康花民，李淑紅，邊玉璽，耿靜，劉紅娟，何志紅，金穎

（石家莊市人民醫(yī)院急診科，石家莊 050000）

缺血缺氧性腦損傷是目前臨床中常見(jiàn)的新生兒中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，其發(fā)病機(jī)制主要為母體和胎兒間血液循環(huán)及氣體交換障礙，進(jìn)而導(dǎo)致新生兒發(fā)生腦神經(jīng)元壞死、基底神經(jīng)節(jié)變性等病理改變，同時(shí)，缺血缺氧性腦損傷也是導(dǎo)致新生兒智力缺陷甚至終身殘障的重要原因之一[1]。然而，目前臨床中對(duì)于新生兒缺血缺氧性腦損傷的治療藥物有限且預(yù)后較差，給患兒家庭和社會(huì)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，因此對(duì)于新生兒缺血缺氧性腦損傷治療藥物的研發(fā)仍是當(dāng)前工作重點(diǎn)。核轉(zhuǎn)錄因子2（Nrf2）通路是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的與缺血缺氧性腦損傷密切相關(guān)的重要信號(hào)通路，Nrf2 通路及相關(guān)蛋白水平的異常是導(dǎo)致缺血缺氧性腦損傷發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵因素[2]，且研究證實(shí)調(diào)節(jié)Nrf2 通路可能是治療缺血缺氧性腦損傷有效方法[3]。通竅活血湯由麝香、川芎、赤芍等多種中藥材組成，具有活血通絡(luò)，清瘀散結(jié)等多種功效。有研究認(rèn)為通竅活血湯在腦損傷及神經(jīng)損傷的修復(fù)中存在較大潛力[4]，因此，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)研究通竅活血湯對(duì)于新生大鼠缺血缺氧性腦損傷的改善作用及機(jī)制，為通竅活血湯的藥理研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 藥品及試劑 通竅活血湯由麝香（批號(hào)210806）0.15 g、川芎（批號(hào)210601）3 g、赤芍（批號(hào)210423）3 g，桃仁（批號(hào)210816）9 g，紅花（批號(hào)210718）9 g，生姜（批號(hào)210919）9 g，大棗（批號(hào)210521）6 g，蔥白（批號(hào)210811）6 g，黃酒（批號(hào)190819）250 mL 組成（中藥飲片購(gòu)自北京同仁堂藥業(yè)有限公司），將川芎、赤芍、桃仁、紅花、生姜、大棗、蔥白置于黃酒中煎煮至150 mL，加入麝香繼續(xù)煎煮，沸騰兩次并濃縮至生藥含量為1 g/mL 的制劑； 神經(jīng)節(jié)苷脂（批號(hào)2106231） 購(gòu)自齊魯制藥有限公司；蘇木精-伊紅（HE）試劑盒（批號(hào)G1120）、超氧化物歧化酶（SOD）酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）試劑盒（批號(hào)BC0170）、丙二醛（MDA）ELISA 試劑盒（批號(hào)BC0025）及腫瘤壞死因子（TNF）-α ELISA 試劑盒（批號(hào)SEKR-0009）、BCA 試劑盒（批號(hào)PC0020）、白介素（IL）-1β ELISA試劑盒（批號(hào)SEKR-0002） 及IL-6 ELISA 試劑盒（批號(hào)SEKR-0005）購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；化學(xué)發(fā)光試劑盒（批號(hào)P0018）、組織裂解液（批號(hào)P0013）、PCR 試劑盒（批號(hào)D7260）購(gòu)自碧云天生物科技有限公司；RNA 提取試劑盒（批號(hào)WLA088）購(gòu)自沈陽(yáng)萬(wàn)類生物科技有限公司；GAPDH （批號(hào)ab181602）、核轉(zhuǎn)錄因子2（Nrf2，批號(hào)ab92946、血紅素氧合酶-1 （HO-1，批號(hào)ab68477）、Janus 激酶2（JAK2，批號(hào)ab108596）、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3（STAT3，批號(hào)ab68153）一抗、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔免疫球蛋白G（IgG，批號(hào)ab6721）購(gòu)自艾博抗貿(mào)易有限公司；血清可溶性內(nèi)皮細(xì)胞蛋白C受體（sEPCR）ELISA 試劑盒（批號(hào)EK-R38890）購(gòu)自上海酶研生物科技有限公司；可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白（sTM）ELISA 試劑盒（批號(hào)YE02629）購(gòu)自上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司、內(nèi)皮素（ET）-1 ELISA 試劑盒（批號(hào)CSB-E06979r-1） 購(gòu)自上海恒斐生物科技有限公司；PCR 引物設(shè)計(jì)及合成由賽默飛世爾科技有限公司完成。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 1 周齡SD 雄性大鼠，體質(zhì)量10～12 g，健康清潔級(jí)，購(gòu)自河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（冀）2022-001，動(dòng)物房溫度22～25 ℃，相對(duì)濕度40%～70%，每12 h 明暗交替光照。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 DB001 型Morris 水迷宮購(gòu)自北京智鼠多寶生物科技有限責(zé)任公司；Ⅸ83 熒光倒置顯微鏡購(gòu)自日本奧林巴斯；Gel Doc EZ 凝膠成像儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad 公司；himac CR22N 高速冷凍離心機(jī)購(gòu)自Eppendorf 艾本德中國(guó)有限公司；RM2235 石蠟切片機(jī)購(gòu)自德國(guó)Leica 公司；Spark 多功能酶標(biāo)儀帝肯實(shí)驗(yàn)器材有限公司。

