劉宇新，鄔松恒，崔 憲，馬 靜，黃振俠，歐陽仉孫，辛宜聰，徐德勝，熊江花

（1.江西省農(nóng)業(yè)生態(tài)與資源保護站，江西南昌 330047；2.南昌大學食品學院生物質轉化教育部工程研究中心，江西南昌 330047）

0 引言

蔬菜是我國居民膳食結構的重要組成部分，根據(jù)《中國居民膳食指南（2016）》建議，居民每日蔬菜攝入量應達到300～500 g。葉類蔬菜富含大量維生素和膳食纖維，是人們主要食用的蔬菜種類。葉類蔬菜作為一類硝酸鹽富集型作物，其中高含量的硝酸鹽在貯藏和食用過程中易轉變?yōu)橛泻Φ膩喯跛猁}，從而產(chǎn)生硝酸鹽潛在風險。蔬菜中亞硝酸鹽的產(chǎn)生途徑主要有2 個，一是囤積的蔬菜被微生物侵染，硝酸鹽在微生物產(chǎn)生的硝酸還原酶的作用下被還原成亞硝酸鹽[1]；二是人體攝入的大量硝酸鹽約有25%會通過唾液腺分泌，在口腔細菌的作用下，最終總攝入硝酸鹽量的6%～7%會在口腔中被轉化為亞硝酸鹽[2]；許多研究表明蔬菜中的天然抗氧化物，如抗壞血酸和多酚，能將亞硝酸鹽還原為NO 等物質，從而抑制亞硝酸鹽的危害[3-4]。因此，蔬菜的硝酸鹽潛在安全風險應當取決于硝酸鹽含量與抗氧化能力之間的平衡關系?；诖?，前人的研究中提出了可通過抗氧化性/ 體內亞硝酸鹽比值（Antioxidant/in vivo nitrite ratio，A/N） 反映和評價蔬菜中硝酸鹽和亞硝酸鹽對人體健康的安全性[5-6]。

由于蔬菜自身酶系和環(huán)境微生物的作用，蔬菜的硝酸鹽、亞硝酸鹽含量和抗氧化能力在蔬菜貯藏過程中不斷發(fā)生變化，不同的貯藏條件與貯藏方式也會影響蔬菜硝酸鹽含量與抗氧化能力之間的平衡。楊沖[7]的研究表明，空心菜的維C 含量在0，15 ℃貯藏6 d 時分別減少了約50%和80%；而在5，10 ℃貯藏6 d 時反而增加了約23%和9%。林麗萍等人[1]的研究表明，4 ℃冷藏貯藏可降低蔬菜中亞硝酸鹽的含量，并使亞硝化峰延遲出現(xiàn)。王倩[8]研究了菠菜、油菜和空心菜在不同貯藏條件下亞硝酸鹽含量的變化，其中封閉袋裝貯藏的蔬菜亞硝酸鹽含量增長要明顯大于散裝貯藏。目前，大多數(shù)研究集中于單獨分析蔬菜的抗氧化能力或硝酸鹽含量在貯藏過程中變化，而對于葉類蔬菜硝酸鹽和抗氧化能力之間平衡關系的變化鮮有報道。

因此，以卷心菜為原料，研究貯藏溫度（常溫與低溫） 和貯藏方式（散裝與袋裝） 在貯藏過程中對卷心菜的硝酸鹽含量、亞硝酸鹽含量、總抗氧化能力和微生物群落多樣性的影響，并通過A/N 值來反映卷心菜中硝酸鹽與抗氧化能力的平衡關系，以此評價卷心菜在短期貯藏過程中硝酸鹽潛在安全風險的變化，為人們的飲食健康提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

以試驗當天清晨從江西省南昌市某農(nóng)貿市場購買的卷心菜（“盛春”卷心菜） 為材料，采購后立即運往實驗室進行后續(xù)試驗。

新鮮卷心菜的相關數(shù)據(jù)見表1。

表1 新鮮卷心菜的相關數(shù)據(jù)

