錢晶，王凡凡，萬露露，楊加樂，施學智，童華生*，周偉梁

1廣州中醫(yī)藥大學研究生院，廣東廣州 510000；2南部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院重癥醫(yī)學科，廣東廣州 510000；3南方醫(yī)科大學第一臨床醫(yī)學院，廣東廣州 510000；4廣州中醫(yī)藥大學深圳臨床醫(yī)學院，廣東深圳 518000；5南部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院急診醫(yī)學科，廣東廣州 510000

近年來，全球極端氣候事件頻發(fā)，高溫日數(shù)增加，中暑的發(fā)病率隨之增長。重癥中暑伴高熱、器官衰竭或嚴重代謝紊亂等常危及患者生命[1]，即使接受重癥監(jiān)護治療，患者病死率仍居高不下。尸檢結果顯示，重癥中暑死亡患者的多個器官均有廣泛血栓形成，嚙齒類及狒狒重癥中暑動物模型體內(nèi)凝血激活，導致彌散性血管內(nèi)凝血(disseminated intravascular coagulation，DIC)及組織損傷[2-3]。即使治療及時，多數(shù)重癥中暑患者早期仍會出現(xiàn)多器官功能障礙，使長期殘疾及死亡的風險上升。重癥中暑多器官損傷由組織直接熱損傷、凝血功能障礙及多因素誘發(fā)的全身炎癥反應綜合征(systemic inflammatory response syndrome，SIRS)發(fā)展而來[4]，其器官損傷機制尚不完全清楚，凝血激活甚至DIC 可能是重癥中暑多器官損傷發(fā)生的關鍵機制，并與高病死率有關[4-6]。

重癥中暑凝血激活的啟動機制目前仍不清楚。組織因子(tissue factor，TF)又名凝血因子Ⅲ(F3)，是一種細胞膜跨膜糖蛋白，也是凝血酶生成的主要啟動因子[7]。TF 由多種細胞分泌至血液循環(huán)中可啟動凝血激活[8]，在DIC的發(fā)生中發(fā)揮核心作用[9]。正常情況下，血管內(nèi)皮細胞低水平表達TF，受不同刺激后可誘導TF表達增多[8]。Witkowski等[10]提出，血管內(nèi)皮細胞表達分泌TF在凝血及炎癥反應中發(fā)揮了重要作用。嚴重感染及炎癥釋放的炎性因子誘導內(nèi)皮細胞生成TF，亦有體外實驗佐證，TF介導凝血酶產(chǎn)生，使纖維蛋白原轉化為纖維蛋白，同時激活血小板釋放P-選擇素，促進TF進一步釋放[11]。此外，TF與凝血酶結合并激活不同細胞的蛋白酶激活受體(protease-activated receptors，PARs)，誘導更多細胞因子表達[12]。血管內(nèi)皮細胞TF參與炎癥反應主要經(jīng)細胞信號轉導途徑，而非激活凝血[13]。近年來，TF在炎癥及凝血反應中的聯(lián)結樞紐功能日益得到研究者們的重視。

