關(guān)鍵詞：土霉素；降解菌；DNA測(cè)序鑒定；降解特性；降解途徑

中圖分類(lèi)號(hào)：X172 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1672-2043（2024）12-2991-13 doi：10.11654/jaes.2023-1085

土霉素（Oxytetracycline，OTC）是由鏈霉菌產(chǎn)生的一類(lèi)含有4個(gè)芳香環(huán)的并四苯為結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)的廣譜抗生素，是四環(huán)素類(lèi)抗生素（Tetracycline antibiotics，TCs）之一，能阻止細(xì)菌核糖體酰氨-tRNA同核蛋白結(jié)合，抑制蛋白肽鏈的延長(zhǎng)[1-2]，以及抑制革蘭氏陽(yáng)性和陰性菌、支原體、衣原體、立克次氏體及濾過(guò)性病毒等微生物的生長(zhǎng)繁殖[3]。土霉素具有廣譜抗菌性以及價(jià)格低廉的特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于臨床醫(yī)療和養(yǎng)殖業(yè)等眾多領(lǐng)域[4-6]。土霉素不僅能夠保障人類(lèi)的生命健康，用于動(dòng)植物疾病的治療和預(yù)防，還可以亞治療劑量添加于動(dòng)物飼料，起到刺激動(dòng)物生長(zhǎng)和促進(jìn)增產(chǎn)的作用[7]，使其逐漸成為生產(chǎn)生活不可或缺的組成部分。然而，隨之而來(lái)的是抗生素的過(guò)量使用與違規(guī)濫用。據(jù)統(tǒng)計(jì)我國(guó)每年有超過(guò)8 000 t抗生素被用作飼料添加劑[8]。

抗生素經(jīng)過(guò)人和動(dòng)物腸道時(shí)并不能被完全吸收，有60%～90%會(huì)以原形或代謝產(chǎn)物的形式由糞便和尿液排出體外[9]，導(dǎo)致有相當(dāng)數(shù)量的活性成分進(jìn)入自然環(huán)境中[10-11]并發(fā)生降解反應(yīng)，但其很難完全降解生成二氧化碳和水，而是產(chǎn)生一系列毒性更大的代謝及降解中間產(chǎn)物[12]。這些產(chǎn)物能夠顯著抑制和影響植物的生長(zhǎng)和發(fā)育[13]，抑制光合作用[14]；抑制水生動(dòng)物體內(nèi)多種酶的活性，造成魚(yú)類(lèi)DNA損傷從而產(chǎn)生基因和免疫毒性[3]；殺死有益的微生物，誘導(dǎo)微生物逐漸對(duì)其產(chǎn)生抵抗性，影響微生物正常生長(zhǎng)或繁殖，造成抗藥性菌群的富集及抗性基因（Antibiotic resistancegenes，ARGs）的產(chǎn)生[15-17]。其進(jìn)入食物鏈后對(duì)人類(lèi)健康也會(huì)形成潛在威脅。