四硼酸鈉、硫酸鋅、亞鐵氰化鉀、還原鋅粉、三氯化鐵、硝酸鈉、亞硝酸鈉、乙酸鈉，西隴科學股份有限公司提供；乙酸鎘、2,2 - 二苯基- 1 - 吡啶并肼基（DPPH）、2,4,6 - 三吡啶基三嗪（TPTZ），上海麥克林生化科技有限公司提供；對氨基苯磺酸、鹽酸萘乙二胺、氨水、冰乙酸，上海阿拉丁生化科技股份有限公司提供；菌落總數(shù)測試片，廣東達元綠洲食品安全科技股份有限公司提供。

1.2 儀器與設備

恒溫培養(yǎng)箱，上海智城分析儀器制造有限公司產(chǎn)品；紫外分光光度計，上海元析儀器有限公司產(chǎn)品；酶標儀，杭州奧盛儀器有限公司產(chǎn)品；電熱恒溫鼓風干燥箱，上海精宏實驗設備有限公司產(chǎn)品；臺式高速冷凍離心機，湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司產(chǎn)品。

1.3 貯藏過程

由于卷心菜個體體積較大，為確保樣品均勻分裝，從根部將葉片進行切斷，在盡量減少葉片傷口的條件下分切為單片葉片，混合后再進行分裝至塑料袋內，每組100 g。分裝后的卷心菜被分為散裝常溫、袋裝常溫、散裝低溫和袋裝低溫共4 個試驗組。散裝處理的試驗組直接將樣品放入塑料袋中，開口貯藏；袋裝處理的試驗組將塑料袋中空氣盡量排出后扎緊封閉，常溫組置于（20±2） ℃常溫室內貯藏，低溫組置于（2±2） ℃冷藏室內貯藏。以上試驗組重復3 次。

各試驗組分別貯藏12，24，48，72，96 h 后，取樣于-80 ℃冰箱冷凍待測。測定硝酸鹽、亞硝酸鹽含量、總抗氧化能力、抗壞血酸含量、總酚含量、菌落總數(shù)。根據(jù)試驗結果，取常溫貯藏48 h 的樣品進行微生物群落多樣性分析。

1.4 分析檢測方法

1.4.1 硝酸鹽和亞硝酸鹽含量的測定

硝酸鹽和亞硝酸鹽測定參考Ding Z 等人[5]的方法，但對預處理過程進行了一些修改。取5.0 g 粉碎卷心菜加入蒸餾水25 mL 和2.6%（W/V） Na2B4O7溶液1.2 mL，并于在70 ℃水浴中保溫15 min。隨后冷水浴15 min 并加入30%（W/V） 硫酸鋅溶液0.5 mL，振蕩混勻后再加入15% （W/V） 亞鐵氰化鉀溶液0.5 mL，振蕩混勻。室溫靜置30 min 后，用定性濾紙過濾并將濾液定容至50 mL，立即分析濾液中的硝酸鹽和亞硝酸鹽含量。

1.4.2 抗壞血酸含量的測定

抗壞血酸含量的測定參照Mirzaei A 等人[9]的方法，但對預處理過程進行了一些修改。取2.0 g 粉碎卷心菜，加入體積分數(shù)為80%乙醇20 mL，冰浴條件下超聲處理10 min，而后在4 ℃條件下避光提取24 h。隨后于4 ℃條件下以轉速10 000 r/min 離心10 min，所得上清液用于測定。