臨床病例分析及動物疾病模型顯示，重癥中暑宿主體內(nèi)TF 上升，驗證了TF 對重癥中暑誘發(fā)凝血反應具有重要作用[3]。重癥中暑患者體內(nèi)的血管內(nèi)皮損傷標志物血管性血友病因子(von Willebrand factor，vWF)及內(nèi)皮素增加，表明存在內(nèi)皮損傷[14-15]，但現(xiàn)有研究成果無法明確重癥中暑對血管內(nèi)皮細胞本身的影響。TF是炎癥與凝血反應的重要聯(lián)結，在被激活的單核細胞及受損的血管內(nèi)皮細胞表面均有表達，但循環(huán)TF 的具體細胞來源尚不清楚[16]。重癥中暑作為一種劇烈的炎癥及凝血反應狀態(tài)，TF 的表達分泌是否源自血管內(nèi)皮細胞更是未知。本研究通過建立體內(nèi)外熱打擊模型，初步探討熱打擊血管內(nèi)皮細胞TF早期表達分泌的規(guī)律。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 DMEM 高糖培養(yǎng)基、胎牛血清、CO2培養(yǎng)箱(美國賽默飛世爾科技公司)，細胞培養(yǎng)雙抗溶液(青霉素-鏈霉素溶液，美國HyClone 公司)；BCA蛋白濃度測定試劑盒、彩色預染蛋白Marker(中國白鯊公司)。12.5%聚丙烯酰胺凝膠快速制備試劑盒(上海雅酶生物科技有限公司)，兔TF 單抗(武漢愛博泰克生物科技有限公司，A4395)、兔TF 多抗(北京博奧森生物科技有限公司，bs-4690R)、山羊抗兔IgG DyLight?488(ab96899)及山羊抗兔IgG(ab97080)購自英國Abcam 公司，GAPDH 單克隆抗體(美國Proteintech 公司，60004-1-Ig)，山羊抗小鼠IgG(北京中杉金橋生物技術有限公司，ZB-2305)。含DAPI 抗熒光衰減封片劑(北京索萊寶科技有限公司)。去除基因組DNA 實時熒光定量PCR(RT-qPCR)專用反轉錄試劑(日本TaKaRa 公司，RR047A)，SYBR Green Pro Taq HS預混型qPCR試劑盒(湖南艾科瑞生物工程有限公司，AG11701)，Rotor-Gene RT-qPCR 儀(德國Qiagen 公司)。人TF 酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒、小鼠TF ELISA試劑盒(武漢貝茵萊生物科技有限公司)。三氣培養(yǎng)箱(上海力新儀器有限公司)，動物專用培養(yǎng)箱(寧波戴維醫(yī)療器械有限公司)，動物專用體溫計(中國康寧公司)；光學顯微鏡(日本Olympus 公司)，熒光倒置顯微鏡(德國Leica 公司)，臺式離心機(日本Kubota公司)，高速冷凍離心機(德國Eppendorf公司)。

1.2 動物實驗

1.2.1 實驗動物 30只8～12周齡SPF級雄性C57BL/6小鼠(體重20～25 g)購自廣州南方醫(yī)大實驗動物科技發(fā)展有限公司[動物合格證編號：SCXK(粵)2021-0041]。實驗前動物自由進食進水，飼養(yǎng)于安靜、恒溫、恒濕的潔凈環(huán)境，12 h 光照及12 h 黑暗交替變化，使用動物專用測溫計測量核心體溫。本實驗獲南部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院實驗動物倫理委員會審核批準(動物倫理審查編號：2021111801)，實驗過程符合國家及單位有關實驗動物的管理及使用規(guī)定。

1.2.2 熱打擊小鼠模型建立 根據(jù)隨機數(shù)字表法，將30 只C57BL/6 小鼠分為5 組：對照組與熱打擊后復溫0、3、6、9 h 組(n=6)。熱打擊前30 min 小鼠禁食禁水。動物專用孵箱溫度設置為39 ℃，相對濕度為60%，將熱打擊組小鼠放入達到熱打擊條件的孵箱內(nèi)，每隔15 min 測量小鼠核心體溫，達42.5 ℃時即認為發(fā)生重癥中暑[17]。將小鼠移出孵箱，復溫3、6、9 h組小鼠置于原正常飼養(yǎng)環(huán)境，自由進食進水。

1.2.3 器官組織切片HE染色 熱打擊造模完成后采血，頸椎脫臼法處死小鼠，立即解剖留取肝、腎及肺組織，使用4%多聚甲醛固定，脫水、包埋制成石蠟塊后切片，并進行HE染色，正置光學顯微鏡下觀察各組織病理學改變并拍照。

1.2.4 RT-qPCR檢測器官TFmRNA相對表達水平取肝臟、肺臟及腎臟組織(10～25 mg)置于潔凈EP管，徹底剪碎組織，加入1 ml Trizol吹打混勻，直至無肉眼可見大顆粒組織塊，靜置5～10 min，Trizol 法提取組織總RNA。測定RNA 濃度后用RR047A 試劑盒反轉錄為cDNA。采用AG11701 試劑盒配制反應體系，在實時定量PCR儀上機完成qPCR反應。每管反應體系為20 μl，包含10 μl 2×qPCR試劑、2 μl cDNA模板、0.4 μl 引物F(10 μmol/L)、0.4 μl 引物R(10 μmol/L)、7.2 μl DEPC水。實時定量PCR儀反應條件：95 ℃預變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃擴增延伸反應40 s，重復40次循環(huán)。以磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)作為內(nèi)參照。采用2-ΔΔCt法計算TFmRNA 表達水平。引物序列見表1。