環(huán)境中抗生素的殘留已經(jīng)嚴(yán)重危害到動(dòng)植物和人類(lèi)的正常生活和發(fā)展，目前對(duì)環(huán)境抗生素處理的方法大致分為物理化學(xué)法和生物降解法，其中生物降解法投資費(fèi)用低、綠色環(huán)保、無(wú)二次污染，可以用于大面積治理，是治理環(huán)境污染的有效手段[18-19]。目前已從環(huán)境中篩選出的能夠降解環(huán)境中抗生素的細(xì)菌包括產(chǎn)堿桿菌屬、氨氧化細(xì)菌、蒼白桿菌屬、葡萄球菌屬、芽孢桿菌屬和假單胞菌屬等眾多菌屬[20-21]。Shao等[22]的研究表明，菌株KSS10在120h時(shí)對(duì)土霉素的降解率為78.78%，平均去除率為0.145 mg·L^?1·h^?1。Migliore等[23]的研究結(jié)果顯示，真菌Pleurotus ostreatus SMR684能夠在14d內(nèi)完全降解100μg·mL^?1 的土霉素。然而，目前利用具有強(qiáng)耐藥性的菌株降解抗生素的研究實(shí)例不多，且大多是單菌降解抗生素。高效降解菌的篩選和多菌聯(lián)合降解對(duì)于進(jìn)一步處理環(huán)境中抗生素殘留問(wèn)題具有重大意義。因此，本研究選取獸藥中常用的土霉素為代表，篩選出兩株土霉素高效降解菌株，對(duì)其進(jìn)行形態(tài)觀察、生理生化分析及基因測(cè)序分析，考察其最佳降解環(huán)境條件及聯(lián)合降解效果，為降解畜禽糞便和有機(jī)肥殘留抗生素提供理論和技術(shù)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)所用菌株的來(lái)源為本實(shí)驗(yàn)室4 ℃冷藏保存的從蘇州某廢棄農(nóng)藥廠土壤和地下水樣品中純化分離的菌株制成的試管斜面。土霉素標(biāo)準(zhǔn)品（C₂₂H₂₄N₂O₉，純度99.0%）購(gòu)自南京草本源生物科技有限公司。色譜級(jí)甲醇、乙腈、甲酸均購(gòu)自南京晚晴化玻儀器有限公司。試驗(yàn)用水均由艾肯水精靈公司制造的RO超純水機(jī)制備。

1.2 培養(yǎng)基的配制

無(wú)機(jī)鹽液體培養(yǎng)基（MSM）：0.01 g 無(wú)水氯化鈣，1.5 g 三水合磷酸氫二鉀，3g磷酸二氫鉀，0.1 g 硫酸鎂，0.01 g亞乙基二氮基四乙酸，2 g 硝酸鉀，1000 mL超純水，根據(jù)其酸堿性用0.1 mol·L^-1的氫氧化鈉溶液或鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH至7.0。

LB培養(yǎng)基：10 g胰化蛋白胨，5 g酵母提取物，10g 氯化鈉，1000 mL超純水，根據(jù)其酸堿性用0.1 mol·L^-1的氫氧化鈉溶液或鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH至7.0。

高氏合成一號(hào)培養(yǎng)基：20 g可溶性淀粉，1 g硝酸鉀，0.5 g三水合磷酸氫二鉀，0.05 g氯化鈉，0.5 g七水合硫酸鎂，0.01 g七水合硫酸亞鐵，1 000 mL超純水，根據(jù)其酸堿性用0.1 mol·L^-1的氫氧化鈉溶液或鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH為7.2～7.4。

固體培養(yǎng)基按1.5%～2.0%（V/m）的比例添加瓊脂。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1菌株的活化培養(yǎng)

將實(shí)驗(yàn)室保存的菌株試管斜面根據(jù)菌株種類(lèi)不同，分別選取不同的固體培養(yǎng)基，用平板劃線法在無(wú)菌條件下劃線活化，然后置于恒溫培養(yǎng)箱中30 ℃倒置培養(yǎng)48 h，觀察平板上菌落形態(tài)和鏡檢菌體形態(tài)是否一致，如不一致則重新劃線分離純化。最后將得到的菌株斜面保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 菌株的篩選及鑒定

挑取純化的菌種接種到加入50 mg·L^-1 土霉素的固體平板培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)48 h后挑選能夠長(zhǎng)出菌落的菌株，按照3% 的接種量接種于含有50mg·L^-1土霉素且以其為唯一碳源的無(wú)機(jī)鹽液體搖瓶中進(jìn)行復(fù)篩，72 h后取出5 mL 發(fā)酵液，9 500 r·min-1離心15 min，取上清液進(jìn)行真空冷凍干燥。干燥結(jié)束后，用5 mL 甲醇-乙腈（1∶1，V/V）溶解干燥樣品，然后取1 mL經(jīng)0.22 μm有機(jī)微孔濾膜過(guò)濾后裝入棕色色譜瓶待測(cè)。

將篩選出的降解能力強(qiáng)的菌株，送測(cè)序公司（安徽通用生物技術(shù)有限公司）進(jìn)行DNA提取和測(cè)序，根據(jù)16S rDNA測(cè)序結(jié)果，在NCBI網(wǎng)站Gen Bank數(shù)據(jù)庫(kù)在線進(jìn)行98%同源性比對(duì)，確定菌種名稱(chēng)，用MEGA8構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。同時(shí)進(jìn)行菌落形態(tài)和細(xì)菌形態(tài)的觀察，以及菌株的生理生化試驗(yàn)。