1.4.3 總酚含量的測定

總酚含量的測定參照Mirzaei A 等人[9]和Faller A L K 等人[10]的方法，預處理過程同1.4.2。

1.4.4 總抗氧化能力的測定

（1） DPPH 自由基抑制率。DPPH 自由基抑制率的測定參照周晗等人[11]的方法。

（2） 鐵離子還原能力（Ferric reducing antioxidant power，F(xiàn)RAP）。鐵離子還原能力測定過程參考Benzie I F 等人[12]的方法，預處理過程同1.4.2。此外，參照Sdiri S 等人[13]的方法，用L - 抗壞血酸（溶于體積分數(shù)80%乙醇） 作為標準對照，鐵離子還原能力的測定結果表示為抗壞血酸當量。

1.4.5 菌落總數(shù)的測定

菌落總數(shù)的測定參照《食品安全國家標準食品微生物學檢驗 菌落總數(shù)測定（GB/T 4789.2—2010）》，使用菌落總數(shù)測試片進行測定。

1.4.6 微生物群落多樣性分析

取常溫貯藏48 h 的卷心菜樣品，用液氮速凍并研碎，置于滅菌離心管內暫存。樣品經(jīng)由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進行16S rDNA 高通量測序。

1.4.7 硝酸鹽潛在安全風險評價方法

A/N 值反映了蔬菜中硝酸鹽和抗氧化能力之間平衡關系，Ding Z 等人[5]研究了利用A/N 值來評估果蔬制品中硝酸鹽對人體健康的影響。通過A/N 值來反映烹飪過程對蔬菜硝酸鹽和抗氧化能力的綜合作用，并以此評價蔬菜的硝酸鹽潛在安全風險。根據(jù)Ding Z 等人[5]的描述，蔬菜中硝酸鹽總量的6.5%被用于計算為預測體內亞硝酸鹽。A/N 值的計算公式如下：

式中：AAE——抗氧化能力的抗壞血酸當量，mmol/kg；

Ni——亞硝酸鹽含量，mmol/kg；

Nv——預測體內亞硝酸鹽含量，mmol/kg，相當于硝酸鹽摩爾量的6.5%。

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析

所有數(shù)據(jù)使用SPSS 23.0 軟件進行單因素方差分析（ANOVA），p＜0.05 表示差異顯著。使用Origin 2021 軟件進行數(shù)據(jù)處理并繪圖。

2 結果與分析

2.1 貯藏過程中卷心菜鮮重的變化

蔬菜在貯藏過程中仍舊進行呼吸代謝和水分蒸騰作用，隨著貯藏時間的延長，蔬菜中的水分和有機物會不斷減少[7]，因此蔬菜的鮮質量變化能直觀地反映蔬菜在貯藏過程中的品質變化。

貯藏過程中卷心菜鮮質量的變化見圖1。

圖1 貯藏過程中卷心菜鮮質量的變化

卷心菜在袋裝貯藏條件下鮮質量的下降速率較慢，貯藏96 h 時袋裝貯藏試驗組的鮮質量減少量均低于3%（見圖1）。在散裝貯藏的條件下，卷心菜的鮮質量相對于袋裝貯藏條件大幅減少。由于袋裝貯藏的封閉環(huán)境中水分難以外溢，環(huán)境中的濕度上升，抑制了蔬菜的蒸騰作用，減少了水分的散失。除袋裝貯藏方式外，貯藏溫度對鮮質量也有顯著影響（p＜0.05）。在低溫貯藏條件下，鮮質量的減少量要明顯低于常溫貯藏條件，散裝常溫貯藏的卷心菜鮮質量在96 h 時減少了19.5%，而散裝低溫貯藏的卷心菜鮮質量在96 h 時僅減少4.6%。