表1 小鼠組織RT-qPCR引物序列Tab.1 RT-qPCR Primer sequence for mouse tissues

1.2.5 ELISA法檢測小鼠血漿TF水平 腹腔注射1%戊巴比妥鈉(50 mg/kg)麻醉小鼠，摘除眼球取血法采集小鼠血液樣本，置于含EDTA 的EP 管，在室溫下以3000 r/min 離心15 min，收集上層血漿，使用ELISA試劑盒檢測小鼠血漿TF水平。

1.3 細胞實驗

1.3.1 細胞培養(yǎng)及體外熱打擊刺激 人臍靜脈內(nèi)皮細胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)購自武漢普諾賽生命科技有限公司。在37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，使用DMEM 高糖培養(yǎng)基(含有10%胎牛血清及1%雙抗)。將細胞分為對照組與熱打擊復溫0、3、6、9 h 組，將HUVECs 置于42 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中3 h進行熱打擊，結束后立即轉移至常規(guī)培養(yǎng)箱(37 ℃、5% CO2)中復溫。

1.3.2 細胞總蛋白及細胞培養(yǎng)上清蛋白提取 收集各組細胞及細胞培養(yǎng)上清。使用足量4 ℃預冷蛋白裂解液在冰上充分裂解細胞，10 000 r/min離心20 min后提取細胞總蛋白。將細胞培養(yǎng)上清以3000 r/min離心5 min，采用三氯乙酸沉淀蛋白法提取細胞培養(yǎng)上清蛋白[18]，用適量蛋白裂解液將蛋白沉淀重懸成蛋白溶液保存。

1.3.3 Western blotting 檢測HUVECs 中TF 的表達水平 采用BCA 法檢測細胞裂解蛋白溶液及細胞培養(yǎng)上清蛋白提取溶液中的蛋白濃度，取蛋白樣品溶液，加入1/4 體積的蛋白上樣緩沖液(5×)混勻后，100 ℃加熱5 min 使蛋白變性。12.5%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，再進行轉膜、封閉、一抗(A4395)孵育過夜、二抗(ab97080)孵育、洗膜及顯影。

1.3.4 ELISA 檢測HUVECs 培養(yǎng)上清中TF 濃度 將細胞培養(yǎng)上清以1000×g離心10 min，采用ELISA 法檢測HUVECs培養(yǎng)上清中的TF濃度。

1.3.5 RT-qPCR 檢測HUVECs 中TFmRNA 的表達水平 采用Trizol 法提取細胞總RNA，RT-qPCR 法測定TFmRNA的相對表達水平，細胞實驗所用引物序列見表2。

表2 人類細胞RT-qPCR引物序列Tab.2 Human cellular RT-qPCR Primer sequence

1.3.6 細胞免疫熒光化學法檢測HUVECs 細胞膜表面TF表達水平 實驗前于35 mm玻底培養(yǎng)皿接種細胞，熱打擊后棄培養(yǎng)基，使用4 ℃預冷的PBS 緩沖液洗滌細胞3 次，使用4 ℃預冷的4%多聚甲醛在冰上固定細胞30 min 后洗滌，依次進行抗原封閉、一抗(bs-4690R)孵育過夜、熒光二抗(ab96899)避光孵育，使用含DAPI抗熒光衰減封片劑染核，于倒置熒光顯微鏡下觀察并拍照，使用ImageJ軟件進行分析。

1.4 統(tǒng)計學處理 采用GraphPad Prism 8.0.2軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料均符合正態(tài)分布，以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用Dunnett-t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 各組小鼠不同器官TFmRNA表達水平比較 相較于對照組小鼠，熱打擊復溫0、3 h 組的腎TFmRNA (1.719±0.018、1.241±0.178vs.1.000±0.063)、復溫3 h 組的肺TFmRNA (2.444±0.511vs.1.000±0.106)及復溫6 h 組的肝TFmRNA (7.312±0.618vs.1.000±0.147)相對表達量均升高，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。腎及肺TFmRNA 表達量在熱打擊結束時即出現(xiàn)上調，肝TFmRNA表達量在復溫6 h時明顯上調(圖1)。

圖1 各組小鼠腎(A)、肺(B)及肝(C)組織TF mRNA表達量比較(n=3)Fig.1 Comparison of TF mRNA expression levels in kidney (A), lung (B), and liver (C) tissues of mice in each group (n=3)

