趙廣偉,楊小玲,張孟奇,蘇勤智,陳 鳳*

(1.河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院 動(dòng)物科技學(xué)院,河南 鄭州 450046;2.中山大學(xué)附屬第七醫(yī)院 消化醫(yī)學(xué)中心,廣東 深圳518107)

采用基因轉(zhuǎn)染技術(shù)將目的基因片段導(dǎo)入到受體細(xì)胞中,是探索基因功能、生產(chǎn)基因編輯動(dòng)物等重要的技術(shù)環(huán)節(jié)。高效的基因轉(zhuǎn)染效率與轉(zhuǎn)染方法和所轉(zhuǎn)染的供體細(xì)胞密切相關(guān),適宜的轉(zhuǎn)染方法和恰當(dāng)?shù)墓w細(xì)胞對(duì)提高基因轉(zhuǎn)染效率具有重要意義。增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)常用作報(bào)告基因來(lái)反映轉(zhuǎn)染效率的高低[1]。目前報(bào)道用于導(dǎo)入外源基因的轉(zhuǎn)染方法包括磷酸鈣法、脂質(zhì)體法、病毒載體法、電穿孔法、顯微注射法和羅氏轉(zhuǎn)染試劑等[2-3],這些方法都有各自的優(yōu)點(diǎn)和局限性,其中應(yīng)用最為廣泛的是具有用時(shí)短、操作容易、適用范圍廣特性的脂質(zhì)體、羅氏轉(zhuǎn)染試劑和電穿孔法。

基因編輯豬的生產(chǎn)具有重要的研究?jī)r(jià)值,可用于人源化器官培養(yǎng)、器官移植和人類疾病模型等生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中[4]。廣西巴馬小型豬不僅在生理結(jié)構(gòu)、新陳代謝和解剖學(xué)等方面與人類相近,而且其體型矮小更便于試驗(yàn)操作,被認(rèn)為是生物醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域的理想的模型動(dòng)物[5]。豬體細(xì)胞克隆基因編輯手段是醫(yī)學(xué)模型研發(fā)中的主要工具之一,通常易獲得且培養(yǎng)和操作簡(jiǎn)單的豬成纖維細(xì)胞(porcine fetal fibroblasts,PFFs),被用作基因編輯豬的供體細(xì)胞。另外,研究顯示間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells,MSCs)具有易于導(dǎo)入和穩(wěn)定高效表達(dá)外源基因的優(yōu)點(diǎn)[6-7]。多項(xiàng)研究已證實(shí)MSCs作為供體細(xì)胞用于核移植以形成重構(gòu)胚時(shí),其囊胚率和克隆后代的出生率均明顯高于PFFs[8-9]。考慮到轉(zhuǎn)染方法對(duì)不同細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效果影響較大,因此在實(shí)驗(yàn)室以往研究的基礎(chǔ)上[10],本研究選取EGFP作為報(bào)告基因,通過(guò)比較分析脂質(zhì)體、羅氏轉(zhuǎn)染試劑和電穿孔法轉(zhuǎn)染PFFs、脂肪干細(xì)胞(adipose-derived stem cells,ADSCs)和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)的效果,以期篩選更優(yōu)的轉(zhuǎn)染方法和供體細(xì)胞,為生產(chǎn)基因編輯巴馬小型豬奠定試驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 選取來(lái)自廣西大學(xué)扶綏實(shí)驗(yàn)基地的廣西巴馬小型豬的骨髓、脂肪和耳源組織;pEGFP-N1質(zhì)粒載體(4.7 kb)購(gòu)自北京啟研生物有限公司;電轉(zhuǎn)核轉(zhuǎn)染液購(gòu)自碧云天生物公司;去內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒來(lái)源于Qiagen公司;膠原酶購(gòu)自Sigma公司;Lipofectamine TM 2 000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒和羅氏X-tremeGENE HP DNA 轉(zhuǎn)染試劑分別購(gòu)自Invitrogen公司和Roche公司;高糖DMEM培養(yǎng)基、Opti-MEM培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco公司,胎牛血清(FBS,OriCell)購(gòu)自廣州賽業(yè)、0.25%胰蛋白酶-EDTA購(gòu)自碧云天。