2.2 貯藏過程中卷心菜硝酸鹽和亞硝酸鹽含量的變化

貯藏過程中卷心菜硝酸鹽和亞硝酸鹽的含量見圖2。

圖2 貯藏過程中卷心菜硝酸鹽和亞硝酸鹽的含量

由圖2（a） 可知，卷心菜的硝酸鹽含量在貯藏過程中呈先增加后降低的趨勢，在貯藏48 h 時散裝常溫組、袋裝常溫組、散裝低溫組和袋裝低溫組分別增加了69.10%，77.53%，122.34%，78.32%。卷心菜在貯藏初期硝酸鹽含量增加是由于在采收和貯藏過程中產(chǎn)生了機械損傷，觸發(fā)植物抗逆性機制，使得植物組織的呼吸作用加強，此時蔬菜體內的含氮有機物代謝增強，引起硝酸鹽含量的增加[14-15]。其中，散裝低溫貯藏時硝酸鹽的增加量最高，可能是由于低溫環(huán)境對卷心菜產(chǎn)生了低溫脅迫，進一步增強植物的抗逆性機制，使硝酸鹽含量上升；另一方面，袋裝貯藏卷心菜的硝酸鹽含量低于同溫度下的散裝貯藏組，表明袋裝條件可能抑制卷心菜中有機物的分解[15]。貯藏48 h 后，卷心菜的硝酸鹽含量開始降低，可能是由于蔬菜自身合成代謝開始大量消耗硝酸鹽。此外，許多微生物也具有代謝或還原硝酸鹽的能力，從而促使卷心菜的硝酸鹽含量降低。

由圖2（b） 可知，卷心菜在貯藏過程中亞硝酸鹽含量呈上升趨勢。蔬菜中的亞硝酸鹽主要來源于硝酸鹽還原酶的作用，正常情況下蔬菜體內形成的亞硝酸鹽會被亞硝酸鹽還原酶迅速還原成氨，并用于后續(xù)的有機物合成。在貯藏過程中，除蔬菜自身含有的硝酸鹽還原酶外，侵染蔬菜的微生物也能夠分泌硝酸鹽還原酶，從而導致亞硝酸鹽含量呈上升趨勢[16]。

2.3 貯藏過程中卷心菜菌落總數(shù)的變化

蔬菜在采收過程中會不可避免地進行剪切和割斷，而在后續(xù)分銷與貯藏過程中也容易因碰撞、擠壓和包裝而產(chǎn)生新的傷口，給予了微生物侵染蔬菜的機會。微生物可以利用蔬菜內部組織的營養(yǎng)物進行繁殖，產(chǎn)生危害物質的同時引起蔬菜的快速腐敗，菌落的數(shù)量是影響蔬菜安全品質和貯藏周期的重要因素[17]。

貯藏過程中菌落總數(shù)的變化見圖3。

圖3 貯藏過程中菌落總數(shù)的變化

散裝常溫貯藏時卷心菜的菌落總數(shù)增加最多，在12 h 時就已超過104CFU/g，而散裝低溫貯藏時菌落總數(shù)始終沒有顯著變化（p＞0.05），表明低溫條件顯著抑制了微生物的生長繁殖，低溫貯藏時微生物活動可能不是導致蔬菜硝酸鹽安全風險變化的主要因素。

2.4 貯藏條件對卷心菜微生物群落多樣性的影響

由于低溫貯藏時微生物可能不是影響卷心菜硝酸鹽安全風險變化的主要因素，而常溫貯藏時微生物菌落總數(shù)顯著增加（見圖3），為進一步分析常溫貯藏時的微生物活動對硝酸鹽潛在安全風險的影響，因此對常溫貯藏48 h 時的樣品進行微生物群落多樣性分析。

常溫貯藏48 h 時樣品Alpha 多樣性指數(shù)見表2。

表2 常溫貯藏48 h 時樣品Alpha 多樣性指數(shù)

ACE 指數(shù)和Chao1 指數(shù)反映了樣品中微生物群落物種種類的豐富程度，其數(shù)值越高表明微生物群落物種種數(shù)越多。由表2 可知，卷心菜在散裝貯藏和袋裝貯藏48 h 后ACE 指數(shù)和Chao1 指數(shù)降低。其中，袋裝貯藏組的ACE 指數(shù)和Chao1 指數(shù)高于散裝貯藏組，表明袋裝貯藏時卷心菜的微生物種類豐富度要高于散裝貯藏。