2.2 各組小鼠血漿TF水平比較 ELISA檢測結果顯示，熱打擊小鼠復溫0、3、6、9 h組血漿TF水平均較對照組小鼠升高[(132.426±17.920) pg/ml、(119.400±10.267) pg/ml、 (107.374±13.495)pg/ml、 (163.767±22.810) pg/mlvs.(75.479±13.831) pg/ml，P<0.01]，盡管復溫3、6 h小鼠血漿TF水平有所下降，但熱打擊組小鼠整體血漿TF水平仍高于對照組(圖2)。

圖2 各組小鼠血漿TF含量比較(n=6)Fig.2 Comparison of plasma TF content in each group of mice (n=6)

2.3 各組小鼠器官組織病理學觀察 對照組小鼠各組織未見明顯病理損傷。熱打擊組小鼠肺、腎、肝均出現(xiàn)組織結構破壞、出血及炎癥表現(xiàn)。重癥中暑(即復溫0 h組)小鼠腎臟皮質、髓質部均存在出血現(xiàn)象，腎間質小血管及毛細血管明顯擴張，有充血出血、血栓形成，腎間質紅細胞浸潤，腎小球結構有破壞(圖3A)。重癥中暑小鼠肺泡結構紊亂，細支氣管及終末細支氣管結構破壞、出血性滲出增多，上皮組織壞死脫落，血管周圍、肺間質炎癥細胞及紅細胞浸潤增多，復溫6、9 h 組小鼠肺泡隔明顯變細(圖3B)。重癥中暑小鼠肝小葉結構破壞明顯，有淤血征象，光鏡下可見肝小葉中央靜脈及肝竇擴張充血，有紅細胞充斥其間，肝細胞受壓萎縮，肝索變細(圖3C)。

2.4 體外熱打擊HUVECs持續(xù)表達分泌TF Western blotting 結果顯示，與對照組比較，熱打擊HUVECs不同復溫時長組細胞培養(yǎng)上清能穩(wěn)定持續(xù)檢測出TF，對照組細胞培養(yǎng)上清中未檢測出TF，提示熱打擊誘導血管內(nèi)皮細胞TF 胞外分泌可能(圖4A)。ELISA檢測結果顯示，熱打擊HUVECs復溫0、3、6、9 h 組細胞培養(yǎng)上清中TF 含量均明顯高于對照組[(36.309±4.101) pg/ml、(38.425±5.484) pg/ml、(41.655±4.380) pg/ml、 (43.586±4.718) pg/mlvs.(14.996±0.254) pg/ml，P<0.01，圖4B]。

圖4 各組HUVECs表達分泌TF水平比較Fig.4 Comparison of TF levels expressed and secreted by HUVECs in each group

細胞免疫熒光化學法檢測結果顯示，對照組HUVECs 細胞膜表面TF 熒光強度較弱，符合TF 在正常生理情況下的表達水平(圖5A)。熱打擊HUVECs 復溫0、3、6、9 h 組細胞膜表面TF 相對熒光強度明顯高于對照組(3.733±0.419、2.210±0.235、2.618±0.081、 4.636±0.373vs.1.000±0.214，P<0.01)，即熱打擊使HUVECs細胞膜表面結構性表達TF增強(圖5B)。

圖5 細胞免疫熒光化學檢測HUVECs細胞膜表面TF表達Fig.5 Cellular immunofluorescence chemical detection of TF expression on HUVECs cytomembrane surface

2.5 各組HUVECs的TFmRNA表達水平比較 提取熱打擊HUVECs 的mRNA 進行RT-qPCR 分析結果顯示，熱打擊復溫6、9 h 組的TFmRNA 相對表達量均明顯高于對照組(1.905±0.354、2.564±0.297vs.1.000±0.097，P<0.01，圖6)。

圖6 RT-qPCR檢測HUVECs中TF mRNA表達(n=3)Fig.6 RT-qPCR detection of TF mRNA expression in HUVECs(n=3)

3 討 論

重癥中暑具有高發(fā)病率、高死亡率和高致殘率的“三高”特征，被認為是最危險的熱相關疾病，DIC作為該疾病的常見伴隨高危事件，其病理機制的研究是攻克重癥中暑治療難題的關鍵環(huán)節(jié)之一。研究顯示重癥中暑DIC的發(fā)生發(fā)展與TF的表達分泌存在關聯(lián)，探索TF 的來源及作用是闡明重癥中暑DIC發(fā)病機制的研究基礎。