1.4 方法

1.4.1 缺血缺氧性腦損傷大鼠模型的建立 大鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法分為正常對(duì)照組（12 只）及造模組（63 只），造模組參照文獻(xiàn)[5]方法建立缺血缺氧性腦損傷大鼠模型，采用吸入乙醚法進(jìn)行麻醉，麻醉后置于操作臺(tái)上分離頸總動(dòng)脈，并進(jìn)行結(jié)扎，縫合傷口，大鼠恢復(fù)1 h 后，置于37 ℃恒溫低氧箱中，低氧箱氣體構(gòu)成為8%氧氣及92%氮?dú)?，氣流速度? L/min，2 h 后取出放回飼養(yǎng)籠。隨機(jī)取3 只大鼠進(jìn)行腦組織病理學(xué)檢查以驗(yàn)證造模是否成功，如鏡下可見(jiàn)腦組織炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，細(xì)胞排列不整齊，腦組織細(xì)胞通透性改變或空泡樣壞死視為腦組織炎癥損傷，每張切片炎癥損傷面積超過(guò)切片的10%視為造模成功。正常對(duì)照組僅切開(kāi)皮膚后分離頸總動(dòng)脈，縫合，不進(jìn)行頸總動(dòng)脈結(jié)扎。造模完成后大鼠隨機(jī)分為腦損傷組、通竅活血湯低劑量組、通竅活血湯中劑量組、通竅活血湯高劑量組及神經(jīng)節(jié)苷脂組，每組12 只。

1.4.2 給藥 通竅活血湯低、中、高劑量組分別按照4、8、16 g/kg（以生藥含量計(jì)）[6]的劑量灌胃給予通竅活血湯，神經(jīng)節(jié)苷脂組按照10 mg/kg[7]的劑量腹腔注射神經(jīng)節(jié)苷脂，每日1 次，連續(xù)14 d[6]，正常對(duì)照組及腦損傷組灌胃給予生理鹽水。