Shannon 指數(shù)和Simpson 指數(shù)反映了樣品中微生物種群的相對密度，Shannon 指數(shù)越高表明群落多樣性越高，Simpson 指數(shù)越高表明群落多樣性越低。由表2 可知，散裝貯藏和袋裝貯藏均導致Shannon 指數(shù)升高而Simpson 指數(shù)降低，但2 種貯藏方式的差別不明顯。

常溫貯藏48 h 時微生物群落多樣性變化見圖4。

圖4 常溫貯藏48 h 時微生物群落多樣性變化

通過16S rDNA 高通量測序對樣品上的微生物種類進行鑒定（見圖4），假單胞菌屬、束毛球菌屬、叢毛單胞菌屬等菌屬為主要菌群。在卷心菜的袋裝貯藏過程中，假單胞菌屬相對豐度相比原料增加了21.9%。假單胞菌屬是一種在植物葉片上廣泛分布的細菌，在厭氧條件下能利用硝酸鹽進行呼吸代謝[18]。在袋裝貯藏的微氧條件下，假單胞菌屬利用硝酸鹽厭氧代謝的特點使其成為優(yōu)勢菌群，假單胞菌屬的大量繁殖可能是導致袋裝貯藏時卷心菜硝酸鹽增加量相對于散裝貯藏更低的原因之一。卷心菜在貯藏48 h 后觀察到叢毛單胞菌屬的相對豐度增加，且散裝貯藏時的相對豐度要大于袋裝貯藏。根據(jù)李正魁等人[20]的研究，叢毛單胞菌屬具有短程硝化功能，能夠快速代謝硝酸鹽和亞硝酸鹽，表明在卷心菜在貯藏過程中硝酸鹽含量的降低可能是由于叢毛單胞菌屬的作用。

2.5 貯藏過程中卷心菜抗壞血酸和總酚含量的變化

貯藏過程中卷心菜抗壞血酸和總酚含量見圖5。

圖5 貯藏過程中卷心菜抗壞血酸和總酚含量

卷心菜的抗壞血酸含量在貯藏24 h 時出現(xiàn)了短暫上升，而后持續(xù)下降?？箟难崾且环N不穩(wěn)定的抗氧化物，因此在貯藏過程中會不斷被消耗導致含量降低。由于采收時的切割傷害引發(fā)了蔬菜自身的抗氧化機制，蔬菜組織不斷用糖類物質合成新的抗壞血酸，導致抗壞血酸含量在貯藏初期短暫增加[21]。此外，貯藏溫度和袋裝條件對抗壞血酸含量的影響不顯著，與前人的研究不符[7]，可能是由于試驗中分裝處理產(chǎn)生的傷口過多，導致營養(yǎng)物質暴露，加速了抗壞血酸的消耗。

卷心菜的總酚含量在貯藏過程中均呈先上升后下降的趨勢，在貯藏48 h 時增加至最大。其中，低溫貯藏的卷心菜總酚含量在貯藏前48 h 相對于常溫貯藏更低，可能是由于低溫貯藏會提高過氧化物酶（POD） 的活性，而POD 酶能催化酚類化合物的氧化和聚合，從而導致總酚含量較低[22]。多酚是蔬菜自然抗逆性的誘導因子之一，貯藏過程前期蔬菜總酚含量的增加可能與蔬菜自身的抗逆性調節(jié)有關[23]。

