龍 茜,林 潔

(1.湖南中醫(yī)藥大學中醫(yī)學院,長沙 410208; 2.湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科,長沙 410007)

盆腔炎性疾病后遺癥(sequelae of pelvic inflammatory disease,SPID)是育齡期婦女常見的多發(fā)性上生殖道感染性疾病,主要包括子宮內(nèi)膜炎、輸卵管炎和盆腔組織炎等。在臨床上常表現(xiàn)為慢性盆腔痛等反復發(fā)作,甚至造成不孕。現(xiàn)代研究結(jié)果表明,SPID多為病原體感染所致[1]。針對盆腔感染,西醫(yī)治療首選抗菌藥物,具有起效快的特點,但極易產(chǎn)生耐藥性,若治療不徹底則會引起病情反復,進而促進疾病發(fā)展,影響患者的生活質(zhì)量[2]。SPID具有反復發(fā)作的特點,生殖系統(tǒng)周圍組織易因炎癥物質(zhì)滲出而產(chǎn)生局部的纖維性粘連、增生、瘢痕以及損傷等諸多后遺癥[3]。目前,西醫(yī)治療SPID的方法較為單一。中醫(yī)藥治療SPID具有優(yōu)勢,講究辨證論治,因人施治,對不同個體采取不同的治療方案,并且強調(diào)整體觀念,基于“人為一個整體”“天人合一”等觀念而進行辨證施治,在臨床上運用廣泛[4-7]。通過臨床辨證論治總結(jié)與文獻查閱[8],筆者發(fā)現(xiàn)SPID以濕熱蘊結(jié)型最常見。

細胞焦亡是程序性細胞的死亡方式,其可促進炎癥反應形成,主要表現(xiàn)為可引起細胞腫脹、破裂,同時使細胞內(nèi)的炎癥物質(zhì)得到釋放,進而引起炎癥反應[9]。研究發(fā)現(xiàn),細胞焦亡在許多炎癥性疾病的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著重要作用[10-11]。適度的炎癥反應是生理應對異己的正常反應,但過度的炎癥損害則會對機體組織造成傷害。有學者認為,細胞焦亡與中醫(yī)理論中的“痰、瘀、毒”相似,而SPID多為濕熱毒邪所引起,蘊久便成瘀,或與細胞焦亡有密切聯(lián)系[12]。本研究通過生物信息學及分子對接技術分析細胞焦亡與濕熱蘊結(jié)型SPID之間的關聯(lián),并進一步挖掘其相關的天然藥物成分,以期為SPID的治療與研究提供參考。

1 資料與方法

1.1 篩選SPID數(shù)據(jù)集及靶點差異分析

通過GEO數(shù)據(jù)庫(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gds/)檢索與SPID相關的數(shù)據(jù)集,并根據(jù)以下標準進行篩選：(1)樣本量>15;(2)同時包含正常樣本以及疾病樣本。將篩選通過規(guī)范處理后的數(shù)據(jù)集矩陣導入Sanger平臺(http：//vip.sangerbox.com/home.html),對數(shù)據(jù)集中的靶點進行l(wèi)imma差異分析。在分析設置中選定FDR<0.05,表達差異倍數(shù)>1.5,得到靶點差異分析火山圖及熱圖。

1.2 濕熱蘊結(jié)型SPID靶點收集

通過GeneCards(https：//www.genecards.org/)數(shù)據(jù)庫對濕熱蘊結(jié)型SPID進行檢索,以《中藥新藥臨床研究指導原則(試行)》中濕熱蘊結(jié)型SPID的主癥及次癥為依據(jù),輸入“下腹脹痛”“腰骶脹痛”“帶下量多”和“帶下色黃味臭”等主癥,“月經(jīng)過多”“經(jīng)期延長”“神疲乏力”“陰道不規(guī)則出血”“經(jīng)期腹痛”“小便黃”“大便干燥或腹瀉”“舌質(zhì)紅”“苔黃膩”和“脈滑數(shù)”等次癥進行檢索,除重后得到濕熱蘊結(jié)型SPID靶點。

