胡 超，李琎杰，毛自欣，袁 波，劉塞納

（江西省檢驗(yàn)檢測認(rèn)證總院 食品檢驗(yàn)檢測研究院，江西宜春 336000）

硒作為人體必需的微量元素之一，有多種免疫與生物學(xué)功能，尤其是預(yù)防心血管病、抗腫瘤、抗病毒性疾病及抗衰老等作用[1]。與無機(jī)硒化合物相比，有機(jī)硒化合物生物活性強(qiáng)、毒性低、吸收率高、污染小[2-4]，而且硒不能在人體內(nèi)合成，必須通過食物中攝取。根據(jù)《中國居民膳食營養(yǎng)素參考攝入量》，成人每天的硒攝入量應(yīng)不少于50 μg[2]，而目前我國人均每日硒攝入量僅為26～32 μg，遠(yuǎn)低于最低攝入量。因此，對食品中有機(jī)硒的含量檢測具有很大的研究意義。人體內(nèi)的有機(jī)硒形式主要為硒蛋白和硒代氨基酸，硒代氨基酸主要形式為甲基硒代半胱氨酸（MeSeCys）、硒代蛋氨酸（SeMet）、硒代半胱氨酸（Sec）[13]等。

近年來，富硒農(nóng)業(yè)發(fā)展越來越快，農(nóng)產(chǎn)品的硒含量得到廣泛的關(guān)注。因此，關(guān)于農(nóng)產(chǎn)品硒含量的檢測也越來越重要。

根據(jù)現(xiàn)有的國家標(biāo)準(zhǔn)和文獻(xiàn)參考，有機(jī)硒檢測方法中，前處理提取方法有水提取法、酸提取法、酶解提取法和輔助提取法等[4]。主要針對香菇樣品中水提取法、酸提取法、酶解提取法[7]對甲基硒代半胱氨酸（MeSeCys）、硒代蛋氨酸（SeMet）、硒代半胱氨酸（Sec） 的實(shí)際提取效果的分析和對比。檢測器的選擇有高效液相色譜法[10-12]、氣相色譜- 串聯(lián)質(zhì)譜法[9]、毛細(xì)管電泳法等、氫化物發(fā)生- 原子熒光光譜法[8]和液相色譜- 電感耦合等離子質(zhì)譜法（HPLC-ICP-MS）[6]。選擇超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（HPLC-ESI-MS）的檢測方法研究。液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法具有不易受干擾、重現(xiàn)性好、準(zhǔn)確度高、靈敏度好等優(yōu)點(diǎn)[3-5]。該方法省去了繁瑣的前處理衍化過程，避免了其他離子干擾，節(jié)省了分離時間，可實(shí)現(xiàn)大批量多樣品的檢測，為探究農(nóng)作物有機(jī)硒的檢測提供了一定的數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Waters Xevo TQD 型超高效液相色譜- 串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀（HPLC-ESI-MS） （三重四極桿），美國Waters 公司產(chǎn)品；XSE105DU 型十萬分之一電子天平，瑞士梅特勒托利多公司產(chǎn)品；KQ-400KDE 型超聲儀，昆山市超聲儀器有限公司產(chǎn)品；TGL-15B 型高速離心機(jī)，上海安亭科技儀器廠產(chǎn)品；SHA-CA 型水浴恒溫振蕩器，上海江星儀器廠產(chǎn)品。

甲基硒代半胱氨酸標(biāo)準(zhǔn)品、硒代蛋氨酸標(biāo)準(zhǔn)品、硒代半胱氨酸標(biāo)準(zhǔn)品（純度均為99.8%），蛋白酶（酶活力≥30 U/mg），甲醇（MS 純），甲酸（MS純），純凈水（娃哈哈）。

富硒香菇，購自當(dāng)?shù)剞r(nóng)貿(mào)市場。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

分別準(zhǔn)確稱取甲基硒代半胱氨酸、硒代蛋氨酸、硒代半胱氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液5.0 mg，于100 mL 棕色容量瓶中，用水定容。配成質(zhì)量濃度均為50 μg/mL 的混合標(biāo)準(zhǔn)液，取1.0 mL 儲備液至50 mL 棕色容量瓶，水定容，配成質(zhì)量濃度1.0 μg/mL 的混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液。分別移取混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液0.001，0.005，0.010，0.050，0.100，0.200 mL 于10 mL 棕色容量瓶，用空白基質(zhì)配制成質(zhì)量濃度為0.2，0.5，1.0，5.0，10.0，20.0 ng/mL 的標(biāo)準(zhǔn)系列工作液。