2.6 貯藏過程中卷心菜總抗氧化能力的變化

貯藏過程中卷心菜的總抗氧化能力見圖6。

圖6 貯藏過程中卷心菜的總抗氧化能力

卷心菜的DPPH 自由基抑制率和鐵離子還原能力隨貯藏時間均呈先降后升的趨勢，在貯藏前期（0～24 h） 分別減少了27.29%～61.19%和18.66%～39.41%，其變化趨勢與卷心菜抗壞血酸和總酚含量的變化趨勢一致（見圖5）。其中，常溫貯藏卷心菜的總抗氧化能力在12 h 后開始快速上升，而低溫貯藏組則在24 h 后開始上升，表明低溫貯藏在貯藏初期抑制了蔬菜自身的抗氧化機制；另一方面，袋裝貯藏卷心菜的總抗氧化能力要高于相同溫度下散裝貯藏的卷心菜，可能是由于相對封閉的貯藏環(huán)境減少了卷心菜傷口在空氣中的暴露程度，抗氧化物的消耗量相對更低。

2.7 貯藏過程中卷心菜的硝酸鹽潛在安全風險評價

抗氧化性/體內亞硝酸鹽比值（A/N） 直觀地反映了蔬菜中硝酸鹽和抗氧化能力之間平衡關系的變化，在前人的體外模型試驗中，當抗壞血酸與亞硝酸鹽的摩爾比大于2∶1 時，亞硝胺的形成能被完全阻斷[5]。因此，基于A/N 值來評估卷心菜中的硝酸鹽對人體健康產(chǎn)生的潛在安全風險。該比值的本質是反映蔬菜中硝酸鹽被人體攝入后產(chǎn)生亞硝酸鹽危害的可能性，比值越高說明硝酸鹽潛在安全風險越低。

貯藏過程中卷心菜的抗氧化性/體內亞硝酸鹽比值（A/N） 見圖7。

圖7 貯藏過程中卷心菜的抗氧化性/體內亞硝酸鹽比值（A/N）

由圖7 可知，卷心菜的A/N 值在貯藏過程貯藏的前24 h 較低，其原因在于貯藏初期（24 h 內） 卷心菜硝酸鹽含量增加且總抗氧化能力下降，而在貯藏24 h 后卷心菜的總抗氧化能力開始上升，因而A/N 值開始增加。常溫貯藏的卷心菜在12 h 時A/N值最低，而低溫貯藏的卷心菜則在24 h 時最低，這一現(xiàn)象與卷心菜總抗氧化能力的變化有關，低溫可能延緩了卷心菜自身抗氧化能力的上升，合成抗氧化物的速率要低于常溫貯藏；另一方面，袋裝貯藏卷心菜的A/N 值要高于同溫度條件下的散裝貯藏，與硝酸鹽含量和總抗氧化能力的變化趨勢類似，表明卷心菜在相對封閉的貯藏環(huán)境中產(chǎn)生的硝酸鹽潛在安全風險更低。

綜上所述，卷心菜在袋裝常溫貯藏時硝酸鹽潛在安全風險相對較低。但A/N 值僅代表硝酸鹽被人體攝入后產(chǎn)生亞硝酸鹽危害的可能性，而非直接反映蔬菜的整體食用安全性，如考慮微生物污染等因素，低溫顯然能較好地保存原料營養(yǎng)成分，避免微生物生長繁殖。

3 結論

研究了卷心菜在貯藏過程中硝酸鹽含量與抗氧化能力之間平衡關系的變化，以此來評價卷心菜的硝酸鹽潛在安全風險。低溫貯藏有效抑制了菌落總數(shù)的增加，但同時也促進了卷心菜硝酸鹽含量的增加并降低了總抗氧化能力，因此硝酸鹽潛在安全風險相對常溫貯藏時更高。袋裝貯藏時，具有厭氧代謝硝酸鹽能力的假單胞菌屬相對豐度明顯增加，可能是硝酸鹽增加量相對于散裝貯藏時更低的原因。基于A/N 值的評價結果，卷心菜在袋裝常溫貯藏時硝酸鹽潛在安全風險更低。研究了貯藏方式對卷心菜硝酸鹽潛在安全風險的影響，但對于卷心菜食用安全性的最適貯藏條件，應同時綜合考慮其他安全要素。