駱許靜 孫 楨 馬耀先 方曉瑞

作者單位：461000 河南省許昌市中心醫(yī)院

肺腺癌(lung adenocarcinoma,LUAD)是高發(fā)性的侵襲性非小細(xì)胞肺癌,發(fā)病率占全部肺癌的40%[1]。近年來(lái),肺腺癌治療主要以手術(shù)、放化療、分子靶向治療及免疫治療等綜合方案為主,極大程度的提高LUAD患者預(yù)后,但因患者個(gè)體差異與耐藥性等因素影響,治療效果仍被限制[2]。所以,迫切尋找肺腺癌的致病機(jī)制與高效、精準(zhǔn)的診治手段具有重要意義。臨床大量證據(jù)發(fā)現(xiàn)腫瘤微環(huán)境(tumor immune microenvironment,TME)參與腫瘤疾病的發(fā)生及發(fā)展,TME為大量基質(zhì)細(xì)胞維持,如腫瘤干細(xì)胞、癌內(nèi)皮細(xì)胞、癌相關(guān)成纖維細(xì)胞及浸潤(rùn)免疫細(xì)胞[3-4]。癌細(xì)胞與其支持細(xì)胞間共同作用介導(dǎo)腫瘤發(fā)生增殖、抗凋亡、免疫逃逸等。大量研究報(bào)道,TME標(biāo)志物可評(píng)估黑色素瘤、尿路上皮癌患者的預(yù)后,免疫相關(guān)標(biāo)志物水平與免疫治療密切相關(guān)[5-6]。進(jìn)一步研究表明,免疫微環(huán)境中基因特征表達(dá),可能是預(yù)測(cè)免疫抑制劑治療效果的潛在生物標(biāo)記物。

乳腺癌易感基因(breast cancer susceptibility gene 1,BRCA1)可介導(dǎo)DNA增強(qiáng)細(xì)胞修復(fù)DNA侵損能力,與癌癥發(fā)展相關(guān)[7]。臨床已發(fā)現(xiàn)BRCA1基因是預(yù)測(cè)乳腺癌療效、預(yù)后的重要因子[8]。目前BRCA1在LUAD中作用研究較少,關(guān)于其免疫治療效果及預(yù)后預(yù)測(cè)價(jià)值不明。本研究通過(guò)公共數(shù)據(jù)庫(kù),分析BRCA1基因表達(dá)與LUAD免疫細(xì)胞浸潤(rùn)和預(yù)后的關(guān)系,研究其在肺腺癌免疫微環(huán)境中可能的作用,深入探討B(tài)RCA1基因在肺腺癌發(fā)生、發(fā)展及治療中的作用機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源

收集2019年1月至2022年1月間68例手術(shù)切除新鮮肺腺癌組織與癌旁肺組織(>癌組織邊緣10 cm)標(biāo)本,患者均為首次就診,術(shù)前未采取任何抗腫瘤治療,術(shù)后病理證實(shí)為肺腺癌。其中男性41例,女性27例,年齡29～78歲,平均年齡(67.49±9.23)歲;TNM分期:Ⅰ～Ⅱ期58例,Ⅲ～Ⅳ期10例;淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移27例。本次研究提交我院倫理委員會(huì)并審核通過(guò),并取得患者或家屬簽字知情同意書。

1.2 qRT-PCR檢測(cè)BRCA1mRNA水平

新鮮標(biāo)本存放于RNA穩(wěn)定性RNA later保存液(上海鈺博生物科技有限公司)中2 ℃保存待用,RNA提取:采用Trizol試劑(賽默飛世爾科技中國(guó)有限公司)盒提取組織中總RNA并提純,參照熒光定量PCR試劑盒(賽默飛世爾科技中國(guó)有限公司)說(shuō)明配置20 μlPCR反應(yīng)體系,BRCA1引物序列:上游5' AUGGCCUC--CGUCU-C-CCAGCUUGC 3,下游3' UUCCA-AGUUGUAAAAUGUGGUCGA-CG 5';反應(yīng)條件:95 ℃ 5 min;95 ℃ 30 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 1 min,40個(gè)循環(huán),采用2-△△Ct方法與GAPDH水平為基線對(duì)結(jié)果矯正處理BRCA1mRNA相對(duì)表達(dá)量。

1.3 免疫組化

取癌組織和癌旁組織標(biāo)本后給予生理鹽水沖洗,沖洗后將標(biāo)本樣品保存于凍存管中,采用油性筆記號(hào)并編號(hào),保存于-196 ℃液氮罐中。為確保組織中RNA酶有效性不被破壞,在樣本離體后10 min內(nèi)完成檢驗(yàn),采用4%多聚甲醛溶液(賽默飛世爾科技中國(guó)有限公司)固定樣本,采用石蠟包埋后切厚度為4 μm的切片,應(yīng)用全自動(dòng)免疫組化染色儀(型號(hào):AttoStar?-4800A,艾托金生物醫(yī)藥(蘇州)有限公司),染色程度參照BRCA1試劑盒(上海酶聯(lián)生物科技)說(shuō)明書進(jìn)行。結(jié)果判定:BRCA1陽(yáng)性著色為細(xì)胞核呈棕黃色。