1.4.3 Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn) Morris 水迷宮中設(shè)置低于水面1 cm 的平臺(tái)，將大鼠置于Morris 水迷宮中，第1～5 d 訓(xùn)練大鼠，引導(dǎo)大鼠到達(dá)平臺(tái)且停留10 s，第6 天撤除平臺(tái)，將平臺(tái)所在象限記為靶象限，將大鼠置于Morris 水迷宮，記錄90 s 內(nèi)大鼠在靶象限停留時(shí)間及穿越平臺(tái)次數(shù)。

1.4.4 大鼠血清sEPCR、sTM、ET-1 含量的測(cè)定 按照35 mg/kg 的劑量腹腔注射給予大鼠戊巴比妥鈉將大鼠麻醉，大鼠斷頭處死并取血至離心管，室溫靜置30 min，8 000 r/min，4 ℃離心（離心半徑13 cm）10 min，取血清，按照sEPCR、sTM、ET-1 ELISA 試劑盒方法測(cè)定sEPCR、sTM、ET-1 含量。

1.4.5 大鼠血管組織SOD、MDA 及TNF-α 水平測(cè)定 大鼠處死后取頸總動(dòng)脈血管，組織研磨勻漿后，4 ℃條件下，8 000 r/min，離心（離心半徑13 cm）10 min，取上清液，按照SOD、MDA、TNF-α ELISA 試劑盒方法測(cè)定SOD、MDA 及TNF-α 水平。

1.4.6 大鼠腦組織TNF-α、IL-1β 及IL-6 水平測(cè)定取大鼠腦組織，按照TNF-α、IL-1β 及IL-6 ELISA試劑盒方法測(cè)定腦組織研磨勻漿液中TNF-α、IL-1β 及IL-6 水平。

1.4.7 大鼠海馬組織病理學(xué)檢查 頸椎脫臼法處死大鼠，分離海馬組織，常規(guī)HE 染色并在顯微鏡下進(jìn)行病理學(xué)檢查。

1.4.8 大鼠海馬組織Nrf2、HO -1、JAK2、STAT3 mRNA 水平測(cè)定 大鼠頸椎脫臼處死并分離海馬組織，提取總RNA 后逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，使用PCR 試劑盒檢測(cè)海馬組織GAPDH、Nrf2、HO-1、JAK2、STAT3 mRNA 水平，結(jié)果按照2-ΔΔct法，以GAPDH 為內(nèi)參，計(jì)算各基因相對(duì)表達(dá)量。引物序列見(jiàn)表1。采用20 μL反應(yīng)體系：qPCR Mix 10 μL，正反向引物各1 μL，模板DNA 2 μL，蒸餾水補(bǔ)充至20 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性2 min，95 ℃變性15 s，60 ℃延伸30 s，共計(jì)40 個(gè)循環(huán)，60 ℃退火30 s。

表1 PCR 引物序列Tab.1 PCR primer sequence

1.4.9 大鼠海馬組織Nrf2、HO-1、JAK2、STAT3 蛋白水平檢查 大鼠頸椎脫臼法處死，分離海馬組織，研磨勻漿后，4 ℃，12 000 r/min，離心（離心半徑13 cm）10 min，取上清液，BCA 法對(duì)總蛋白定量，分別經(jīng)電泳分離、轉(zhuǎn)膜、封閉后，使用Nrf2、HO-1、JAK2、STAT3 及GAPDH 兔抗體（1∶500）4 ℃孵育過(guò)夜，TBST 清洗后，山羊抗兔二抗（1∶2 000）室溫孵育1 h，TBST 再次清洗后，使用化學(xué)發(fā)光液在凝膠成像儀中成像，用ImageJ 1.8.0 軟件，檢測(cè)各蛋白灰度值，以GAPDH 為內(nèi)參，計(jì)算Nrf2、HO-1、JAK2、STAT3相對(duì)水平。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所有數(shù)據(jù)使用SPSS26.0 軟件進(jìn)行處理分析，數(shù)據(jù)均符合正態(tài)分布且方差齊，數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD 檢驗(yàn)，P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 通竅活血湯對(duì)缺血缺氧性腦損傷新生大鼠靶象限停留時(shí)間及穿越平臺(tái)次數(shù)的影響 與正常對(duì)照組比較，腦損傷組大鼠靶象限停留時(shí)間及穿越平臺(tái)次數(shù)顯著減少（P＜0.05）；與腦損傷組比較，通竅活血湯低、中、高劑量組及神經(jīng)節(jié)苷脂組大鼠靶象限停留時(shí)間及穿越平臺(tái)次數(shù)明顯增加（P＜0.05），且隨著通竅活血湯劑量的增加，大鼠靶象限停留時(shí)間及穿越平臺(tái)次數(shù)逐漸增加。見(jiàn)表2。