1.3.3生長(zhǎng)曲線

將降解菌按3% 接種量接種在含有50 mg·L^-1土霉素的無(wú)機(jī)鹽液體培養(yǎng)基中，30 ℃、130 r·min^-1的條件下?lián)u床培養(yǎng)，每個(gè)處理3次重復(fù)，分別在第0、2、8、16、24、32、40、48、56、64、72、80 小時(shí)采樣，用紫外分光光度計(jì)在600 nm的波長(zhǎng)下測(cè)定菌液的OD值，由此確定菌株的生長(zhǎng)曲線。

1.3.4 制備菌懸液

在LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)純化后的單菌落，于30 ℃、130 r·min^?1恒溫振蕩條件下培養(yǎng)至渾濁，隨后在室溫條件下于4000 r·min^?1離心10 min，保留濕菌體。用無(wú)菌生理鹽水（0.9%的NaCl溶液）對(duì)菌體進(jìn)行重懸，最后用生理鹽水配制成OD600=1.0的菌懸液。

1.3.5 環(huán)境條件對(duì)菌株降解土霉素的影響

將篩選出的降解能力強(qiáng)的兩株菌株按照體積比1∶0、2∶1、1∶1、1∶2、0∶1混合，接種量為1%、2%、3%、4%、5%，土霉素濃度為35、50、65、80、95 mg·L-1，溫度設(shè)置為25、30、35、40 ℃，pH 為5、6、7、8、9，碳源為葡萄糖、蔗糖、淀粉、乙酸鈉、麥芽糖，氮源為明膠、尿素、蛋白胨、硫酸銨、硝酸鈉，調(diào)節(jié)搖床轉(zhuǎn)速為130 r·min^-1，用高效液相色譜儀測(cè)定3d后的OD600和土霉素的濃度，計(jì)算降解率，比較環(huán)境因子對(duì)降解菌降解土霉素的影響。對(duì)照處理?xiàng)l件為：兩菌株體積比1∶1，接種量3%，土霉素濃度50 mg·L^-1，溫度30 ℃，pH 7，不添加碳、氮源。每個(gè)處理均設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

1.3.6 測(cè)定條件

使用高效液相色譜儀（型號(hào)1260，美國(guó)安捷倫公司）測(cè)定土霉素濃度。色譜條件：色譜柱為ZORBAXSB-Aq（250 mm×4.6 mm，5 μm）不銹鋼柱；流動(dòng)相A組分是0.1%甲酸水溶液，B組分是乙腈；柱溫30 ℃；流速0.8 mL·min^-1；進(jìn)樣量20 μL；檢測(cè)器為紫外吸收檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)為278 nm；梯度洗脫程序見(jiàn)表1。

降解率=（對(duì)照樣品的殘余濃度-試驗(yàn)樣品的殘余濃度）/對(duì)照樣品的殘余濃度×100%。

利用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（LC-MS，色譜柱為XBridge C18，250 mm×4.6 mm，5 μm）分析土霉素降解的中間產(chǎn)物。質(zhì)譜條件：電噴霧離子源（ESI），正離子掃描，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM），離子源溫度為150 ℃，脫溶劑氣溫度為500 ℃，掃描范圍為50～600 m/z。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的分離、篩選及生理生化鑒定

經(jīng)過(guò)活化、初篩、復(fù)篩，得到兩株土霉素降解能力較好的菌株W和P2，平板上的P2菌落表面粗糙不透明、微黃色、易挑起，W菌落為圓形、表面光滑、邊緣整齊的乳白色不透明小凸起（圖1），P2為革蘭氏染色陽(yáng)性菌，W 為革蘭氏染色陰性菌（圖2），兩株降解菌的生理生化特征見(jiàn)表2。

