萬(wàn)云杰 夏甘樹(shù) 王子銘 張志忠

作者單位：455000 河南省安陽(yáng)市腫瘤醫(yī)院

胃癌是臨床常見(jiàn)消化道腫瘤,具有較高的病死率。且近年來(lái)在我國(guó)發(fā)病率不斷上升,已成為威脅我國(guó)居民生命安全的重要因素[1]。胃癌中期即Ⅱ～Ⅲ期,是治療胃癌的重要階段,胃癌根治術(shù)則是治療胃癌的主要方式。該階段采用胃癌根治術(shù)雖具有可觀的治療效果,幫助延長(zhǎng)生存時(shí)間,而部分患者受病程、分化程度等因素影響,仍伴有胃癌復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)[2]。但是由于尚無(wú)有效指標(biāo)可預(yù)測(cè)胃癌根治術(shù)后患者是否復(fù)發(fā),導(dǎo)致難以提前制定治療計(jì)劃,控制病情發(fā)展。因此,尋找可用于預(yù)測(cè)胃癌根治術(shù)后是否復(fù)發(fā)的相關(guān)指標(biāo)已成為臨床熱點(diǎn)話題。得益于近年來(lái)免疫組織化學(xué)等領(lǐng)域的發(fā)展,多種蛋白物質(zhì)的出現(xiàn)并在腫瘤領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用為臨床提供新的思路,其中基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制劑(TIMP-1)在腫瘤診斷及評(píng)估等方面獲得廣泛運(yùn)用,而亮氨酸拉鏈EFhand結(jié)構(gòu)域跨膜蛋白1(LETM1)亦成為評(píng)估預(yù)后等方面的重要參考方面,但是關(guān)于兩種物質(zhì)聯(lián)合檢測(cè)能否用于預(yù)測(cè)中期胃癌根治術(shù)后復(fù)發(fā)狀況尚不可知,且相關(guān)報(bào)道亦較為有限,基于此,本次嘗試探究中期胃癌根治術(shù)后復(fù)發(fā)狀況與LETM1、TIMP-1聯(lián)合檢測(cè)的聯(lián)系,希望為臨床提供經(jīng)驗(yàn)及參考,現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 一般資料

回顧性分析2016年11月至2019年5月于我院進(jìn)行胃癌根治術(shù)的Ⅱ～Ⅲ期胃癌患者102例。男性68例,女性34例;年齡43～64歲,平均年齡(54.84±3.17)歲;高分化59例,中分化31例;低分化12例;彌漫型胃癌48例,腸型39例,混合型胃癌15例;Ⅱ期61例,Ⅲ期41例。

納入標(biāo)準(zhǔn):①經(jīng)相關(guān)檢查后,符合《中國(guó)早期胃癌篩查及內(nèi)鏡診治共識(shí)意見(jiàn)(2014年,長(zhǎng)沙)》[3]中胃癌相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)者;②TNM分期[4]Ⅱ～Ⅲ期者;③首次確診者;④計(jì)劃行胃癌根治術(shù)者;⑤預(yù)計(jì)治療方案相似者;⑥臨床資料齊全者。

排除標(biāo)準(zhǔn):①伴有器官功能障礙或衰竭者;②伴有凝血、免疫系統(tǒng)疾病者;③伴有其他部位惡性腫瘤者;④術(shù)前行其他治療者;⑤伴有其他消化系統(tǒng)疾病者。

1.2 方法

①亮氨酸拉鏈EFhand結(jié)構(gòu)域跨膜蛋白1(LETM1)檢測(cè):于患者胃癌根治術(shù)前,取病灶及癌旁正常組織,固定后使用石蠟進(jìn)行包埋;制成3～6 μm切片后,進(jìn)行水化、沖洗等操作,5～10 min/次,2～3次/片,隨后在緩沖液中提高溫度至100 ℃,維持8～10 min,后待切片冷卻行沖洗、孵育等操作,并加入LETM1抗體稀釋液100 μL,隨后在3 ℃～5 ℃環(huán)境下存放8～10 h,再加入聚合物輔助劑,再次孵育,磷酸緩沖液沖洗3次,并進(jìn)行顯色、復(fù)染、沖洗等操作后進(jìn)行封片,隨后進(jìn)行觀察。②基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制劑(TIMP-1)檢測(cè):于術(shù)前取標(biāo)本,固定后行包埋,制成3～6 μm切片,并ABC免疫組化染色法進(jìn)行染色,使用上海羽哚生物科技有限公司生產(chǎn)免疫組化試劑盒觀察TIMP-1狀況。兩組檢測(cè)結(jié)果均由3名5年以上經(jīng)驗(yàn)的相關(guān)醫(yī)師進(jìn)行評(píng)估及預(yù)測(cè)。