表2 大鼠靶象限停留時(shí)間及穿越平臺(tái)次數(shù)（±s）Tab.2 Target quadrant residence time and times of crossing the platform in rats（±s）

表2 大鼠靶象限停留時(shí)間及穿越平臺(tái)次數(shù)（±s）Tab.2 Target quadrant residence time and times of crossing the platform in rats（±s）

注：與正常對(duì)照組比較，*P＜0.05；與腦損傷組比較，#P<0.05；與通竅活血湯低劑量組比較，△P＜0.05；與通竅活血湯中劑量組比較，▲P＜0.05。

組別 靶象限停留時(shí)間（s） 穿越平臺(tái)次數(shù)（次）正常對(duì)照組 53.67±1.56 9.19±0.84腦損傷組 17.11±2.09* 2.56±0.36*通竅活血湯低劑量組 29.08±1.57# 4.55±0.32#通竅活血湯中劑量組 40.45±1.41#△ 6.72±0.53#△通竅活血湯高劑量組 48.03±1.91#△▲ 8.31±0.79#△▲神經(jīng)節(jié)苷脂組 51.49±1.72# 8.81±0.62#

2.2 通竅活血湯對(duì)缺血缺氧性腦損傷新生大鼠血清sEPCR、sTM、ET-1 含量的影響 與正常對(duì)照組比較，腦損傷組大鼠血清sEPCR、sTM、ET-1 含量顯著升高（P＜0.05）；與腦損傷組比較，通竅活血湯低、中、高劑量組及神經(jīng)節(jié)苷脂組大鼠血清sEPCR、sTM、ET-1 含量顯著降低（P＜0.05），且隨著通竅活血湯劑量的增加，大鼠血清sEPCR、sTM、ET-1 含量逐漸降低。見(jiàn)表3。

表3 大鼠血清sEPCR、sTM、ET-1 含量（±s）Tab.3 Levels of serum sEPCR，sTM and ET-1 in rats（±s）

表3 大鼠血清sEPCR、sTM、ET-1 含量（±s）Tab.3 Levels of serum sEPCR，sTM and ET-1 in rats（±s）

注：與正常對(duì)照組比較，*P＜0.05；與腦損傷組比較，#P＜0.05；與通竅活血湯低劑量組比較，△P＜0.05；與通竅活血湯中劑量組比較，▲P＜0.05。

組別 sEPCR（μg/L） sTM（μg/L） ET-1（ng/mL）正常對(duì)照組 0.79±0.31 1.79±0.25 1.04±0.09腦損傷組 5.58±0.81* 7.34±0.67* 6.71±0.84*通竅活血湯低劑量組 3.80±0.28# 5.78±0.55# 4.89±0.45#通竅活血湯中劑量組 2.63±0.51#△ 3.37±0.44#△ 3.34±0.98#△通竅活血湯高劑量組 1.05±0.14#△▲ 2.09±0.51#△▲ 1.12±0.35#△▲神經(jīng)節(jié)苷脂組 1.56±0.33# 2.84±0.26# 1.91±0.29#