1.3 細胞焦亡靶點收集與分析及與濕熱蘊結(jié)型SPID的共同靶點篩選

在中國知網(wǎng)、萬方數(shù)據(jù)庫和PubMed等文獻數(shù)據(jù)庫中,以“細胞焦亡”“Cell pyrolysis”為關鍵詞進行檢索,通過對文獻的研讀,排除非人類相關基因,篩選與細胞焦亡相關的靶點,歸納整理后通過Reactome數(shù)據(jù)庫(https：//reactome.org)對獲得的靶點進行京都基因與基因組百科全書(KEGG)富集分析以獲得細胞焦亡相關的發(fā)生機制。將收集得到的細胞焦亡相關靶點與濕熱蘊結(jié)型SPID靶點取交集得到三者之間的共同靶點。

1.4 篩選通過細胞焦亡治療濕熱蘊結(jié)型SPID的天然藥物

通過Connectivity map(CMap Build2)平臺(https：//portals.broadinstitute.org/cmap/)預測藥物小分子。CMap平臺可通過與疾病基因表達譜的比較,得到相關小分子化合物,并給予-1～1的分數(shù)。文獻報道,小分子化合物與疾病之間的分數(shù)的絕對值越接近于1,則代表該小分子化合物對疾病更可能有治療作用[13]。通過差異分析得到的SPID靶點與收集得到的濕熱蘊結(jié)型靶點、細胞焦亡靶點取交集后將共同靶點按照在SPID中上調(diào)表達、下調(diào)表達分類,分別命名為“up signature”“down signature”。以*grp的形式導入CMap Build2后得到結(jié)果,結(jié)果以P<0.05、score<0篩選,并按照score大小排序。將所有符合條件的藥物小分子在中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺(TCMSP,https：//old.tcmsp-e.com/index.php)中檢索獲得天然藥物小分子,進一步檢索可獲得其對應的天然藥物。

1.5 共同靶點與天然藥物小分子成分的分子對接驗證

獲得濕熱蘊結(jié)型SPID與細胞焦亡的共同核心靶點所預測得到的天然藥物分子后,將二者進行分子對接,根據(jù)Auto Dock軟件要求,需要收集核心靶點*PDB格式以及天然分子*mol2格式,分別通過PDB數(shù)據(jù)庫(https：//www.rcsb.org/)、TCMSP數(shù)據(jù)庫獲得。通過Auto Dock軟件將化合物及靶蛋白進行對接。將對接結(jié)果導入PyMOL進行可視化處理,對接能量數(shù)據(jù)以熱圖呈現(xiàn)。一般認為,對接能量越低,配體與受體結(jié)合的構(gòu)象越穩(wěn)定,發(fā)生作用的可能性越大。

2 結(jié)果

2.1 GEO數(shù)據(jù)庫篩選SPID數(shù)據(jù)集及靶點差異分析

通過GEO數(shù)據(jù)庫檢索SPID相關的數(shù)據(jù)集,篩選確定GSE165004數(shù)據(jù)集。GSE165004數(shù)據(jù)集發(fā)表于2021年1月18日,包含樣本量72例,其中疾病樣本48例,正常對照樣本24例。將篩選出的數(shù)據(jù)集下載導出并進行數(shù)據(jù)的規(guī)范處理后進行l(wèi)imma差異分析,共得到差異表達靶點3 073個,見圖1。

2.2 濕熱蘊結(jié)型SPID靶點收集

通過GeneCards數(shù)據(jù)庫以濕熱蘊結(jié)型SPID的主癥及次癥為檢索依據(jù)檢索,除重后分別得到主癥及次癥對應靶點7 099、10 714個,經(jīng)過合并除重后共得到11 203個濕熱蘊結(jié)型SPID靶點。

A.火山圖;B.熱圖。A.volcanic map; B.heat map.圖1 數(shù)據(jù)集GSE165004差異表達圖Fig 1 Difference representation diagram of dataset GSE165004

2.3 細胞焦亡靶點收集

通過對數(shù)據(jù)庫進行文獻檢索,得到現(xiàn)有研究中細胞焦亡的相關靶點33個,見表1。對該33個基因靶點進行KEGG分析,結(jié)果顯示,細胞焦亡與免疫、炎癥反應等信號通路相關,見圖2。

圖2 細胞焦亡相關靶點KEGG富集分析Fig 2 Analysis of KEGG enrichment of cell pyroptosis-related targets