1.3 評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)

LETM1評(píng)估標(biāo)準(zhǔn):依據(jù)觀察細(xì)胞著色強(qiáng)度及陽(yáng)性占比對(duì)LETM1進(jìn)行分級(jí),若無(wú)明顯陽(yáng)性細(xì)胞或染色程度均好,可記作陰性-,觀察陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)<25%,或存在棕黃色顆粒,則記作+,若觀察內(nèi)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量≥25%且<50%,顆粒為黃色或棕黃色,則記作++;若觀察內(nèi)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量≥50%,且均有深棕色則記作+++。若患者觀察為-或+,則可記作LETM1低表達(dá),若患者觀察為++或+++,則記作LETM1高表達(dá)。

TIMP-1狀況評(píng)估:觀察切片內(nèi)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量及染色狀況,依據(jù)乳腺癌陽(yáng)性切片作為陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn),以濃度為0.05 μmol/L的 磷酸鹽緩沖溶液進(jìn)行染色作為陰性參考標(biāo)準(zhǔn)。若切片中細(xì)胞陽(yáng)性率≥20%,則記作陽(yáng)性,若切片中陽(yáng)性細(xì)胞率<20則記作陰性病例。

復(fù)發(fā)評(píng)估標(biāo)準(zhǔn):若術(shù)前檢查L(zhǎng)ETM1高表達(dá)或TIMP-1陽(yáng)性,則可記作可能復(fù)發(fā)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 LETM1預(yù)測(cè)結(jié)果比較

經(jīng)統(tǒng)計(jì),術(shù)后2年內(nèi)胃癌復(fù)發(fā)57例(55.88%),未復(fù)發(fā)45例(44.12%)。其中LETM1陽(yáng)性65例患者中,共有48例(73.85%)復(fù)發(fā),17例(26.15%)未復(fù)發(fā);LETM1陰性37例患者中共有9例(24.32%)復(fù)發(fā),28例未復(fù)發(fā)(75.68%);TIMP-1陽(yáng)性共63例,46例(73.02%)復(fù)發(fā),17例未復(fù)發(fā)(26.98%);TIMP-1陰性共有39例,其中11例(28.21%)復(fù)發(fā),28例未復(fù)發(fā)(71.79%),見(jiàn)表1。

表1 LETM1預(yù)測(cè)結(jié)果比較(例,%)

2.2 聯(lián)合檢測(cè)預(yù)測(cè)效能比較

聯(lián)合檢測(cè)預(yù)測(cè)3年內(nèi)復(fù)發(fā)71例(69.61%),無(wú)復(fù)發(fā)31例(30.39%),見(jiàn)表2、表3、圖1。

圖1 LETM1、TIMP-1預(yù)測(cè)胃癌根治術(shù)后復(fù)發(fā)狀況ROC曲線

表2 聯(lián)合檢測(cè)預(yù)測(cè)效能比較/例

表3 LETM1、TIMP-1聯(lián)合檢測(cè)預(yù)測(cè)效能分析

2.3 不同生存時(shí)間患者相關(guān)表達(dá)比較

術(shù)后3年內(nèi),共有53例死亡,剩余生存49例。LETM1高表達(dá)共54例,其中43例(79.63%)生存時(shí)間<3年,11例(20.37%)生存時(shí)間≥3年;LETM1低表達(dá)共48例,其中10例(20.83%)生存時(shí)間<3年,38例(79.17%)生存時(shí)間≥3年;TIMP-1陽(yáng)性共有62例,其中46例(74.19%)生存時(shí)間<3年,16例(25.81%)生存時(shí)間≥3年;TIMP-1陰性共有40例,其中共有7例(17.50%)生存時(shí)間<3年,33例(82.50%)生存時(shí)間≥3年。

3 討論

胃癌是臨床常見(jiàn)惡性腫瘤,由于臨床對(duì)于發(fā)病機(jī)制尚未完全明晰,臨床多以胃癌根治術(shù)進(jìn)行治療,但是受患者病程、免疫能力、基礎(chǔ)疾病等因素影響,具有較高的復(fù)發(fā)率。但是對(duì)于胃癌根治術(shù)后是否復(fù)發(fā)臨床暫無(wú)有效方式進(jìn)行預(yù)測(cè)。因此尋找相關(guān)指標(biāo)對(duì)胃癌根治術(shù)后復(fù)發(fā)狀況進(jìn)行預(yù)測(cè)并提前予以治療已成為臨床重點(diǎn)研究方向,伴隨近年來(lái)免疫組織化學(xué)的快速發(fā)展,LETM1、TIMP-1的出現(xiàn)及在多種癌癥中的廣泛應(yīng)用為臨床醫(yī)護(hù)人員提供新的思路。