1.2 方法

1.2.1 質(zhì)粒提取 將保存在-80 ℃冰箱中的載體菌種取出置于冰上,取10 μL接種到含有氨芐青霉素抗性的10 mL液體LB培養(yǎng)基中,放置在37 ℃、200 r/min 條件下的震蕩培養(yǎng)8～12 h。然后按照1∶1000的比例取相應(yīng)量活化后的載體菌液轉(zhuǎn)接到液體LB培養(yǎng)基中,在相同條件下繼續(xù)震蕩培養(yǎng)8～12 h后按照Qiagen去內(nèi)毒素的質(zhì)粒大提試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行質(zhì)粒提取,最后采用分光光度計(jì)測(cè)定質(zhì)粒濃度,放置在-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 細(xì)胞分離培養(yǎng) 參照實(shí)驗(yàn)室已報(bào)道的細(xì)胞培養(yǎng)方法[5,11],分別采用膠原酶消化法、骨髓抽取法和組織塊貼壁法獲得ADSCs、BMSCs和PFFs的原代細(xì)胞。采用細(xì)胞完全培養(yǎng)液(高糖DMEM培養(yǎng)基+10%FBS+1%雙抗)在細(xì)胞生長(zhǎng)到80%～90%匯合度時(shí)進(jìn)行傳代培養(yǎng)。選取P3～P4的體細(xì)胞匯合度為70%～80%進(jìn)行后續(xù)轉(zhuǎn)染試驗(yàn)。

1.2.3 電穿孔法轉(zhuǎn)染 胰酶消化后,離心收集各備轉(zhuǎn)細(xì)胞加入少量培養(yǎng)液進(jìn)行重懸,經(jīng)細(xì)胞計(jì)數(shù)后將密度調(diào)整為每毫升106個(gè)細(xì)胞。離心棄上清后加入200 μL核轉(zhuǎn)染液,混勻后再向其中加入6 μg pEGFP-N1質(zhì)粒,于室溫靜置5 min,最后將混合物轉(zhuǎn)移至2 mm電擊杯中。電轉(zhuǎn)參數(shù)參照本實(shí)驗(yàn)室前期摸索的條件,設(shè)定為:180 v、10 ms、2 mm、1次電擊[10-11]。電擊完成后將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)皿中,12 h后更換為完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)36～48 h。

1.2.4 羅氏轉(zhuǎn)染 轉(zhuǎn)染開始前先將細(xì)胞的培養(yǎng)液換成不含雙抗的細(xì)胞正常培養(yǎng)液,然后按照X-tremeGENE HP DNA 試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染液的配制。6孔板細(xì)胞的轉(zhuǎn)染液用量和配制過(guò)程為:在500 μL DMEM培養(yǎng)基中加入3.0 μg pEGFP-N1質(zhì)粒DNA和9 μL轉(zhuǎn)染試劑(質(zhì)量體積比為1∶3),混勻后室溫靜置30 min,最后將轉(zhuǎn)染復(fù)合物逐滴加入到細(xì)胞培養(yǎng)液中,輕輕搖晃混勻后放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36～48 h。

1.2.5 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染 轉(zhuǎn)染開始前先將培養(yǎng)液更換為Opti-MEM轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基,按照LipofectamineTM2 000轉(zhuǎn)染試劑盒的說(shuō)明書配制6孔板培養(yǎng)細(xì)胞的轉(zhuǎn)染液,其中液體Ⅰ組分為2.0 μg pEGFP-N1質(zhì)粒DNA和250 μL Opti-MEM轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基,液體Ⅱ組分為10 μL Lipofectamine TM 2 000 試劑和250 μL Opti-MEM培養(yǎng)基。液體Ⅰ和Ⅱ配制后各自于室溫下靜置5 min后混合在一起,混勻后于室溫靜置20 min。最后將混合液輕輕逐滴加到待轉(zhuǎn)細(xì)胞培養(yǎng)液中,輕微搖晃混勻后繼續(xù)培養(yǎng)6 h,之后更換成細(xì)胞完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)42 h。