1.2.2 提取方法的選擇

（1） 水提取法。香菇樣品經(jīng)粉碎機(jī)粉碎，準(zhǔn)確稱取2.0 g 于50 mL 離心管，加15ml 超純水，渦旋混勻，于60 ℃水浴條件下超聲提取1 h，在60 ℃水浴振蕩提取24 h，以轉(zhuǎn)速8 000 r/min 離心10 min，上清液移至25 mL 棕色容量瓶，殘?jiān)? mL 超純水，超聲提取30 min，以轉(zhuǎn)速8 000 r/min 離心10 min，合并上清液，加超純水定容，混勻，過0.22 μm（PES） 濾膜，供HPLC-ESI-MS 上機(jī)檢測分析，采用外標(biāo)定量法檢測甲基硒代半胱氨酸、硒代蛋氨酸、硒代半胱氨酸。

（2） 酸提取法。香菇樣品經(jīng)粉碎機(jī)粉碎，準(zhǔn)確稱取2.0 g 于50 mL 離心管，加6.0 mol/L 的HCl 溶液5 mL 于60 ℃水浴條件下超聲提取1 h，于60 ℃水浴中振蕩提取24 h，冷卻，以轉(zhuǎn)速8 000 r/min 離心10 min，取上清液2.0 mL 置于10 mL 棕色容量瓶，加超純水定容，混勻，過0.22 μm（PES） 濾膜，供HPLC-ESI-MS 上機(jī)檢測分析，采用外標(biāo)定量法檢測甲基硒代半胱氨酸、硒代蛋氨酸、硒代半胱氨酸。

（3） 酶解提取法。香菇樣品經(jīng)粉碎機(jī)粉碎，準(zhǔn)確稱取2.0 g 置于50 mL 離心管，加入20 mg 蛋白酶，加入濃度為0.2 mol/L 的抗壞血酸溶液0.25 mL，加Tris-HCl 緩沖液（10 mol/L） 4.75 mL，漩渦30 s，于37 ℃水浴條件下以轉(zhuǎn)速120 r/min 振蕩20 h，避光。于60 ℃水浴超聲波提取40 min，降至常溫，以轉(zhuǎn)速8 000 r/min 離心10 min，取上清液2.0 mL 置于10 mL 棕色容量瓶，用0.1%甲酸水定容，混勻，通過注射器過0.22 μm（PES） 濾膜，供HPLC-ESI-MS 上機(jī)檢測分析，采用外標(biāo)定量法檢測甲基硒代半胱氨酸、硒代蛋氨酸、硒代半胱氨酸。

1.2.3 儀器條件

（1） 液相色譜- 質(zhì)譜條件。色譜柱：Agilent ZORBAXSB-AQ 型，柱長100 mm，內(nèi)徑3.0 mm，粒徑1.8 μm，進(jìn)樣量5.0 μL，流速0.25 mL/min，柱溫40 ℃；流動相：A 相0.1%甲酸溶液；B 相甲醇。

梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序

（2） 質(zhì)譜參考條件。電噴霧離子源，正離子掃描，多反應(yīng)監(jiān)測，毛細(xì)管電壓3.0 kV，脫溶劑氣溫度550 ℃，脫溶劑氣流量1 000 L/H，錐孔氣流量50 L/H；噴霧電壓、離子源溫度、脫溶劑溫度和氮?dú)饬魉俚葏?shù)應(yīng)優(yōu)化至最優(yōu)靈敏度。

定性離子對、定量離子對和碰撞能量見表2。

表2 定性離子對、定量離子對和碰撞能量

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品檢測結(jié)果

取同一樣品，同時用3 種不同提取方法處理，通過HLPC-MS 的質(zhì)譜檢測，標(biāo)準(zhǔn)曲線質(zhì)量濃度為0.2～20.0 ng/mL，所得檢測結(jié)果如下。