2.3 通竅活血湯對(duì)缺血缺氧性腦損傷新生大鼠血管組織SOD、MDA 及TNF-α 水平的影響 與正常對(duì)照組比較，腦損傷組大鼠血管組織SOD 顯著降低（P＜0.05），MDA 及TNF-α 顯著升高（P＜0.05）；與腦損傷組比較，通竅活血湯低、中、高劑量組及神經(jīng)節(jié)苷脂組大鼠血管組織SOD 顯著升高（P＜0.05），MDA及TNF-α 顯著降低（P＜0.05），且隨著通竅活血湯劑量的增加，大鼠血管組織SOD 逐漸升高，MDA 及TNF-α 逐漸降低。見(jiàn)表4。

表4 大鼠血管組織SOD、MDA 及TNF-α 水平（±s）Tab.4 Levels of SOD，MDA and TNF-α in vascular tissue of rats（±s）

表4 大鼠血管組織SOD、MDA 及TNF-α 水平（±s）Tab.4 Levels of SOD，MDA and TNF-α in vascular tissue of rats（±s）

注：與正常對(duì)照組比較，*P＜0.05；與腦損傷組比較，#P＜0.05；與通竅活血湯低劑量組比較，△P＜0.05；與通竅活血湯中劑量組比較，▲P＜0.05。

組別 SOD（U/mg） MDA（μmol/g）TNF-α（ng/mL）正常對(duì)照組 97.13±2.09 4.13±1.26 26.93±1.36腦損傷組 42.05±1.68* 14.72±1.11* 67.41±2.13*通竅活血湯低劑量組 61.90±1.49# 10.02±2.74# 53.04±1.99#通竅活血湯中劑量組 75.31±1.60#△ 7.35±0.96#△ 42.17±0.97#△通竅活血湯高劑量組 92.43±2.76#△▲ 4.85±1.72#△▲28.21±1.40#△▲神經(jīng)節(jié)苷脂組 87.17±1.47# 5.59±1.31# 30.53±1.74#

2.4 通竅活血湯對(duì)缺血缺氧性腦損傷新生大鼠腦組織TNF-α、IL-1β 及IL-6 的影響 與正常對(duì)照組比較，腦損傷組大鼠腦組織TNF-α、IL-1β 及IL-6顯著升高（P＜0.05）；與腦損傷組比較，通竅活血湯低、中、高劑量組及神經(jīng)節(jié)苷脂組大鼠腦組織TNFα、IL-1β 及IL-6 顯著降低（P＜0.05），且隨著通竅活血湯劑量的增加，大鼠腦組織TNF-α、IL-1β 及IL-6 逐漸降低。見(jiàn)表5。

表5 大鼠腦組織TNF-α、IL-1β 及IL-6 水平（±s）Tab.5 Levels of TNF-α，IL-1β and IL-6 in brain of rats（±s） pg/mL

表5 大鼠腦組織TNF-α、IL-1β 及IL-6 水平（±s）Tab.5 Levels of TNF-α，IL-1β and IL-6 in brain of rats（±s） pg/mL

注：與正常對(duì)照組比較，*P＜0.05；與腦損傷組比較，#P＜0.05；與通竅活血湯低劑量組比較，△P＜0.05；與通竅活血湯中劑量組比較，▲P＜0.05。

組別 TNF-α IL-1β IL-6正常對(duì)照組 37.23±2.71 19.57±1.26 32.78±1.46腦損傷組 169.70±3.30* 87.25±2.72* 160.11±2.29*通竅活血湯低劑量組 93.28±3.84# 57.93±1.85# 83.13±4.12#通竅活血湯中劑量組 67.19±2.88#△ 41.52±2.16#△ 67.33±2.98#△通竅活血湯高劑量組 47.31±1.92#△▲24.36±2.13#△▲39.59±2.50#△▲神經(jīng)節(jié)苷脂組 53.53±1.89# 29.62±1.94# 44.05±3.31#

