蔣麗元，葉恬恬，楊俊文

1.杭州市中醫(yī)院針灸康復科，浙江杭州 310007；2.浙江中醫(yī)藥大學第一臨床醫(yī)學院，浙江杭州 310053；3.浙江中醫(yī)藥大學第二臨床醫(yī)學院，浙江杭州 310053

美尼爾綜合征（Meniere’s disease，MD）是一種特發(fā)性的內耳疾病，常單側起病，表現(xiàn)為低頻-中頻聽力下降、耳鳴、耳悶脹感，陣發(fā)性眩暈，嚴重影響患者生活質量[1]。近年來流行病學調查顯示，其發(fā)病率為190/100000，男女性發(fā)病比例為1.89∶1，發(fā)病率隨著年齡增長呈逐漸升高趨勢[2]。MD 的基本病理改變是內耳膜迷路積水。研究表明，與罹患慢性中耳炎的患者相比，難治性MD 患者血漿的血管加壓素（arginine vasopressin，AVP）升高。采用內淋巴囊引流術治療難治性MD，分別于術后1 周、1 年、2 年期觀察MD 患者眩暈及感音神經(jīng)性耳聾發(fā)作情況，并檢測患者血漿AVP 水平，發(fā)現(xiàn)其眩暈及感音神經(jīng)性耳聾發(fā)作與血漿AVP 水平呈現(xiàn)正相關性[3]。實驗研究表明，AVP 是一種9 肽類激素，主要在下丘腦的視上核和室旁核中合成，經(jīng)由下丘腦-垂體束到達神經(jīng)垂體后釋放入血，AVP 通過與其G 蛋白藕聯(lián)受體結合發(fā)揮生物學作用。AVP 在內耳的作用主要涉及離子通道及水通道機制[4]。血管加壓素受體2（vasopressin type 2 receptor, V2R）是G-蛋白偶聯(lián)受體家族成員之一，其基因突變或表達異常與多種疾病相關，在腎臟疾病的研究較為深入[5]。水通道蛋白2（aquaporin 2，AQP2）是水通道蛋白家族成員中對AVP 敏感的亞型之一[6]。上皮細胞鈉通道（epithelial sodium channel，ENaC）主要參與AVP 在內耳中的離子通道調節(jié)機制，ENaC 主要由α、β、γ3 個亞單位組成。研究表明，AVP 與V2R 結合后，引起cAMP 表達上調，使ENaC-α 表達及功能增強，促使離子濃度發(fā)生變化及水液轉運，參與內耳膜迷路積水的發(fā)生、發(fā)展過程[7-8]。此外，AVP 通過與耳蝸及內淋巴囊中的V2R結合，激活AVP-AQP2系統(tǒng)，使內耳中的AQP2 mRNA 及蛋白表達增加，內淋巴腔內液體增加，發(fā)生膜迷路積水。針刺具有改善MD患者眩暈發(fā)作的作用，而關于其具體機制未明[9]。本研究通過AVP 腹腔注射建立膜迷路積水豚鼠模型，從耳蝸V2R、AQP2、ENaC-α 蛋白角度探討針刺調節(jié)膜迷路積水豚鼠耳蝸積水程度的潛在機制。

圖1 3 組豚鼠耳蝸（HE 染色圖片，×40，箭頭所示為前庭膜）

1 資料與方法

1.1 實驗動物與分組

健康清潔級6 周齡雄性白毛紅目豚鼠36 只，體質量為350～400g，購自新昌縣大市聚欣健兔場[生產(chǎn)許可證號：SCXK（浙）2013-0060]，飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學動物實驗研究中心，清潔級動物實驗室。飼養(yǎng)環(huán)境為恒溫[（22±1）℃]、恒濕（65%～70%），每日光照12h，所有豚鼠可自由進食水，適應性飼養(yǎng)3 日后按體質量隨機分為正常組、模型組、電針刺組，每組12 只。實驗過程中遵循科技部頒布的《關于善待實驗動物的指導性意見》。該項目實驗過程符合動物保護、動物福利和倫理原則，動物實驗倫理由浙江中醫(yī)藥大學動物實驗管理與倫理委員會審批通過（倫理審批號：IACUC-20180820-06）。