1.2.6 細(xì)胞存活率分析 細(xì)胞轉(zhuǎn)染過(guò)程中將未進(jìn)行轉(zhuǎn)染的供體細(xì)胞作為對(duì)照組,并經(jīng)過(guò)細(xì)胞計(jì)數(shù)后確保各孔細(xì)胞接種時(shí)的數(shù)量一致。在轉(zhuǎn)染48 h時(shí),用胰酶消化收集各組細(xì)胞,流式分析前先取少量細(xì)胞進(jìn)行臺(tái)盼藍(lán)染色,再用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板進(jìn)行計(jì)數(shù)。細(xì)胞相對(duì)存活率即為各轉(zhuǎn)染組與相同細(xì)胞未轉(zhuǎn)染對(duì)照組活細(xì)胞數(shù)量的比值。

1.2.7 轉(zhuǎn)染效率的檢測(cè) 各組細(xì)胞在轉(zhuǎn)染48 h后通過(guò)倒置熒光顯微鏡觀察EGFP的表達(dá)情況,并拍照記錄。胰酶消化收集各組細(xì)胞,用PBS進(jìn)行重懸,流式細(xì)胞儀檢測(cè)表達(dá)綠色熒光細(xì)胞的比例?；趯?duì)照組的自發(fā)熒光水平來(lái)設(shè)置門控條件標(biāo)準(zhǔn),對(duì)比分析不同轉(zhuǎn)染方法和不同來(lái)源細(xì)胞條件下的細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率。

1.2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 細(xì)胞相對(duì)存活率和轉(zhuǎn)染效率數(shù)據(jù)用平均數(shù)(Mean)±標(biāo)準(zhǔn)差(SD)來(lái)表示,試驗(yàn)重復(fù)3次。試驗(yàn)采用SPSS26.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素ANOVA檢驗(yàn),以P<0.05表示有統(tǒng)計(jì)差異,以P<0.01表示差異顯著,P<0.001表示差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 細(xì)胞原代分離培養(yǎng)

3種體細(xì)胞的原代分離培養(yǎng)結(jié)果如圖1所示。脂肪組織塊經(jīng)膠原酶消化后進(jìn)行培養(yǎng),第5天培養(yǎng)皿底有部分呈成纖維樣的細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)(圖1A);骨髓抽取后接種到培養(yǎng)皿中,24 h后觀察到少許未伸展開的細(xì)胞在皿底貼壁生長(zhǎng)(圖1B);耳緣組織采用經(jīng)典的組織塊貼壁法進(jìn)行分離培養(yǎng),第6天組織塊周圍有大量細(xì)胞往外生長(zhǎng)、延伸,形狀呈典型的梭狀(圖1C)。

2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染效果觀察

電穿孔法、脂質(zhì)體和羅氏轉(zhuǎn)染試劑介導(dǎo)EGFP基因轉(zhuǎn)染豬ADSCs、BMSCs和PFFs 48 h后,在熒光顯微鏡下可觀察到不同程度的綠色熒光表達(dá)(圖2),初步表明不同的方法轉(zhuǎn)染豬不同體細(xì)胞效果不同。

圖2 EGFP在轉(zhuǎn)染48 h的表達(dá)情況

2.3 流式分析細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率

3種方法轉(zhuǎn)染細(xì)胞48 h后進(jìn)行流式分析,結(jié)果表明(圖3),轉(zhuǎn)染效率從高到低依次為電穿孔法>羅氏轉(zhuǎn)染試劑>脂質(zhì)體,電穿孔法在ADSCs和BMSCs的轉(zhuǎn)染效率高達(dá)80%,轉(zhuǎn)染PFFs的效率也大于60%,明顯高于羅氏轉(zhuǎn)染試劑和脂質(zhì)體在相同細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染效率(P<0.001)。此外,羅氏轉(zhuǎn)染試劑的轉(zhuǎn)染效率(約20%)也顯著高于脂質(zhì)體(約10%)(P<0.01)。