2.5 通竅活血湯對(duì)缺血缺氧性腦損傷新生大鼠海馬組織病理學(xué)影響 正常對(duì)照組海馬組織無(wú)病理性改變，與正常對(duì)照組比較，腦損傷組海馬組織炎癥損傷及細(xì)胞脫落，與腦損傷組比較，通竅活血湯低、中、高劑量組及神經(jīng)節(jié)苷脂組海馬組織炎癥浸潤(rùn)明顯減輕，病理性改變明顯減輕。見(jiàn)圖1。

圖1 大鼠海馬組織病理學(xué)檢查結(jié)果（HE，×200）Fig.1 Histopathological examination results in hippocampus tissue of rats(HE，×200)

2.6 通竅活血湯對(duì)缺血缺氧性腦損傷新生大鼠海馬組織Nrf2、HO-1、JAK2、STAT3 mRNA 水平的影響 與正常對(duì)照組比較，腦損傷組大鼠海馬組織Nrf2、HO-1 mRNA 水平顯著降低（P＜0.05），JAK2、STAT3 mRNA 水平顯著升高（P＜0.05）；與腦損傷組比較，通竅活血湯低、中、高劑量組及神經(jīng)節(jié)苷脂組大鼠海馬組織Nrf2、HO-1mRNA 水平顯著升高（P＜0.05），JAK2、STAT3 mRNA 水平顯著降低（P＜0.05），且隨著通竅活血湯劑量的增加，大鼠海馬組織Nrf2、HO-1 mRNA 水平逐漸升高，JAK2、STAT3 mRNA 水平逐漸降低。見(jiàn)表6。

表6 大鼠海馬組織Nrf2、HO-1、JAK2、STAT3 mRNA水平（±s）Tab.6 Levels of Nrf2，HO-1，JAK2 and STAT3 mRNA in hippocampus tissue of rats（±s）

表6 大鼠海馬組織Nrf2、HO-1、JAK2、STAT3 mRNA水平（±s）Tab.6 Levels of Nrf2，HO-1，JAK2 and STAT3 mRNA in hippocampus tissue of rats（±s）

注：與正常對(duì)照組比較，*P＜0.05；與腦損傷組比較，#P＜0.05；與通竅活血湯低劑量組比較，△P＜0.05；與通竅活血湯中劑量組比較，▲P＜0.05。

組別 Nrf2 HO-1 JAK2 STAT3正常對(duì)照組 7.17±0.29 5.69±0.42 0.53±0.09 0.48±0.15腦損傷組 0.44±0.12* 0.82±0.22* 6.87±0.86* 5.46±0.62*通竅活血湯低劑量組2.56±0.26# 2.01±0.21# 4.23±0.77# 4.41±0.38#通竅活血湯中劑量組 4.45±0.35#△ 3.86±0.17#△ 2.89±0.67#△ 2.95±0.28#△通竅活血湯高劑量組 6.89±0.32#△▲5.19±0.38#△▲0.97±0.31#△▲0.97±0.20#△▲神經(jīng)節(jié)苷脂組 5.48±0.43# 4.05±0.28# 1.33±0.42# 1.34±0.41#

2.7 通竅活血湯對(duì)缺血缺氧性腦損傷新生大鼠海馬組織Nrf2、HO-1、JAK2、STAT3 蛋白的影響 與正常對(duì)照組比較，腦損傷組大鼠海馬組織Nrf2、HO-1 蛋白水平顯著降低（P＜0.05），JAK2、STAT3 蛋白水平顯著升高（P＜0.05）；與腦損傷組比較，通竅活血湯低、中、高劑量組及神經(jīng)節(jié)苷脂組大鼠海馬組織Nrf2、HO-1 蛋白水平顯著升高（P＜0.05），JAK2、STAT3 蛋白水平顯著降低（P＜0.05），且隨著通竅活血湯劑量的增加，大鼠海馬組織Nrf2、HO-1 蛋白水平逐漸升高，JAK2、STAT3 蛋白水平逐漸降低。見(jiàn)圖2。