1.2 主要試劑與儀器

醋酸去氨加壓素（deamino arginine vasopressin，DDAVP，批準文號∶20170701，海南中和制藥股份有限公司，規(guī)格：1ml∶4μg）；V2R 抗體（批準文號：ab213708，英國Abcam 公司，規(guī)格：100μl）；AQP2抗體（批準文號：ab199975，生產(chǎn)單位：英國Abcam公司，規(guī)格：10μl）；ENaC-α 抗體（批準文號：PA1-920A，美國Thermo Fisher 公司，規(guī)格：100μg）；GAPDH 抗體（批準文號：ab181602，英國Abcam 公司，規(guī)格：100μl）；一次性無菌針灸針（0.22mm×13.00mm，北京中研太和醫(yī)療器械有限公司）；HANS-100A 型韓氏疼痛治療儀（南京濟生醫(yī)療科技有限公司）。

1.3 模型制備方法

模型組及電針刺組豚鼠給予醋酸去氨加壓素腹腔注射，先按照4μg/kg 給藥，每日1 次，連續(xù)7 日，第8 日起按照6μg/kg 給藥，每日1 次，連續(xù)給藥3 日，共給藥10 日[10]。造模成功以病理切片觀察到耳蝸積水為標準[11]。

1.4 干預方法

電針刺組豚鼠以自制的木板與布條結合的固定裝置固定，用0.22mm×13.00mm 針灸針直刺左側“聽宮”（位于耳屏前凹陷處）穴3～5mm，平刺“百會”（位于顱頂骨正中央）穴3～5mm，連接HANS-100A 型韓氏疼痛治療儀，采用連續(xù)波100Hz，電針強度1mA，干預時間20min。豚鼠“百會”、“聽宮”穴定位參照《實驗針灸學》[12]中的描述，采用動物比較學方法定位。正常組、模型組豚鼠裝入固定裝置中固定20min。每日干預1 次，連續(xù)10 日。

1.5 檢測指標及方法

1.5.1 蘇木精-伊紅染色法觀察豚鼠耳蝸形態(tài)學變化 豚鼠斷頭處死后，剪取左側耳蝸組織，將耳蝸周圍組織剔除干凈，放入4%多聚甲醛溶液中固定，經(jīng)脫鈣，修塊后石蠟包埋盒中包埋，于切片機上沿耳蝸蝸軸中央平面切成約4.5μm 的薄片，選取耳蝸最大切面，制作豚鼠耳蝸切片，脫蠟后蘇木精-伊紅染色（hematoxylin-eosin staining, HE）封片，光學顯微鏡下觀察并測量耳蝸中階與前庭階面積。計算耳蝸中階/（耳蝸中階+前庭階面積）的比值R 值，即可判定耳蝸積水程度，R 值越大，積水程度越重，反之越輕[11]。

1.5.2 免疫印跡試驗（Western blot，WB）法檢測豚鼠耳蝸V2R、AQP2 及ENaC-α 蛋白表達 豚鼠斷頭處死后，于冰上迅速剝離出左側耳蝸，加入液氮研磨后放入–80℃冰箱內保存。通過Western blot 法測定耳蝸V2R、AQP2 及ENaC-α 蛋白含量。配制8%～12%分離膠和5%濃縮膠，每個孔60μg 總蛋白進行上樣，每孔10～15μl，濃縮膠60V，分離膠80V 進行電泳，轉膜，封閉。一抗溶液（V2R 濃度1∶800，AQP2 濃度1∶400，GAPDH 濃度1∶10000）4℃冰箱中過夜孵育；二抗溶液（1∶5000）室溫條件下孵育60min。顯影液顯影，曝光儀中顯影曝光，使用Image J軟件分析V2R、AQP2及ENaC-α蛋白與內參GAPDH的灰度值，以V2R、AQP2 及ENaC-α 蛋白與內參GAPDH 的灰度值比值作為目標蛋白的相對表達量。