圖3 不同方法轉(zhuǎn)染體細(xì)胞的效率比較

相同方法轉(zhuǎn)染不同體細(xì)胞的比較見(jiàn)圖4。由圖4可見(jiàn),采用羅氏和脂質(zhì)體試劑分別轉(zhuǎn)染ADSCs、BMSCs和PFFs的效率無(wú)顯著性差異(P>0.05),而電穿孔法轉(zhuǎn)染MSCs的效率均顯著高于PFFs(P<0.01),但ADSCs和BMSCs間差異不顯著(P>0.05)。

2.4 細(xì)胞存活率分析

3種體細(xì)胞采用不同方法進(jìn)行轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞存活率情況如圖5所示。由圖5可見(jiàn),從高到低依次為羅氏轉(zhuǎn)染試劑>脂質(zhì)體>電穿孔法,使用羅氏和脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞存活率未見(jiàn)顯著性差異(P>0.05),但二者均顯著高于采用電穿孔法轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞存活率(P<0.001)。

圖5 不同方法轉(zhuǎn)染相同體細(xì)胞的細(xì)胞存活率比較

采用同樣方法轉(zhuǎn)染豬不同體細(xì)胞的細(xì)胞存活率比較如圖6所示。由圖6可見(jiàn),羅氏和脂質(zhì)體試劑轉(zhuǎn)染3種體細(xì)胞的細(xì)胞存活率均在90%左右,而電穿孔法轉(zhuǎn)染3種體細(xì)胞的細(xì)胞存活率約為60%,3種體細(xì)胞在使用相同方法進(jìn)行轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞存活率差異不顯著(P>0.05)。

圖6 相同方法轉(zhuǎn)染不同體細(xì)胞的細(xì)胞存活率比較

3 討 論

基因轉(zhuǎn)染方法和供體細(xì)胞類型的選擇是外源基因最終能否獲得穩(wěn)定高效表達(dá)的關(guān)鍵。不同來(lái)源的細(xì)胞因其生長(zhǎng)特性不同,因此接受外源DNA的能力是不相同的。選取適宜的轉(zhuǎn)染方法將含有目的基因的片段導(dǎo)入到供體細(xì)胞中,并在其中高效、穩(wěn)定的表達(dá)是生產(chǎn)基因編輯動(dòng)物過(guò)程的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。本研究選用在體細(xì)胞克隆中常用的MSCs和PFFs作為供體細(xì)胞,利用實(shí)驗(yàn)室前期優(yōu)化的電穿孔轉(zhuǎn)染程序以及商品化的脂質(zhì)體和羅氏試劑,將pEGFP-N1載體分別轉(zhuǎn)染上述細(xì)胞,系統(tǒng)地比較不同方法和不同細(xì)胞條件轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞相對(duì)存活率和轉(zhuǎn)染效率,為進(jìn)一步的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染、篩選基因編輯陽(yáng)性細(xì)胞用于基因編輯克隆豬的生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