1.4 公共數(shù)據(jù)庫(kù)分析

1.4.1 Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)分析BRCA1基因在肺腺癌組織中的表達(dá) 采用Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.oncomine.org/resource/login.html)分析BRCA1基因在泛癌中的表達(dá)水平。設(shè)置條件為:“Gene:BRCA1”“Analysis Type:Cancer vs.Normal”“THRESHOLD BY:P-VALUE<0.01,FOLD CHAGE>2,GENE RNAK=Top 10%,Date type:All”。

1.4.2 Kaplan-meier Plotter數(shù)據(jù)庫(kù)分析 Kaplan-meier Plotter數(shù)據(jù)庫(kù)在GEO、EGA與TCGA等公共數(shù)據(jù)庫(kù)基因芯片及RNA-seq數(shù)據(jù)基礎(chǔ)上建立,可對(duì)特定基因臨床預(yù)后價(jià)值進(jìn)行評(píng)估,根據(jù)患者樣本參照基因中位表達(dá)(高表達(dá)與低表達(dá))分為兩組,采用Kaplan-Meier生存曲線分析肺腺癌患者的總體生存率。

1.4.3 TIMER數(shù)據(jù)庫(kù)分析 TIMER數(shù)據(jù)庫(kù)(http://timer.cistrome.org/)作為系統(tǒng)分析不同癌癥類型的免疫浸潤(rùn)綜合數(shù)據(jù)庫(kù),可通過(guò)TCGA(The cancer genome atlas)數(shù)據(jù)庫(kù)腫瘤中采用Diff Exp模塊辨別腫瘤與鄰近正常組織之間靶基因的差異表達(dá),本研究中,采用TIMER數(shù)據(jù)庫(kù)分析BRCA1在肺腺癌中的表達(dá)。通過(guò)反卷積方法從基因表達(dá)譜中分析肺腺癌浸潤(rùn)免疫的豐富度,采用Immune Association模塊中Gene分析BRCA1基因表達(dá)與免疫細(xì)胞浸潤(rùn)豐度的關(guān)系。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用R軟件包(4.1.3版本)完成統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,癌組織及癌旁組織中BRCA1 mRNA表達(dá)水平呈正態(tài)分布,組間采用t檢驗(yàn);Kaplan-Meier生存曲線評(píng)估BRCA1基因?qū)Ψ蜗侔╊A(yù)后的影響;Spermans相關(guān)性檢驗(yàn) BRCA1基因與免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的相關(guān)性,以α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 肺腺癌BRCA1基因差異表達(dá)

采用Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)比較不同惡性腫瘤及配對(duì)癌旁組織中BRCA1基因水平,見圖1;分析顯示肺腺癌(LUAD)中BRCA1基因水平高于癌旁組織(P<0.05),見圖2;qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示肺腺癌組織中BRCA1 mRNA表達(dá)水平高于癌旁組織,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見圖3,與Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)結(jié)果一致。

圖1 Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)分析各種類型惡性腫瘤組織與癌旁組織中BRCA1基因表達(dá)

LUAD為肺腺癌組織;Normal為癌旁組織。

圖3 qRT-PCR檢測(cè)BRCA1 mRNA表達(dá)水平

2.2 肺腺癌BRCA1免疫組化

免疫組化學(xué)染色法檢測(cè)BRCA1表達(dá),癌旁組織見清晰的細(xì)胞結(jié)構(gòu),大小均勻,排列規(guī)則,見低度BRCA1淺棕黃色表達(dá)、癌組織腺癌細(xì)胞大小不一,呈混亂排列,且結(jié)構(gòu)異常,BRCA1在細(xì)胞核中呈棕黃色。

2.3 BRCA1基因表達(dá)與肺腺癌免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的相關(guān)性

TIMER數(shù)據(jù)庫(kù)分析,BRCA1表達(dá)與中心粒細(xì)胞(γ=0.147,P=1.28×10-3)浸潤(rùn)水平具有強(qiáng)相關(guān)性,但與B細(xì)胞(γ=-0.09,P=4.73×10-2)、CD8+T細(xì)胞(γ=0.047,P=3.00×10-1)、CD4+T細(xì)胞(γ=0.039,P=3.91×10-1)、巨噬細(xì)胞(γ=-0.038,P=4.05×10-1)及樹突狀細(xì)胞(γ=0.039,P=3.85×10-1)無(wú)相關(guān)性,見圖4。

圖4 BRCA1基因表達(dá)與肺腺癌免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的相關(guān)性

2.4 BRCA1基因表達(dá)與肺腺癌預(yù)后的關(guān)系

Kaplan-meier Plotter數(shù)據(jù)庫(kù)分析,BRCA1基因高表達(dá)肺腺癌患者總生存期短于低表達(dá)者,無(wú)病生存率低于低表達(dá)肺腺癌患者,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見圖5。