圖2 大鼠海馬組織Nrf2、HO-1、JAK2、STAT3 蛋白水平（±s）Fig.2 Levels of Nrf2，HO-1，JAK2 and STAT3 protein in hippocampal tissue of rats（±s）

3 討論

新生兒腦損傷是臨床中常見(jiàn)的中樞神經(jīng)功能障礙性疾病，常見(jiàn)于先天性腦發(fā)育不全、腦性癱瘓及嬰兒期創(chuàng)傷或嚴(yán)重疾病所遺留的并發(fā)癥，其中缺血缺氧性腦損傷是臨床中常見(jiàn)的新生兒腦損傷疾病，主要由胎兒宮內(nèi)窘迫或胎兒出生時(shí)窒息等因素引起，嚴(yán)重時(shí)表現(xiàn)出新生兒發(fā)育遲緩、智力低下，甚至誘發(fā)癲癇及患兒死亡，嚴(yán)重影響患兒的生活生存質(zhì)量，給患兒家庭帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)和精神負(fù)擔(dān)[8]。目前，臨床對(duì)于新生兒缺血缺氧性腦損傷的治療方法和藥物有限，且現(xiàn)有藥物均只能在一定程度上緩解癥狀，表現(xiàn)出有效性低及預(yù)后差的特點(diǎn)[9]，所以，目前對(duì)于新生兒缺血缺氧性腦損傷治療藥物的研發(fā)越來(lái)越受關(guān)注。

通竅活血湯由麝香、川芎等中藥材組成，方中麝香，活血祛瘀，散瘀止痛，為君藥；桃仁、紅花、赤芍及川芎活血解郁，通達(dá)止痛，為臣藥；佐以大棗及生姜，通絡(luò)化瘀，溫中補(bǔ)脾，蔥白通陽(yáng)利竅，調(diào)和營(yíng)衛(wèi)，為使藥，諸藥合用，共奏通竅活血，散瘀利結(jié)之功?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，通竅活血湯對(duì)于腦損傷及神經(jīng)損傷均具有顯著的改善作用，賀冠軍[11]研究發(fā)現(xiàn)通竅活血湯能夠顯著抑制腦出血患者血腫體積及水腫體積，并能夠促進(jìn)神經(jīng)功能的恢復(fù)；安聰?shù)萚12]研究證實(shí)通竅活血湯對(duì)于重型顱腦損傷大鼠具有顯著的炎癥抑制作用；杜勇等[13]研究表明，通竅活血湯能夠通過(guò)抑制線粒體自噬進(jìn)而抑制顱腦損傷小鼠腦組織細(xì)胞凋亡；練志明等[14]臨床研究證實(shí)通竅活血湯能夠顯著促進(jìn)重型顱腦損傷患者腦血管循環(huán)及神經(jīng)恢復(fù)。由此可見(jiàn)通竅活血湯對(duì)于缺血缺氧性腦損傷的治療具有較大潛力。

認(rèn)知障礙是新生兒缺血缺氧性腦損傷的典型臨床表現(xiàn)與并發(fā)癥，在臨床藥物治療與藥物研發(fā)中成為關(guān)鍵考察指標(biāo)[15]，其中，Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn)中靶象限停留時(shí)間及穿越平臺(tái)次數(shù)是反映認(rèn)知功能的常用指標(biāo)[16]，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，通竅活血湯能夠呈劑量依賴性地提高缺血缺氧性腦損傷新生大鼠靶象限停留時(shí)間及穿越平臺(tái)次數(shù)，顯著提高缺血缺氧性腦損傷新生大鼠認(rèn)知能力及神經(jīng)功能。腦組織TNF-α、IL-1β 及IL-6 水平是反映腦組織炎癥反應(yīng)程度的指標(biāo)，其水平的升高提示腦組織炎癥損傷加重[17]，本實(shí)驗(yàn)表明，通竅活血湯能夠呈劑量依賴性明顯降低缺血缺氧性腦損傷新生大鼠腦組織TNF-α、IL-1β 及IL-6 水平，抑制腦組織炎癥水平，改善腦組織損傷。