將兩株降解菌的16S rDNA測(cè)序結(jié)果上傳至NCBI網(wǎng)站并進(jìn)行同源性比對(duì)分析，結(jié)果表明：P2菌株的特征基因序列與多種芽孢桿菌屬菌株具有98%以上的同源性，將P2所測(cè)序列結(jié)果提交到Gen Bank數(shù)據(jù)庫(kù)，獲得序列登錄號(hào)為PP178578；而W菌株的特征基因序列與多種埃希菌屬菌株具有98%以上的同源性，將W所測(cè)序列結(jié)果提交到Gen Bank數(shù)據(jù)庫(kù)，獲得序列登錄號(hào)為PP178579。兩菌株的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)如圖3所示。

2.2 菌株P(guān)2和W的生長(zhǎng)曲線

圖4顯示，接入菌株W、P2后，其OD₆₀₀值迅速降低，這是菌株剛接種到以土霉素為唯一碳源的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中，對(duì)新環(huán)境的一個(gè)適應(yīng)期，菌株生長(zhǎng)繁殖緩慢。8 h 后OD₆₀₀值有所上升，并且P2菌株在16 h達(dá)到最大生長(zhǎng)值0.025，W菌株在40 h達(dá)到最大生長(zhǎng)值0.055，說(shuō)明菌株在經(jīng)過(guò)生長(zhǎng)遲緩期后，迅速進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，且W菌株比P2菌株適應(yīng)性更好。W菌株在48 h后，P2菌株在16 h后的OD₆₀₀值均呈現(xiàn)一定的下降趨勢(shì)而后趨于穩(wěn)定，這可能與土霉素為唯一碳源，且降解產(chǎn)物對(duì)這兩株菌株生長(zhǎng)具有一定抑制作用有關(guān)。

2.3 菌株P(guān)2和W對(duì)土霉素的降解率

圖5顯示了菌株W、P2對(duì)土霉素的降解率隨著降解時(shí)間持續(xù)的變化過(guò)程。由圖5可知，隨著降解時(shí)間的延長(zhǎng)，W菌株對(duì)土霉素的降解率逐漸升高，這說(shuō)明W菌株在適應(yīng)了土霉素為唯一碳源的環(huán)境后，進(jìn)入生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期并且開(kāi)始大量降解土霉素，且隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，降解率提高。但是P2菌株隨著降解時(shí)間的延長(zhǎng)，對(duì)土霉素的降解率呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，并在第3天時(shí)達(dá)到最高，這一結(jié)果符合菌株自身對(duì)抗生素降解效果的動(dòng)態(tài)平衡，這是因?yàn)榫暝谏L(zhǎng)階段和衰退階段，隨著菌株總量的積累，對(duì)抗生素的降解率逐漸升高，之后由于菌量低于某一閾值以及土霉素降解產(chǎn)物對(duì)菌株進(jìn)行抑制，降解率開(kāi)始降低，直至趨于土霉素自然降解率。

2.4環(huán)境條件對(duì)菌株P(guān)2和W降解土霉素的影響

2.4.1混合比例

接種總量為3%體積分?jǐn)?shù)，兩株菌株的體積混合比例分別為W∶P2=1∶0、0∶1、1∶1、2∶1、1∶2，將菌液接種于含有50 mg·L^-1土霉素的中性無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中，在溫度為30 ℃，轉(zhuǎn)速為130 r·min-1的條件下培養(yǎng)3 d，結(jié)果見(jiàn)圖6。混合比例為1∶1時(shí)，菌株對(duì)土霉素的降解率最高，達(dá)到了13.85%，且菌株的OD₆₀₀值也最大，說(shuō)明在這個(gè)混合比例下，兩菌株的生長(zhǎng)最為旺盛，對(duì)土霉素的降解能力也最強(qiáng)，因此，選取兩株降解菌的接種比例為1∶1，接種總量為3% 體積分?jǐn)?shù)作為進(jìn)一步研究的條件。