圖5 BRCA1基因表達(dá)與肺腺癌預(yù)后的關(guān)系

3 討論

近年來(lái)BRCA1在臨床腫瘤中的表達(dá)及功能逐漸報(bào)道,其中在乳腺癌研究較多。多項(xiàng)研究表明,BRCA1是乳腺癌的潛在生物標(biāo)志物及免疫治療靶點(diǎn);BRCA1在乳腺癌組織中呈下調(diào)表達(dá),BRCA1基因表達(dá)與臨床病理、復(fù)發(fā)機(jī)預(yù)后密切相關(guān)[9-10]。同時(shí),BRCA1可對(duì)乳腺癌細(xì)胞周期調(diào)控、基因轉(zhuǎn)錄及DNA的損傷修復(fù)[11]。但有關(guān)BRCA1基因表達(dá)與LUAD患者的潛在作用及預(yù)后關(guān)系鮮少有報(bào)道?；诖吮疚耐ㄟ^(guò)分析BRCA1基因?qū)UAD預(yù)后及免疫微環(huán)境的關(guān)系,進(jìn)一步為L(zhǎng)UAD預(yù)后評(píng)估及免疫治療提供新策略。

我們對(duì)公共信息庫(kù)數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn),BRCA1基因在LUAD組織中表達(dá)均高于正常組織;本研究qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果分析肺腺癌組織中BRCA1 mRNA表達(dá)水平高于癌旁組織;生存分析結(jié)果顯示,BRCA1基因高表達(dá)肺腺癌患者總生存期、無(wú)病生存率短于低表達(dá)肺腺癌患者,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。以上結(jié)果表明,BRCA1可影響LUAD發(fā)展,且可能為L(zhǎng)UAD預(yù)后的生物標(biāo)志物。

免疫浸潤(rùn)與腫瘤微環(huán)境對(duì)不同腫瘤發(fā)生發(fā)展發(fā)揮關(guān)鍵作用,腫瘤分子特征與免疫微環(huán)境間發(fā)揮協(xié)同作用而影響不同臨床結(jié)果[12-13]。本研究發(fā)現(xiàn),TIMER數(shù)據(jù)庫(kù)分析,BRCA1表達(dá)與中心粒細(xì)胞(γ=0.147,P=1.28×10-3)浸潤(rùn)水平具有強(qiáng)相關(guān)性,但與B細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、及樹突狀細(xì)胞無(wú)相關(guān)性。中性粒細(xì)胞是機(jī)體外周血中豐富的白細(xì)胞,可介導(dǎo)吞噬作用、脫顆粒、大量分泌活性氧等預(yù)防病原體侵襲;同時(shí)中性粒細(xì)胞可形成特殊的細(xì)胞死亡程序中性粒細(xì)胞外誘補(bǔ)網(wǎng)(neutrophil extracellular traps,NETs),介導(dǎo)機(jī)體不同病理生理發(fā)展[14-15]。臨床報(bào)道,NETs在肺癌、胃癌等患者中呈上調(diào)表達(dá),隨腫瘤微環(huán)境改變NETs可直接作用[16-17]。臨床還發(fā)現(xiàn),NETs大量存在于乳腺癌、結(jié)直腸癌患者發(fā)生肝轉(zhuǎn)移病灶中,提升腫瘤細(xì)胞活性,使腫瘤短期中出現(xiàn)轉(zhuǎn)移[18]。在腫瘤微環(huán)境中,相關(guān)免疫抑性細(xì)胞如巨噬細(xì)胞、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞等可輔助腫瘤發(fā)生免疫逃逸,如惡性腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生的趨化因子可加快中性粒細(xì)胞形成NRTs,阻斷免疫細(xì)胞與鄰近靶向細(xì)胞的結(jié)合,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞受CD8+T細(xì)胞及自然殺死細(xì)胞調(diào)控的細(xì)胞毒性作用[19-20]。所以NETs可能作用腫瘤微環(huán)境輔助腫瘤細(xì)胞免疫逃逸,加快腫瘤發(fā)生進(jìn)展。所以,本次研究結(jié)合數(shù)據(jù)庫(kù)分析結(jié)果與既往研究表明,BRCA1基因可能調(diào)控中性粒細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞間的協(xié)同作用加快LUAD進(jìn)展。

綜上所述,本研究結(jié)果初步表明BRCA1基因在肺腺癌組織中呈上調(diào)水平,下調(diào)BRCA1表達(dá)水平有望改善肺腺癌患者預(yù)后,BRCA1表達(dá)水平與肺腺癌中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)密切相關(guān),表明其在肺腺癌發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵生物學(xué)作用,且為肺腺癌治療提供新的免疫靶點(diǎn)。但本研究結(jié)果是基于生物學(xué)信息庫(kù)分析上,BRCA1與腫瘤微環(huán)境中的免疫浸潤(rùn)及調(diào)節(jié)仍待進(jìn)一步驗(yàn)證,有待更詳細(xì)且具體的體內(nèi)外研究。