1.6 統(tǒng)計學方法

應用SPSS 20.0 統(tǒng)計學軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布，組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD 檢驗法，計數(shù)資料以例數(shù)（百分率）[n（%）]表示。以P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 一般行為學觀察

正常組豚鼠精神狀態(tài)佳，行動步態(tài)自如，自活動多，對聲音反應靈敏。模型組豚鼠普遍出現(xiàn)精神差，行動遲緩，活動減少，對聲音反應遲鈍。電針刺組豚鼠精神狀況、行動、自發(fā)活動與模型組無差別，但對聲音反應敏感度與模型組比較，有所改善。

2.2 電針對耳蝸膜迷路積水的影響

正常組耳蝸前庭膜平直無膨隆，無積水。模型組耳蝸前庭膜隆起，出現(xiàn)膜迷路積水。電針刺組前庭膜可見隆起，但膨隆程度較正常組減輕，見圖1。

與正常組比較，模型組豚鼠R 值升高（P<0.01），與模型組比較，電針刺組豚鼠R 值下降（P<0.01），見表1。

表1 3 組豚鼠耳蝸R 值、V2R、AQP2、ENaC-α 相對表達量比較（±s , n=6）

表1 3 組豚鼠耳蝸R 值、V2R、AQP2、ENaC-α 相對表達量比較（±s , n=6）

注：與正常組比較，*P<0.01；與模型組比較，#P<0.01

分組 R 值 V2R AQP2 ENaC-α正常組 0.28±0.04 2.00±0.22 1.81±0.20 2.16±0.08模型組 0.49±0.06* 7.50±0.25* 7.85±0.14* 7.51±0.49*電針刺組 0.33±0.043# 5.09±0.183# 4.72±0.29# 4.73±0.15#

2.3 電針對膜迷路積水模型豚鼠耳蝸V2R蛋白表達的影響

與正常組比較，模型組耳蝸V2R 蛋白表達明顯升高（P<0.01）；與模型組比較，電針刺組V2R 蛋白表達量降低（P<0.01），見表1、圖2。

圖2 3 組豚鼠耳蝸V2R、AQP2、ENaC-α 蛋白表達的比較（WB 法）

2.4 電針對膜迷路積水模型豚鼠耳蝸AQP2 蛋白表達的影響

與正常組比較，模型組耳蝸AQP2 蛋白表達明顯升高（P<0.01）；與模型組比較，電針刺組AQP2蛋白表達量降低（P<0.01），見表1、圖2。

2.5 電針對膜迷路積水模型豚鼠耳蝸ENaC-α 蛋白表達的影響

與正常組比較，模型組耳蝸ENaC-α 蛋白表達明顯升高（P<0.01）；與模型組比較，電針刺組ENaC-α蛋白表達量降低（P<0.01），見表1、圖2。

3 討論

從中醫(yī)學來看，針刺耳周及頭部穴位可治療耳部疾病有相關理論支撐。聽宮穴首次提出在經(jīng)典古籍《靈樞》中“刺其聽宮，中其眸子，聲聞于耳，此其輸也”。聽宮別名多所聞穴、多聞穴，是手太陽小腸經(jīng)腧穴，圍繞耳前，亦為手足少陽、手太陽交會穴，刺之能通竅活絡聰耳竅。《勝玉歌》：“頭痛眩暈百會好。”《針灸大成》亦描述百會主治，云：“頭痛目眩，食無味，百病皆治。”在文獻統(tǒng)計的治療MD 常用腧穴中，百會穴使用頻率最高[13]。百會配伍聽宮是治療內耳眩暈的常用組穴。針刺兩穴，有助于調整耳內微循環(huán)，改善水液代謝功能而止眩暈，并恢復聽覺[14]。本研究結果顯示，電針刺“百會”“聽宮”穴能顯著減輕膜迷路積水模型豚鼠的耳蝸積水程度，與課題組前期研究結果一致[15]。本研究中，電針頻率采用的100Hz，其依據(jù)主要基于課題組前期的研究工作基礎。筆者所在課題組前期研究工作中采用假電針及不同頻率電針（2Hz、15Hz、100Hz）干預膜迷路積水，結果顯示，假電針及2Hz、15Hz、100Hz 電針均有良好的治療作用。各治療組間比較，100Hz 電針療效最佳，作為前期工作的延續(xù)，故選用100Hz 作為電針干預頻率。