本研究中，重癥中暑小鼠多組織出現(xiàn)炎癥反應及凝血障礙；重癥中暑早期小鼠多組織TFmRNA表達增加，且其循環(huán)內(nèi)TF水平明顯升高；熱打擊血管內(nèi)皮細胞膜內(nèi)TF表達分泌增加，提示血管內(nèi)皮細胞可能是重癥中暑TF分泌的潛在來源之一。

本研究發(fā)現(xiàn)，重癥中暑小鼠組織發(fā)生出血性及炎性損傷，呈現(xiàn)炎性細胞浸潤、出血及血栓形成，一定程度上符合既往研究中重癥中暑導致多器官廣泛出血及血栓形成的DIC病理特征[19]。有研究發(fā)現(xiàn)，重癥中暑組織炎癥反應及凝血障礙與TF表達分泌增加有關[19-20]。Huisse 等[20]在2003 年巴黎熱浪期重癥中暑臨床病例中發(fā)現(xiàn)，患者體內(nèi)循環(huán)TF 水平升高。Roberts 等[19]在重癥中暑狒狒的血液及組織中均檢測出TF 含量明顯上升，并與細胞凋亡相關，提示TF是重癥中暑凝血反應啟動的潛在重要因素。本研究采用重癥中暑小鼠模型進一步證實了多組織TFmRNA 表達增加，血漿分泌TF 增加。此外，Bouchama 等[4]在重癥中暑狒狒模型中發(fā)現(xiàn)，重組線蟲抗凝蛋白c2(組織因子/凝血因子Ⅶ抑制劑)明顯改善了重癥中暑動物凝血紊亂狀態(tài)，進一步提示TF在重癥中暑凝血紊亂中發(fā)揮作用。

血液循環(huán)中TF的潛在來源廣泛，不同疾病患者體內(nèi)TF的來源各不相同[21]。Franco等[22]發(fā)現(xiàn)，內(nèi)毒素血癥患者血細胞(主要為單核細胞)TFmRNA 及蛋白誘導表達與高水平凝血酶-抗凝血酶復合物(凝血激活標志物)有關。膿毒癥狒狒的脾臟及主動脈血管內(nèi)皮細胞、膿毒癥小鼠的腎小球內(nèi)皮細胞均表達TF，血管內(nèi)皮細胞來源TF可能也在膿毒癥凝血中發(fā)揮了作用[23]。脂多糖體內(nèi)外刺激單核細胞及HUVECs 均可誘導TF表達，單核細胞及血管內(nèi)皮細胞被看作是內(nèi)毒素血癥TF 的兩個最有可能的來源[11]。目前重癥中暑表達分泌TF的細胞來源尚不十分清楚。體外熱打擊細胞模型顯示，熱打擊后不同復溫時間HUVECs 的TFmRNA 表達均有不同程度上調；細胞免疫熒光化學檢測表明，HUVECs 細胞膜表面TF的熒光強度持續(xù)升高。本研究還發(fā)現(xiàn)熱打擊HUVECs后，細胞培養(yǎng)上清分泌TF明顯增加，提示熱打擊可能誘導細胞中TF向分泌形式轉化，并可分泌至細胞外，由此推測血管內(nèi)皮細胞可能是重癥中暑TF表達分泌的重要來源。

熱打擊基于何種機制誘導血管內(nèi)皮細胞分泌型TF 的表達轉化是下一步研究的關鍵。Wu 等[24]提出蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)及p38在人肺動脈內(nèi)皮細胞TF的誘導表達分泌中發(fā)揮關鍵作用。血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)基于兩種途徑誘導HUVECs 中TF 的表達[7]，剪切力激活HUVECs 中早期生長反應因子-1(early growth response protein 1，Egr-1)誘導TF 表達上調[25]。多項研究表明，不同刺激誘導HUVECs表達TF均基于核因子-κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)[26-28]。然而熱打擊誘導血管內(nèi)皮細胞TF表達分泌的分子機制尚未見報道，也是本文的局限性所在。

綜上所述，本研究中重癥中暑小鼠多組織存在炎癥及凝血特征性病理損傷，驗證了組織及循環(huán)TF可能參與該病理損傷過程。體外熱打擊可能誘導血管內(nèi)皮細胞TF 向分泌型轉變，TF 分泌增加，提示血管內(nèi)皮細胞可能是重癥中暑TF的來源之一。探討熱打擊血管內(nèi)皮細胞表達分泌TF的分子機制及有關調控措施將是未來研究的重點。