2.4.2 初始濃度

將體積分?jǐn)?shù)為3%，兩株菌株混合比例為1∶1的菌液分別接種到土霉素濃度為35、50、65、80、95 mg·L^-1的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中。在溫度為30 ℃，pH為7，轉(zhuǎn)速為130 r·min^-1的條件下培養(yǎng)3 d，結(jié)果見(jiàn)圖7。降解率隨著土霉素初始濃度的升高呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，在65 mg·L^-1時(shí)降解率達(dá)到最高，為19.33%，而此時(shí)菌株的OD₆₀₀值也達(dá)到最高，這是由于低濃度時(shí)，土霉素作為唯一碳源不能滿(mǎn)足菌株生長(zhǎng)繁殖的需求，而高濃度時(shí)，土霉素又作為藥物抑制了菌株的生長(zhǎng)繁殖。

2.4.3 初始pH

在50 mg·L^-1土霉素，pH依次為5、6、7、8、9的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中，接種體積分?jǐn)?shù)為3%，兩株菌混合比例為1∶1的菌液，在溫度為30 ℃，轉(zhuǎn)速為130 r·min^-1的條件下培養(yǎng)3d，結(jié)果見(jiàn)圖8。降解率隨著pH的升高而降低，pH為5時(shí)降解率最高，為24.29%，pH為9時(shí)降解率最低，為4.27%。菌液OD₆₀₀值的變化趨勢(shì)與降解率變化趨勢(shì)一致，說(shuō)明在酸性條件下菌株的生長(zhǎng)狀況更好，對(duì)土霉素的降解率也更高，堿性條件抑制兩株菌對(duì)土霉素的降解。

2.4.4 接種量

將兩株菌混合比例為1∶1，接種量分別為1%、2%、3%、4%、5% 的菌液接種于含有50 mg·L^-1 土霉素的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中，調(diào)節(jié)pH 為7，在溫度為30 ℃，轉(zhuǎn)速為130 r·min^-1 的條件下培養(yǎng)3d，結(jié)果見(jiàn)圖9。隨著接種量的增加，菌液的OD₆₀₀ 值也在逐漸增加，在接種量為5% 時(shí)達(dá)到最大值0.079，而降解率先升高后降低，在接種量為3% 時(shí)達(dá)到最大值20.66%，這可能是因?yàn)榕囵B(yǎng)液中的菌體之間會(huì)因?yàn)闋?zhēng)奪營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)而產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系，從而影響其對(duì)土霉素的降解。

2.4.5 溫度

大部分的文獻(xiàn)資料顯示，菌種的最佳生長(zhǎng)溫度在30～35 ℃之間，因此本試驗(yàn)在最適溫度界限上下設(shè)置溫度梯度，分別為25、30、35、40 ℃，接種體積為3%，混合比例為1∶1的菌液于含有50 mg·L^-1土霉素的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中，在pH為7，轉(zhuǎn)速為130 r·min^-1的條件下培養(yǎng)3 d，結(jié)果見(jiàn)圖10。隨著溫度升高，降解率和OD₆₀₀值均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，并且在35 ℃時(shí)分別達(dá)到最大值10.65%和0.054，造成這種現(xiàn)象的原因可能是菌株分泌的土霉素降解酶的最適溫度為35 ℃，溫度過(guò)高或過(guò)低對(duì)降解效果均有一定的影響，同時(shí)，由于降解效率的降低，菌株在該環(huán)境中生存受限，最終反映在菌株OD600值的降低。

2.4.6 外加碳源

在分別含有2g乙酸鈉、淀粉、麥芽糖、葡萄糖、蔗糖的50 mg·L^-1土霉素?zé)o機(jī)鹽培養(yǎng)基中接種體積分?jǐn)?shù)為3%，兩株菌混合比例為1∶1 的菌液，在溫度為30 ℃，pH為7，轉(zhuǎn)速為130 r·min^-1的條件下培養(yǎng)3 d，結(jié)果如圖11所示。CK處理下，聯(lián)合菌株對(duì)土霉素的降解率僅為12.02%，外加碳源后，降解率大幅度增加，說(shuō)明外加碳源對(duì)降解率的影響較大。降解菌不僅可以利用土霉素作為唯一碳源進(jìn)行分解代謝，外加麥芽糖作為共代謝碳源時(shí)，菌株?duì)I養(yǎng)物質(zhì)更充足，生長(zhǎng)更快，土霉素的降解率也提高到86.66%，所以麥芽糖是最優(yōu)外源碳源。