2.4 細胞焦亡與濕熱蘊結(jié)型SPID的共同靶點篩選

將收集獲得的細胞焦亡靶點、SPID靶點及其濕熱蘊結(jié)型靶點進行匯總后取交集,最終獲得4個濕熱蘊結(jié)型SPID與細胞焦亡相關的靶點,分別為白細胞介素(IL)18、半胱氨酸蛋白酶(CASP)9、CASP5和NOD樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關蛋白(NLRP)3。其中,IL-18、CASP5和NLRP3為上調(diào)基因,CASP9為下調(diào)基因。

2.5 CMap數(shù)據(jù)庫篩選通過細胞焦亡治療濕熱蘊結(jié)型SPID的天然藥物

通過CMap數(shù)據(jù)庫進行反向預測,以P<0.05且score<0為依據(jù),共獲得了48種藥物成分,通過TCMSP篩選獲得8種天然藥物成分,并進一步檢索以獲得該天然藥物的來源。通過計算分析得到,喜樹堿為最有可能治療SPID的天然小分子藥物,其來源于黑芝麻;芹菜素、小檗堿和金合歡素來源于多種天然藥物包括清熱利濕藥如黃柏、敗醬草和虎杖等;金合歡素與芹菜素共同來源于天然藥物敗醬草,見表2。

2.6 共同靶點與天然藥物小分子成分的分子對接驗證

通過Auto dock將共同靶點與天然藥物小分子進行對接,其中天然成分小分子哈爾滿、玫瑰樹堿因出現(xiàn)錯誤對接失敗。分子對接結(jié)果顯示,共同靶點與天然藥物小分子的結(jié)合能均<0,提示兩者可自發(fā)地結(jié)合。分析分子對接結(jié)果可見,靶點CASP5與配體分子小檗堿的結(jié)合能最低,為-5.45 kJ/mol,表明該配體與受體的構(gòu)象最為穩(wěn)定。具體對接結(jié)果見圖3。選取每種天然小分子與其對應靶點結(jié)合能量最低的結(jié)果進行可視化,見圖4。

圖3 預測靶點與各成分的結(jié)合能量熱圖(kJ/mol)Fig 3 Energy heat map of binding of the predictive target and each component (kJ/mol)

表2 CMap數(shù)據(jù)庫篩選潛在與細胞焦亡相關的濕熱蘊結(jié)型SPID天然藥物成分Tab 2 CMap database calculation of potential natural pharmaceutical components for cell pyroxeposis-related SPID of damp-heat accumulation type

A.小檗堿與CASP5(結(jié)合能-5.45 kJ/mol);B.金合歡素與IL-18(結(jié)合能-3.60 kJ/mol);C.葶藶苷與CASP9(結(jié)合能-3.34 kJ/mol);D.喜樹堿與CASP5(結(jié)合能-4.62 kJ/mol);E.荷包牡丹堿與CASP5(結(jié)合能-4.53 kJ/mol);F.芹菜素與CASP5(結(jié)合能-3.97 kJ/mol)。A.berberine with CASP5 (binding energy -5.45 kJ/mol); B.acacetin with IL-18 (binding energy -3.60 kJ/mol); C.helveticoside with CASP9 (binding energy -3.34 kJ/mol); D.camptothecin with CASP5 (binding energy -4.62 kJ/mol); E.bicuculline with CASP5 (binding energy -4.53 kJ/mol); F.apigenin with CASP5 (binding energy -3.97 kJ/mol).圖4 各成分與關鍵靶點的對接位點及對接能量Fig 4 Docking site and docking energy of each component and key target

3 討論

SPID是困擾現(xiàn)代育齡期婦女的一類常見疾病,多由盆腔炎治療不徹底、遷延不愈發(fā)展而來。臨床以濕熱蘊結(jié)型較常見。通過明確細胞焦亡與濕熱蘊結(jié)型SPID共同的表達靶點并定位其具體天然藥物成分,或可為SPID的治療帶來創(chuàng)新。