血清sEPCR、sTM、ET-1 水平提示血管內(nèi)皮功能受損，馬磊等[18]研究證實(shí)血清sEPCR 水平升高與大血管病變的發(fā)生及進(jìn)展有關(guān)；徐向輝等[19]研究表明降低sTM 水平與改善大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷有關(guān)；劉志浩等[20]研究表明降低腦缺血患者ET-1 水平能夠有效改善患者血管內(nèi)皮功能，促進(jìn)神經(jīng)恢復(fù)；抑制ET-1 水平能夠顯著抑制血管炎癥損傷，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與正常對(duì)照組比較，腦損傷組大鼠血清sEPCR、sTM、ET-1 水平明顯升高，而給予不同劑量的通竅活血湯后，大鼠血清sEPCR、sTM、ET-1 水平明顯降低，提示通竅活血湯能夠呈劑量依賴性地降低缺血缺氧性腦損傷大鼠血清sEPCR、sTM、ET-1水平，抑制血管炎癥反應(yīng)。同時(shí)，血管組織SOD、MDA及TNF-α 水平反映血管炎癥損傷及應(yīng)激水平，SOD水平降低，MDA 及TNF-α 水平升高提示血管炎癥損傷加重，自我修復(fù)能力降低及應(yīng)激損傷加重[21]，因此，提高血管組織SOD 水平，降低MDA 及TNF-α水平可能是改善腦血管損傷的重要途徑之一。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，通竅活血湯能夠呈劑量依賴性地抑制血管MDA 及TNF-α 水平，提高SOD 水平，進(jìn)而抑制血管組織氧化及應(yīng)激損傷，發(fā)揮血管保護(hù)作用。

研究證實(shí)Nrf2 通路與缺血缺氧性腦損傷的發(fā)生及進(jìn)展密切相關(guān)。Shu 等[22]研究發(fā)現(xiàn)，Nrf2、HO-1能夠有效抑制氧化應(yīng)激損傷，進(jìn)而修復(fù)腦損傷后神經(jīng)功能障礙；馬競(jìng)等[23]研究表明，升高缺血缺氧性腦損傷大鼠腦組織Nrf2、HO-1 水平能夠顯著促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)，并增強(qiáng)抗氧化作用；魏小于等[24]研究證實(shí)JAK2、STAT3 蛋白參與腦組織損傷的發(fā)生，而抑制JAK2、STAT3 蛋白水平則能夠顯著抑制腦組織損傷及炎癥反應(yīng)；劉慶等[25]研究表明Nrf2 能夠通過(guò)抑制JAK2、STAT3 蛋白水平，進(jìn)而抑制炎癥反應(yīng)及腦神經(jīng)損傷，抑制和改善腦組織缺血缺氧性腦損傷。由此可見(jiàn)，調(diào)節(jié)Nrf2 通路及相關(guān)蛋白水平可能是治療缺血缺氧性腦損傷的有效途徑和方法。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與腦損傷組比較，通竅活血湯能夠劑量依賴性低升高海馬組織Nrf2、HO-1 水平，并抑制JAK2、STAT3 水平，進(jìn)而促進(jìn)神經(jīng)功能改善，抑制腦組織炎癥損傷，促進(jìn)缺血缺氧性腦損傷大鼠的恢復(fù)。

綜上所述，通竅活血湯能夠顯著抑制缺血缺氧性腦損傷大鼠神經(jīng)損傷及腦組織炎癥反應(yīng)，抑制血管氧化應(yīng)激損傷，發(fā)揮腦組織及血管保護(hù)作用，其機(jī)制可能與調(diào)節(jié)Nrf2 通路有關(guān)。