香菇樣品中3 種硒代氨基酸的測定見表3，甲基硒代半胱氨酸MRM 譜圖見圖1，硒代蛋氨酸MRM譜圖見圖2，硒代半胱氨酸MRM譜圖見圖3，HPLCESI-MS 法檢測3 種硒代氨基酸的回歸方程、相關(guān)系數(shù)和檢出限見表4。

圖1 甲基硒代半胱氨酸MRM 譜圖

圖2 硒代蛋氨酸MRM 譜圖

圖3 硒代半胱氨酸MRM 譜圖

表3 香菇樣品中3 種硒代氨基酸的測定

表4 HPLC-ESI-MS 法檢測3 種硒代氨基酸的回歸方程、相關(guān)系數(shù)和檢出限

2.2 重復(fù)性試驗(yàn)

針對試驗(yàn)中的儀器HPLC-ESI-MS 和樣品前處理分別進(jìn)行重復(fù)性試驗(yàn)。儀器重復(fù)性試驗(yàn)中，以質(zhì)量濃度15 ng/mL 標(biāo)液進(jìn)樣6 次，保持其余條件不變，得出此質(zhì)量濃度下平均峰面積和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。

前處理重復(fù)性試驗(yàn)中，采用酶解提取法對同一樣品連續(xù)處理6 次，在同樣的儀器條件下檢測結(jié)果，得出平均峰面積和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。

HPLC-ESI-MS 儀器和前處理重現(xiàn)性見表5。

表5 HPLC-ESI-MS 儀器和前處理重現(xiàn)性

由表5 可知，3 種氨基酸RSD 值均≤5%，說明儀器方法和前處理方法重現(xiàn)性良好。

2.3 回收試驗(yàn)

3 種硒代氨基酸加標(biāo)回收率見表6。

表6 3 種硒代氨基酸加標(biāo)回收率

對樣品進(jìn)行不同質(zhì)量濃度加標(biāo)（0.05，0.25，0.50 mg/kg） 3 種硒代氨基酸混標(biāo)，用酶解提取法做回收試驗(yàn)。各樣品平行進(jìn)樣2 次，外標(biāo)法定量，計(jì)算3 個加標(biāo)水平下3 種硒代氨基酸的回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，得出平均回收率分別為92.3%，93.0%，92.4%；相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為2.71%，2.14%，1.83%，說明該方法有較高準(zhǔn)確度、重現(xiàn)性比較好、方法相對可靠。

3 結(jié)論

前處理提取方面，3 種硒代氨基酸在水提取法、酸提取法和酶解提取法的提取效率存在明顯差異。因?yàn)橛袡C(jī)硒在植物中的存在形式比較復(fù)雜，主要有游離的氨基酸和蛋白質(zhì)的形式存在。水提取法主要提取試樣中的游離氨基酸；酸提取法能夠酸解蛋白質(zhì)，破壞氨基酸之間的肽鍵，解離出游離氨基酸，但是高濃度酸解蛋白質(zhì)過程不可控，可能使蛋白質(zhì)過度分解，破壞氨基酸之間的肽鍵，后續(xù)可做使用不同濃度酸和不同類型酸提取效果的對比試驗(yàn)。酶解法能夠很好地分解蛋白質(zhì)又不會破壞氨基酸結(jié)構(gòu)，在3 種提取方法中對于提取植物中有機(jī)硒效果最有效，具有更高的專一性和更高提取率。酶解法提取耗時比較長，可能存在分解不完全的情況，后續(xù)可再進(jìn)行比對試驗(yàn)，比對不同酶解時長、不同溫度、不同蛋白酶及與纖維素酶搭配等的更佳提取方案。

檢測儀器選擇上，目前使用比較多的是柱前衍生液相色譜法、氣相色譜- 串聯(lián)質(zhì)譜法、毛細(xì)管電泳法和液相色譜- 電感耦合等離子體質(zhì)譜法等，選擇高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法檢測具有靈敏度高、檢出限低、抗干擾性強(qiáng)、精密度高、簡潔快速等優(yōu)勢，可適用于大批量樣品檢測，為研究蔬菜中有機(jī)硒的檢測提供了一定的數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。該方法的不足之處在于無法檢測樣品無機(jī)硒和總硒，因此對于硒的形態(tài)檢測方法還有待進(jìn)一步的探索和完善。