2.4.7外加氮源

在分別含有2 g明膠、尿素、胰蛋白胨、硫酸銨、硝酸鈉的50 mg·L^-1土霉素?zé)o機(jī)鹽培養(yǎng)基中接種體積分?jǐn)?shù)為3%，兩株菌混合比例為1∶1 的菌液，在溫度為30 ℃，pH為7，轉(zhuǎn)速為130 r·min^-1的條件下培養(yǎng)3 d，結(jié)果如圖12所示。與CK相比，外加氮源后降解率均有一定程度的增加，說(shuō)明外加氮源對(duì)降解率的影響較大，其中外加硝酸鈉時(shí)，降解率最高，達(dá)到85.15%，為最優(yōu)氮源，而外加尿素時(shí)，降解率僅為25.73%，可能是降解菌對(duì)尿素的利用程度不高，不能大幅提升降解效果。

2.5 土霉素降解產(chǎn)物及潛在的降解途徑

為了更好地了解菌株W和P2對(duì)土霉素降解的中間產(chǎn)物和潛在的降解途徑，使用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法分別檢測(cè)土霉素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、空白樣品和單加P2、單加W、W 與P2 聯(lián)合降解樣品，得到質(zhì)譜結(jié)果如圖13至圖17所示。

首先根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品和空白樣品排除色譜柱內(nèi)殘留的雜質(zhì)峰和確定土霉素的物質(zhì)峰，然后根據(jù)單加P2、單加W推測(cè)單株菌降解土霉素的途徑，與W和P2聯(lián)合降解樣品進(jìn)行對(duì)比，推測(cè)聯(lián)合降解潛在的共同降解途徑?？赡艿慕到猱a(chǎn)物的推測(cè)依據(jù)質(zhì)譜圖中豐度較高的質(zhì)荷比、物質(zhì)庫(kù)對(duì)照以及已發(fā)表文獻(xiàn)，根據(jù)已有研究中土霉素主要的降解路徑以及合理的質(zhì)量丟失，提出4種潛在的土霉素降解途徑，結(jié)果如圖18所示。

途徑Ⅰ：在W菌株作用下，母體化合物土霉素先經(jīng)過(guò)C5位置的氧化脫氫和C4位置的二甲氨基脫甲基，形成化合物m/z=432，再在C2 位置脫酰胺基，C6位置脫水、脫甲基，C12a位置脫羥基后轉(zhuǎn)化為化合物m/z=340，然后在C5位置脫羰基，在C4a和C12a位置的苯環(huán)裂解，形成化合物m/z=211，最后在C1位置脫羥基，生成產(chǎn)物4-氫-蒽-9-酮（m/z=194）。

途徑Ⅱ：在W菌株作用下，土霉素先在C2位置脫酰胺基，C4位置的二甲氨基脫甲基形成化合物m/z=397，再經(jīng)過(guò)C6位置脫水、C5和C12位置的苯環(huán)裂解，形成化合物m/z=218，C2位置再脫羧基，C4位置脫甲基，C8位置脫羥基形成產(chǎn)物4-氫-萘-1-酮（m/z=141）。

途徑Ⅲ：在P2菌株作用下，土霉素先經(jīng)過(guò)C5位置的氧化脫氫轉(zhuǎn)化為化合物m/z=459，再經(jīng)過(guò)C4位置二甲氨基的脫甲基化，C5a和C11a位置的苯環(huán)裂解，分解形成化合物m/z=191和m/z=291，化合物m/z=191再經(jīng)過(guò)C5位置脫甲基、脫羥基形成1-羥基-5H-萘-8-酮（m/z=167），m/z=291 再進(jìn)行C4 位置的脫胺基、C3、C8a位置脫羥基和C2位置脫酰胺基形成化合物m/z=141，進(jìn)一步分解為小分子1，3-環(huán)己二酮（m/z=123）。