研究者通過(guò)優(yōu)化膠原酶類型(Ⅰ型、Ⅱ型、混合型)濃度(0.075%～0.2%)和作用時(shí)間(0.5～2.5 h),建立從脂肪組織獲取ADSCs的方法。BMSCs的分離培養(yǎng)常常使用密度梯度離心法、細(xì)胞貼壁法和免疫磁珠法等。而采用抽取骨髓液置于皿內(nèi)進(jìn)行細(xì)胞貼壁培養(yǎng)的方法分離獲取BMSCs,不僅過(guò)程簡(jiǎn)單易操作,而且不易受到污染。本研究分別采用經(jīng)過(guò)證實(shí)且具有良好效果的膠原酶消化法、骨髓抽取法和組織塊貼壁法分別進(jìn)行原代細(xì)胞分離培養(yǎng),成功獲得了具備典型形態(tài)特征的 ADSCs、BMSCs 和 PFFs[11],它們傳至P5仍具有較快的增殖速度和良好的細(xì)胞形態(tài),可用于轉(zhuǎn)染試驗(yàn)。本研究結(jié)果顯示,3種轉(zhuǎn)染方法均可實(shí)現(xiàn)外源基因EGFP在ADSCs、BMSCs和PFFs的表達(dá)。其中,電穿孔法轉(zhuǎn)染豬體細(xì)胞的效率最高,但其細(xì)胞相對(duì)存活率低于其他兩種方法。前期研究結(jié)果顯示,電穿孔轉(zhuǎn)染中電壓的大小對(duì)細(xì)胞損傷和存活率影響最大,相對(duì)較高的電壓會(huì)提高轉(zhuǎn)染效率,但細(xì)胞的存活率隨著轉(zhuǎn)染效率的升高而降低[12]。另一項(xiàng)研究認(rèn)為,使細(xì)胞的存活率在50%左右時(shí)的電轉(zhuǎn)染參數(shù)獲得的轉(zhuǎn)染效率最佳[13]。本研究采用電穿孔法轉(zhuǎn)染豬三種體細(xì)胞后的存活率均在60%左右,轉(zhuǎn)染效率在60%～80%之間(MSCs轉(zhuǎn)染效果最好),高于其他研究采用優(yōu)化后的電穿孔法轉(zhuǎn)染成纖維細(xì)胞取得的轉(zhuǎn)染效率[14]。這可能與本研究中使用的核轉(zhuǎn)染體系有關(guān),通過(guò)專門懸浮液配方和針對(duì)性的電場(chǎng)脈沖指數(shù)有效提高了轉(zhuǎn)染效率。本研究中,電穿孔轉(zhuǎn)染MSCs的效率高于PFFs,猜測(cè)可能與早期MSCs處于未分化、具備較好的細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)以及適用的轉(zhuǎn)染參數(shù)等因素相關(guān)。目前,已有許多研究使用低細(xì)胞毒性的商業(yè)轉(zhuǎn)染試劑,但對(duì)它們轉(zhuǎn)染效果的評(píng)價(jià)卻不盡相同。本試驗(yàn)結(jié)果表明,羅氏和脂質(zhì)體試劑轉(zhuǎn)染細(xì)胞的毒性均較低,羅氏轉(zhuǎn)染試劑在三種體細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率均比脂質(zhì)體高出一倍,類似于之前多個(gè)文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果[15-16]。本試驗(yàn)脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染豬體細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率低于另一篇文獻(xiàn)的報(bào)道,采用優(yōu)化后的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染體系在PFFs中獲得了20%左右的轉(zhuǎn)染效率[17],這種差異可能與多種因素有關(guān)。研究認(rèn)為,基因轉(zhuǎn)染的過(guò)程會(huì)受到許多不確定的因素影響,如細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)、質(zhì)粒片段的長(zhǎng)度與純度、質(zhì)粒與轉(zhuǎn)染試劑比例、細(xì)胞接觸轉(zhuǎn)染液的時(shí)間等[15,18]。因此,對(duì)不同來(lái)源的細(xì)胞進(jìn)行基因轉(zhuǎn)染操作時(shí),應(yīng)盡可能先優(yōu)化這些因素,以提高轉(zhuǎn)染效果。

綜上所述,脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染雖然對(duì)細(xì)胞存活率的影響不顯著,但獲得的轉(zhuǎn)染效率較低,因此不建議采用脂質(zhì)體試劑轉(zhuǎn)染豬體細(xì)胞。而電穿孔法的應(yīng)用范圍更廣,對(duì)于商品化試劑難以轉(zhuǎn)染的間充質(zhì)干細(xì)胞,也能獲得較高的轉(zhuǎn)染效率,綜合考慮該方法對(duì)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的存活有損傷,建議對(duì)于生長(zhǎng)狀態(tài)較好的豬體細(xì)胞可采用經(jīng)過(guò)優(yōu)化的電穿孔法進(jìn)行轉(zhuǎn)染。