本實驗運用AVP 腹腔注射誘導膜迷路積水豚鼠模型，AVP 腹腔注射后通過AVP-V2R-水/離子蛋白信號通路引起耳蝸膜迷路內淋巴液增多，造成膜迷路積水[16]。本研究中與正常組豚鼠相比，膜迷路積水豚鼠耳蝸積水程度增加，耳蝸V2R、AQP2 及ENaC-α 蛋白表達升高，與文獻報道結果一致，與MD 膜迷路積水病理改變相符，說明AVP 成功復制了MD 病理特征，是較為理想的MD 膜迷路積水模型[7,17]。本研究中，與模型組相比，電針刺組R 值下降，與既往研究結果一致，與模型組相比，電針刺組耳蝸V2R、AQP2 及ENaC-α 蛋白表達降低，說明電針通過調節(jié)耳蝸水與離子蛋白表達參與了MD 膜迷路積水的治療[18-20]。

研究表明，AVP 通過與V2R 受體結合，激活其下游AQP2，調控水液代謝平衡。V2R 基因缺失或表達水平下降與尿崩癥發(fā)生密切相關。過表達則有可能發(fā)生抗利尿激素分泌失調綜合征[5]。受啟發(fā)于腎臟病的研究，研究者在接受內淋巴管阻塞手術的MD患者內耳內淋巴囊中檢測到了V2R、AQP2 的表達，并通過動物實驗證實了AVP-V2R-AQP2 信號通路參與了內耳水液代謝的調節(jié)，與內耳膜迷路積水的發(fā)生、發(fā)展密切相關[21-23]。ENaC-α 通道主要位于上皮細胞，是允許Na+流過，維持鹽和水體內平衡的重要離子通道蛋白。多種體液因子如腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)、表皮生長因子、AVP 均對ENaC-α 蛋白表達有調控作用[24]。在多種情況下，腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)與AVP 系統(tǒng)被相同的刺激共同激活，在多個水平上相互影響，參與ENaC-α 的表達調控，實現(xiàn)水液代謝調節(jié)作用[24-25]。腎臟的研究中，AVP 對AQP2 及ENaC-α 表達調控亦存在交互作用。即AVP 與V2R 結合后，通過調控AQP2 的表達使腎臟集合管對水的重吸收增加，尿滲透壓增加，尿流量減少，尿液濃縮AVP 又可以激活ENaC-α 的表達。AVP 對ENaC-α 的刺激通過促進尿濃度在水穩(wěn)態(tài)中起著重要作用[24]。文獻中少見AVP-V2R-水/離子蛋白信號通路在人體腎以外器官水液代謝失衡性疾病中的研究。本實驗中，與正常組比較，膜迷路積水模型組豚鼠耳蝸V2R、AQP2 及ENaC-α 蛋白表達上調，說明其參與了內耳膜迷路積水的發(fā)生過程。電針刺后引起V2R、AQP2 及ENaC-α 蛋白表達下調，說明降低耳蝸V2R、AQP2 及ENaC-α 蛋白表達可能是電針調節(jié)膜迷路積水模型豚鼠耳蝸積水程度的潛在機制。

綜上所述，電針刺可改善膜迷路積水豚鼠耳蝸積水程度，其機制可能與下調耳蝸V2R、AQP2 及ENaC-α 蛋白表達有關，本研究結果為該法的臨床運用提供了實驗支持，但電針刺降低耳蝸V2R、AQP2及ENaC-α 蛋白表達的相關環(huán)節(jié)還有待進一步研究，AVP-V2R-AQP2/ENaC-α 信號通路將是其切入點之一。