途徑Ⅳ：在W和P2菌株共同作用下，土霉素先經(jīng)過(guò)C1位置的脫羰基，C2位置的脫酰胺基，C3、C12a位置的脫羥基轉(zhuǎn)化為化合物m /z=377，再經(jīng)過(guò)C2 和C12a位置苯環(huán)的裂解，C4位置二甲氨基的脫甲基形成化合物m/z=321，然后C1位置脫羥基，C3位置脫氨基，C10 位置脫水形成化合物m/z=262，最后經(jīng)過(guò)C4和C9a位置苯環(huán)的斷裂，生成產(chǎn)物1-羥基-5-甲基-7-氫-萘-8-酮（m/z=175）。

3 討論

環(huán)境中抗生素的殘留對(duì)人類(lèi)健康和生態(tài)系統(tǒng)具有極大的威脅，因此研究抗生素降解技術(shù)備受社會(huì)關(guān)注。而微生物可以以抗生素為唯一碳源和能源，通過(guò)微生物分泌胞外酶進(jìn)行氧化、還原、基團(tuán)轉(zhuǎn)運(yùn)、水解等，參與細(xì)胞代謝，最終生成CO₂和H₂O等[24-25]，具有投資少、沒(méi)有二次污染物、環(huán)境擾動(dòng)小等優(yōu)點(diǎn)，因而成為國(guó)內(nèi)外研究熱點(diǎn)。

從環(huán)境中篩選出可以降解四環(huán)素類(lèi)抗生素菌株的報(bào)道不斷出現(xiàn)，如光合菌、乳酸菌、放線菌、酵母菌、發(fā)酵絲狀菌、芽孢桿菌、枯草桿菌、硝化細(xì)菌、酵母等都具有降解抗生素的功能[9]。張小紅等[26]發(fā)現(xiàn)一株可同時(shí)降解土霉素、四環(huán)素、金霉素及強(qiáng)力霉素的降解菌TCs-2，初步鑒定其為潘多拉菌屬（Pandoraea sp.）。成潔等[27]發(fā)現(xiàn)木糖氧化無(wú)色桿菌（Achromobacter sp.）TJ-2#、枯草芽孢桿菌（Bacillus sp.）TJ-6#對(duì)土霉素的降解率分別為58.3%、49.6%。張長(zhǎng)青[28]發(fā)現(xiàn)蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）在第8 天時(shí)對(duì)50 mg·L^-1 土霉素的降解率達(dá)到82.38%。也有研究表明，由于環(huán)境中污染物組成成分復(fù)雜，依靠單一降解菌很難達(dá)到理想效果，而由不同降解菌組合成的降解菌群相對(duì)于單菌而言，其降解性能更加優(yōu)異[29]。研究表明，有效微生物生物量與污染物降解率呈正相關(guān)關(guān)系，投加的降解菌生物量越多降解率越高[30]。本研究篩選出兩株有降解土霉素能力的降解菌W和P2，其分別屬于埃希菌屬和芽孢桿菌屬，對(duì)其進(jìn)行最佳配比，使兩株菌對(duì)土霉素進(jìn)行1∶1聯(lián)合降解，以提高土霉素的降解效果。曾洪等[31]發(fā)現(xiàn)當(dāng)土霉素降解菌OTC-1培養(yǎng)時(shí)間超過(guò)6 d時(shí)，菌株的生長(zhǎng)量開(kāi)始下降，這可能是因?yàn)橥撩顾乇痪煤螽a(chǎn)生具有抑菌性的中間代謝產(chǎn)物，從而降低了微生物活性，該結(jié)果與本研究結(jié)果相似。

邵思城[32] 發(fā)現(xiàn)蒼白桿菌屬（Ochrobactrum sp.）KSS10對(duì)土霉素的最優(yōu)降解條件為：土霉素初始濃度56.31 mg·L^-1、溫度32.48 ℃、溶液初始pH 5.45和接種量16.07%（V/V）。這與本試驗(yàn)篩選出的最佳降解條件為土霉素初始濃度65 mg·L^-1、接種量3%、pH 5、溫度35 ℃基本一致。于浩等[33]發(fā)現(xiàn)了土霉素優(yōu)勢(shì)降解菌株短波單胞菌屬（Brevundimonas sp.）YH1，添加不同的碳源、氮源均有利于該菌株對(duì)土霉素的降解，其中加入蔗糖和麥芽糖可以明顯提高降解率，添加麥芽糖后降解率提高至71.89%，添加酵母浸液后降解率提高至64.91%。本試驗(yàn)中，最優(yōu)碳源為麥芽糖，土霉素降解率提高到86.66%，最優(yōu)氮源為硝酸鈉，土霉素降解率提高至85.15%。

