù)后不良的危險因素（P<0.05），見表2。

表2 多因素Logistic 回歸分析影響TP 預(yù)后的危險因素

2.3 M1/M2 巨噬細(xì)胞比例對TP 患者預(yù)后不良的預(yù)測價值

ROC 曲線分析結(jié)果顯示，M1 及M2 巨噬細(xì)胞表達(dá)水平預(yù)測TP 患者預(yù)后不良的曲線下面積分別為0.783、0.829，敏感度分別為70.45%、81.47%，特異性分別為79.62%、73.44%，M1/M2 巨噬細(xì)胞比例預(yù)測TP 患者預(yù)后不良的AUC 為0.921、敏感度為92.59%、特異性為84.96%，均明顯大于二者單獨預(yù)測（P<0.05），見圖1。

圖1 M1/M2 巨噬細(xì)胞比例對TP 患者預(yù)后不良的預(yù)測價值ROC 曲線分析

3 討論

結(jié)核性滲出性胸膜炎發(fā)病急劇，患者常表現(xiàn)為持續(xù)數(shù)日甚至數(shù)周的高熱，其體溫高低與胸腔積液細(xì)胞數(shù)和胸腔積液量常呈正比，同時常伴有盜汗、消瘦等結(jié)核中毒癥狀，且隨胸腔積液增多，患者可出現(xiàn)明顯的胸悶氣急等癥狀[10]。早期就診，有助于臨床及時通過胸腔穿刺抽液和注入尿激酶等藥物溶解纖維蛋白，有利于胸腔閉式引流胸腔積液，減少蛋白沉積粘連于胸膜表面，造成胸膜對胸腔積液的吸收能力下降而導(dǎo)致胸膜增厚、胸膜粘連引發(fā)呼吸困難的機會。部分患者接受治療后，仍會出現(xiàn)不同程度的胸膜增厚及胸腔積液反復(fù)等，影響TP 患者生活質(zhì)量[11-12]。

本研究通過多因素Logistic 分析顯示，發(fā)病至就診時間、感染耐藥菌、ESR、M1 及M2 巨噬細(xì)胞表達(dá)水平、M1/M2 巨噬細(xì)胞比例是影響TP 患者預(yù)后不良的危險因素，這與Yan 等[13]研究一致。分析其原因，在炎癥、病理情況下ESR 可明顯加快，故測定ESR 有助于臨床了解TP 病情進展，但臨床多聯(lián)合腺苷脫氨酶（adenosine deaminase，ADA）等檢測結(jié)果共同分析[14]。而感染耐藥菌的患者，對藥物的敏感度降低，導(dǎo)致部分藥物的療效降低，甚至于無效，增加臨床治療難度，影響臨床療效及預(yù)后。巨噬細(xì)胞是結(jié)核分枝桿菌感染的第一道防線，結(jié)核分枝桿菌感染可刺激巨噬細(xì)胞生成多種細(xì)胞因子，以提高巨噬細(xì)胞自身的免疫應(yīng)答能力，激活T 細(xì)胞，分泌促炎因子，從而進一步激發(fā)巨噬細(xì)胞活性[15-16]。激活的巨噬細(xì)胞可極化為M1與M2 兩種形態(tài)，其中經(jīng)典激活途徑下活化的巨噬細(xì)胞為M1 巨噬細(xì)胞，可增強吞噬殺菌、促進炎癥反應(yīng)活性，激活多種促炎因子，啟動適應(yīng)性細(xì)胞免疫應(yīng)答，以清除病原體；替代激活途徑下活化的巨噬細(xì)胞為M2 巨噬細(xì)胞，可抑制炎癥反應(yīng)，能合成、分泌抑炎因子，促進體液免疫應(yīng)答，加速組織的再生和修復(fù)[17]。大量巨噬細(xì)胞向M1 型極化可增強吞噬殺菌功能，促進炎癥反應(yīng)活性，導(dǎo)致機體免疫處于超敏狀態(tài)，可炎性刺激胸膜，導(dǎo)致纖維蛋白組織大量增生、沉淀，出現(xiàn)胸膜增厚、板層胸膜、胸膜鈣化，嚴(yán)重?fù)p害患者的肺功能[18]。Wu 等[19]研究顯示，M1/M2 巨噬細(xì)胞表達(dá)失衡、向M1 型極化增多可加重機體炎癥反應(yīng)，促使疾病進一步惡性發(fā)展，影響TP 患者預(yù)后。

此外，本研究中M1 及M2 巨噬細(xì)胞表達(dá)水平預(yù)測TP 患者預(yù)后不良的AUC 分別為0.783、0.829，敏感度分別為 70.45%、81.47%，特異性分別為79.62%、73.44%，而M1/M2 巨噬細(xì)胞比值預(yù)測TP患者預(yù)后不良的AUC 為0.921、敏感度為92.59%、特異性為84.96%，均明顯大于二者單獨預(yù)測價值。分析其可能原因：M1 和M2 巨噬細(xì)胞在胸腔積液巨噬細(xì)胞中所占比例各有差異，試驗方法和標(biāo)志物的選擇對檢測結(jié)果有較大的影響，導(dǎo)致檢測結(jié)果的重復(fù)性較差；而檢測M1/M2 巨噬細(xì)胞比例，可有效降低實驗數(shù)據(jù)偏差，重復(fù)性高，預(yù)測價值較高。孫峰等[20]采用流式細(xì)胞術(shù)檢測抗結(jié)核治療前后胸腔積液中M1 與M2 巨噬細(xì)胞，治療后M1、M2 巨噬細(xì)胞均較治療前增多，但M2 轉(zhuǎn)化增高更明顯，M1/M2比值顯著降低，提示M1/M2 巨噬細(xì)胞比例高對TP患者預(yù)后不良的預(yù)測價值更高，且具有較高的特異性與敏感度，與本研究結(jié)果一致。

綜上所述，發(fā)病至就診時間、ESR、M1 及M2巨噬細(xì)胞表達(dá)水平、M1/M2 巨噬細(xì)胞比例等均與TP患者預(yù)后不良密切相關(guān)，其中M1/M2 巨噬細(xì)胞比例高對TP 患者預(yù)后不良的預(yù)測價值更高，更有助于臨床判斷TP 預(yù)后，及時制定幵實施相關(guān)防治措施，從而改善臨床治療效果及預(yù)后，提高患者生存質(zhì)量。