本研究通過生物信息學分析得出細胞焦亡與濕熱蘊結(jié)型SPID的共同靶點為IL-18、CASP9、CASP5和NLRP3。IL-18、炎癥小體NLRP3在各類慢性炎癥如潰瘍性結(jié)腸炎、腸息肉等[14-15]中均有表達。NLRP3可促進其下游的炎癥因子IL-18的表達而使組織發(fā)生纖維化[16]。有研究表明,CASP5可通過其底物GSDMD介導細胞焦亡,而細胞焦亡可控制炎癥小體依賴性細胞因子的分泌,并有助于抗菌防御和炎癥小體介導的自身炎癥疾病[17]。另有研究發(fā)現(xiàn),隨著IL-18的表達水平升高,部分細胞發(fā)生焦亡越多,死亡的細胞又可通過釋放炎癥信號導致更多的細胞因焦亡而死亡,進而加劇損傷性的炎癥反應,導致組織發(fā)生持續(xù)感染[18]。在SPID的發(fā)生、發(fā)展中,組織纖維化是引起后遺癥的關鍵病因,多由長久的炎癥物質(zhì)的釋放造成,導致盆腔組織廣泛粘連,進而出現(xiàn)如慢性盆腔痛等后遺癥[19]。通過改善過度的炎癥反應所引起的組織粘連,可以延緩SPID的發(fā)展,緩解患者的不適癥狀。

通過對關鍵靶點反向預測計算分析,可得到天然藥物成分有小檗堿、玫瑰樹堿、金合歡素、哈爾滿、葶藶苷、喜樹堿、荷包牡丹堿和芹菜素8種。小檗堿是具有廣泛抗炎和免疫調(diào)節(jié)作用的藥物,多從黃連、黃柏等清熱解毒藥物中提取。有研究表明,小檗堿可通過干預NLPR3而抑制過度的炎癥反應發(fā)生[20]。荷包牡丹堿是γ-氨基丁酸A受體拮抗劑,有研究發(fā)現(xiàn),在脊髓輸注γ-氨基丁酸A受體拮抗劑可緩解關節(jié)的炎癥[21]。玫瑰樹堿是具有抗炎活性、抗腫瘤等功效的生物堿,現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn),其對多種炎癥因子有抑制作用[22-23]。哈爾滿是具有廣泛生物活性的β-咔啉類化合物,研究表明其或可發(fā)揮抗菌作用[24]。喜樹堿是用于各種腫瘤治療的廣譜抗腫瘤藥物,具有一定的生物毒性,可抑制IL-6、IL-1β的表達,減輕組織水腫[25]。金合歡素、芹菜素為天然黃酮類化合物,共同來源于天然藥物敗醬草,在中醫(yī)理論中,敗醬草具有清熱解毒、活血化瘀止痛的功用。金合歡素具有抗炎、抗纖維化和抗氧化等作用,并可抑制促炎因子IL-6的釋放,從而減緩機體的炎癥反應[26]?，F(xiàn)代研究表明,芹菜素也具有一定的抗炎及抗纖維化作用,可使IL-6、IL-1β和腫瘤壞死因子α等炎癥相關物質(zhì)的血清含量降低[27];可抑制瘢痕組織形成纖維化,并具有促進成纖維細胞凋亡的作用[28]。SPID的治療以抑制過度炎癥反應損傷組織,減少炎性滲出使局部組織發(fā)生纖維化的粘連為主。中醫(yī)認為,SPID多為氣血運行受阻、臟腑氣機不利,加之濕熱下注、蘊久便成瘀,瘀血阻滯胞宮,治則以清熱利濕解毒、行氣活血化瘀為主[29]。通過獲得的天然藥物成分,尋找分析其所來源的天然藥物,發(fā)現(xiàn)芹菜素、小檗堿和金合歡素來源于多種天然藥物,包括清熱利濕藥如黃柏、敗醬草和虎杖等,與中醫(yī)理論所探討的濕熱蘊結(jié)型SPID的治療思路不謀而合。

本研究通過生物信息學分析得到了從細胞焦亡角度治療濕熱蘊結(jié)型SPID的相關靶點及天然藥物成分。其結(jié)果與現(xiàn)有文獻研究觀點基本一致,但關于上述成分是否能明確成為治療濕熱蘊結(jié)型SPID的天然藥物成分,仍需要實驗探究和證明。通過生物信息學計算分析獲得可靠的治療藥物,可為后續(xù)的研究指明方向,對臨床挖掘治療SPID的新藥具有重要意義,同時也可豐富中醫(yī)藥的研究方法,為中醫(yī)藥的研究方向?qū)ふ倚滤悸贰?/p>