土霉素的降解路徑主要為母體結(jié)構(gòu)中苯環(huán)的裂解、取代基的降解以及OH、NH₂、CH₃、CONH₂等基團(tuán)的去除[34-37]。本研究發(fā)現(xiàn)4 種潛在的土霉素降解途徑，降解過(guò)程主要包括羥基化、苯環(huán)裂解、脫氫、脫水、脫甲基、脫羥基、脫胺基和脫酰胺基反應(yīng)。石建惠等[38]發(fā)現(xiàn)光芬頓體系降解土霉素的中間產(chǎn)物，其中OTC10 與本研究獲得的降解產(chǎn)物之一m/z=175 較為一致。周婷[39]發(fā)現(xiàn)光催化氧化土霉素的產(chǎn)物m/z=432、m/z=191 的結(jié)構(gòu)均與本研究獲得的降解產(chǎn)物m/z=432、m/z=191 較為一致。陳棟[40]發(fā)現(xiàn)電化學(xué)氧化土霉素的降解產(chǎn)物之一m/z=432致突變性高于土霉素本身，與本研究推測(cè)產(chǎn)物m/z=432的結(jié)構(gòu)不相似。

抗生素的微生物降解研究目前仍處于起步階段，微生物技術(shù)固有的限制特點(diǎn)使得該項(xiàng)技術(shù)現(xiàn)在仍普遍處于實(shí)驗(yàn)室研究階段，且多數(shù)研究?jī)H考慮單一微生物和抗生素的降解，代謝機(jī)制的研究以及實(shí)際應(yīng)用的開(kāi)展等還需要大量的工作。要將微生物修復(fù)技術(shù)進(jìn)行大規(guī)模工程應(yīng)用，還需要加快尋找廉價(jià)、有效的促進(jìn)降解菌生長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)鹽和微生物載體，加強(qiáng)對(duì)微生物作用過(guò)程中間代謝產(chǎn)物及酶的研究，運(yùn)用現(xiàn)代生物工程技術(shù)構(gòu)建高效基因工程菌，以及針對(duì)性地采用多種修復(fù)技術(shù)相結(jié)合的聯(lián)合修復(fù)方案。本研究篩選得到的P2和W 菌株對(duì)土霉素有較好的降解作用，具有潛在的實(shí)際使用價(jià)值，為雙菌共同降解土霉素提供了參考。

4 結(jié)論

（1）從實(shí)驗(yàn)室保存的蘇州某廢棄農(nóng)藥廠土壤和地下水樣品中純化分離的菌株中，篩選分離出兩株土霉素降解菌株W和P2，根據(jù)兩菌株的形態(tài)、生理生化特征及16S rDNA鑒定，P2屬于芽孢桿菌屬，W屬于埃希菌屬。

（2）不同環(huán)境條件下，兩菌株對(duì)土霉素的降解效果不同。在土霉素初始濃度為65 mg·L^-1，混合比例為1∶1，接種量為3%，pH為5，溫度為35 ℃，外加碳源為麥芽糖，外加氮源為硝酸鈉時(shí)，W和P2對(duì)土霉素的降解效果最佳。其中外加碳、氮源對(duì)降解菌降解土霉素的影響最大。

（3）發(fā)現(xiàn)4種潛在的土霉素降解途徑，降解過(guò)程主要有苯環(huán)裂解、脫氫、脫水、脫羰基、脫甲基、脫羥基、脫胺基和脫酰胺基反應(yīng)，中間降解產(chǎn)物分別為4-氫-蒽-9-酮（m/z=194）、4-氫-萘-1-酮（m/z=141）、1-羥基-5H-萘-8-酮（m/z=167）、1，3-環(huán)己二酮（m/z=123）、1-羥基-5-甲基-7-氫-萘-8-酮（m/z=175）。