本次研究就兩組患者聯(lián)合預(yù)測(cè)準(zhǔn)確率展開(kāi)統(tǒng)計(jì),發(fā)現(xiàn)聯(lián)合檢測(cè)并預(yù)測(cè)復(fù)發(fā)率具有較高準(zhǔn)確性,推測(cè)與LETM1、TIMP-1的性質(zhì)有關(guān)。LETM1蛋白屬于EF臂鈣離子結(jié)合蛋白,在機(jī)體內(nèi)具有多種表達(dá)方式,亦是影響線粒體正常功能、維持線粒體形態(tài)、滲透壓的重要因素[5]。由于胃癌組織的生長(zhǎng)發(fā)育需要較多的物質(zhì),因此胃癌組織周圍常伴有豐富的小血管,故線粒體數(shù)量同樣較高,而LETM1作為參與癌癥發(fā)生發(fā)展的重要因素及線粒體中常見(jiàn)物質(zhì)[6],亦具有較高的表達(dá),故復(fù)發(fā)患者中LETM1多以高表達(dá)形式呈現(xiàn),表示胃癌組織仍具有充足的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)及再次發(fā)生的可能。劉偉昌等[7]在研究中發(fā)現(xiàn),LETM1高表達(dá)可能加快中原癌基因(c-myc)等基因轉(zhuǎn)錄速度,并激活其他信號(hào)通路,達(dá)到促進(jìn)惡性腫瘤細(xì)胞分裂、增殖甚至遷移的進(jìn)程,進(jìn)一步提高復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)。陳樂(lè)樂(lè)等[8]學(xué)者亦在報(bào)道中指出,LETM1可通過(guò)調(diào)節(jié)PI3K/Akt信號(hào)及胃癌組織周圍細(xì)胞,參與胃癌發(fā)生發(fā)展進(jìn)程,提高復(fù)發(fā)率。TIMP-1是可通過(guò)活化間質(zhì)膠質(zhì)酶等物質(zhì)的低分子量蛋白,亦具有抑制基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)的功能[9]。如抑制基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)等,MMP-9是常見(jiàn)腫瘤標(biāo)志物,不僅可影響細(xì)胞外基質(zhì)的降解進(jìn)程,還可增強(qiáng)腫瘤浸潤(rùn)能力,且與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[10],是影響復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移的重要因素。TIMP-1則是以蛋白酶共價(jià)結(jié)合的形延緩甚至避免水解,達(dá)到抑制腫瘤細(xì)胞的作用[11]。許林波等[12]在報(bào)道中指出,TIMP-1可與MMP-9進(jìn)行結(jié)合,降低MMP-9活性。而MMP-9活性降低可阻礙胃癌發(fā)生發(fā)展的作用,TIMP-1表達(dá)亦可能受MMP-9活性降低影響,呈現(xiàn)出高表達(dá),打破TIMP-1與MMP-9的平衡,導(dǎo)致癌細(xì)胞侵襲能力增強(qiáng),影響復(fù)發(fā)[13],而當(dāng)TIMP-1處于高表達(dá)時(shí),多以陽(yáng)性進(jìn)行表達(dá),此時(shí)TIMP-1可激活血管內(nèi)皮因子(VEGF)、絲裂素活化蛋白激酶(MAKP信號(hào)通路),引起腫瘤細(xì)胞增殖速度加快并在快速傳播下,進(jìn)一步提高復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)[14]。

本次研究還對(duì)聯(lián)合檢測(cè)能否預(yù)測(cè)生存時(shí)間展開(kāi)比較,發(fā)現(xiàn)亦生存時(shí)間<3年同樣與TIMP-1陽(yáng)性、LETM1高表達(dá)的有關(guān),其根本原因是兩種檢測(cè)結(jié)果是胃癌發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移的重要參考。一方面,TIMP-1陽(yáng)性、LETM1高表達(dá)患者在胃癌根治術(shù)后具有較高的復(fù)發(fā)率,可能直接影響患者生存時(shí)間。另一方面,LETM1高表達(dá),不僅表示胃癌組織周圍具有較充足的能量及營(yíng)養(yǎng),還可能因LETM1 mRNA激發(fā)部分信號(hào)通路,加快胃癌細(xì)胞增殖,增強(qiáng)胃癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為[15],進(jìn)而增強(qiáng)胃癌對(duì)患者威脅,縮短生存時(shí)間。孫國(guó)巖等[16]學(xué)者也發(fā)現(xiàn),TIMP-1表達(dá)水平較高常表示預(yù)后較差,與本次研究結(jié)論類似。

綜上所述,LETM1、TIMP-1聯(lián)合檢測(cè)可幫助中期胃癌患者預(yù)測(cè)胃癌根治術(shù)后復(fù)發(fā)狀況及生存時(shí)間,具有臨床價(jià)值。