王云鵬 張新蔚 呂旭方 馬寶亮 李小全 魏書(shū)堂 徐 麗

肝癌患者經(jīng)及時(shí)治療,其5年生存率通常較高,臨床常以手術(shù)切除做為治療早期肝癌的首選方案,但肝組織減少、凝血因子減少等原因,影響患者凝血能力,因此圍術(shù)期需適當(dāng)使用異體輸血輔助治療[1]。但異體輸血中部分白細(xì)胞、細(xì)胞因子等活性成分可能抑制肝癌患者細(xì)胞免疫功能,增加患者感染風(fēng)險(xiǎn)和死亡風(fēng)險(xiǎn),可能影響患者生存期[2]。目前有研究發(fā)現(xiàn),血液制品經(jīng)定量射線輻照后,血液中具有免疫活性的T淋巴細(xì)胞會(huì)喪失植活、增殖能力,失去其免疫反應(yīng),可有效預(yù)防輸血相關(guān)性宿主疾病,但在肝癌患者中相關(guān)研究報(bào)道較少[3]。對(duì)此,本次研究回顧性分析輻照紅細(xì)胞與普通懸浮紅細(xì)胞輸注對(duì)肝癌患者CD4+T細(xì)胞亞群水平的影響,現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 一般資料

回顧性分析2018年5月至2020年5月我院收治的100例肝癌患者,根據(jù)輸血紅細(xì)胞類型,將以輻照紅細(xì)胞輸注治療的65例患者納入輻照組,以普通懸浮紅細(xì)胞輸注治療的35例患者納入普通組。

納入標(biāo)準(zhǔn):經(jīng)病理活檢診斷為肝癌[4];臨床分期為Ⅰ、Ⅱ期[5];術(shù)前凝血功能正常;符合肝癌手術(shù)指征;存在術(shù)后血紅蛋白(Hb)<70 g/L等輸血指征;術(shù)前無(wú)放化療史;近期無(wú)激素治療史;近期無(wú)輸血史。

排除標(biāo)準(zhǔn):術(shù)前合并感染;臨床資料不全;術(shù)中輸血量少且術(shù)后凝血功能正常;術(shù)前嚴(yán)重貧血。

輻照組中性別(男/女):35/30例;年齡38～61歲,平均(50.02±4.98)歲;肝癌分期:Ⅰ期36例,Ⅱ期29例;病理檢查結(jié)果:肝細(xì)胞型53例,膽管細(xì)胞型12例;腫瘤最大直徑平均(3.12±0.58)cm;術(shù)前Hb水平平均(115.29±7.05)g/L。

普通組中性別(男/女):19/16例;年齡36～62歲,平均(49.58±5.07)歲;肝癌分期:Ⅰ期20例,Ⅱ期15例;病理檢查結(jié)果:肝細(xì)胞型29例,膽管細(xì)胞型6例;腫瘤最大直徑平均(3.07±0.56)cm;術(shù)前Hb水平平均(113.98±7.01)g/L。

兩組患者一般資料比較無(wú)明顯差異(P>0.05)。

1.2 治療方法

普通組患者以普通懸浮紅細(xì)胞輸注治療;輻照組患者以輻照紅細(xì)胞輸注治療,輻照射線為137Cs γ射線,輻照劑量為25 Gy。2組患者輸血量根據(jù)患者個(gè)體情況設(shè)置為2～4IU,均為懸浮紅細(xì)胞,未輸入血漿等其他成分。

1.3 指標(biāo)檢測(cè)方法

外周血CD4+T細(xì)胞亞群水平檢測(cè):①Th1、Th2:2組患者分別于輸血前、輸血后14 d時(shí)采集肝癌患者血液樣本,以肝素抗凝處理后保存,檢測(cè)時(shí)取分別0.5 ml血液樣本,加入等量刺激溶劑,輸血前樣本放入對(duì)照管中,輸血后14 d樣本放入試驗(yàn)管中,加入10 μl的流式抗體溶液混勻,避光放置20 min,加入1 ml溶血素,混勻避光放置10 min,以1500 r/min轉(zhuǎn)速下離心5 min,取其下層沉淀物加入200 μl破膜劑,避光在4 ℃下放置20 min,使用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌后,離心保留下層沉淀物,加入IFN-γ-FITC、IL-4-PE各5 μl,避光在4 ℃下放置30 min,以固定劑固定后,在流式細(xì)胞儀中檢測(cè)Th1、Th2水平。②Th17:將2組患者血液樣本加入PBS混勻,加入分離試劑分離單個(gè)核細(xì)胞,使用培養(yǎng)基溶液重懸細(xì)胞,將其轉(zhuǎn)移至24孔板中,分別加入丙二醇甲醚醋酸酯、蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑、ionomycin溶液,調(diào)整其濃度,在37 ℃、5% CO2環(huán)境下放置4 h后,將其轉(zhuǎn)移至試管中,并分別加入流式標(biāo)記抗體溶液,對(duì)照管中加入等量同型抗體,避光在4 ℃下放置30 min,再次加入100 μl PBS溶液,加入1 ml固定劑,避光在4 ℃下放置30 min,加入2 ml破膜劑后離心,保留下層沉淀物,試驗(yàn)管中加入流式標(biāo)記抗體溶液,普通組中加入等量同型抗體,避光在4 ℃下放置30 min,洗滌后再次加入0.5 ml PBS溶液,使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)Th17水平。③Treg:測(cè)試管中血液樣品加入流式標(biāo)記抗體溶液,避光在4 ℃下放置30 min,加入PBS溶液,加入1 ml固定劑,避光在4 ℃下放置30 min,使用2 ml破膜劑洗滌2次,使用正常大鼠血清封閉15 min,測(cè)試管加入流式標(biāo)記抗體溶液,對(duì)照管加入等量抗體溶液,避光在4 ℃下放置30 min,再次以0.5 ml PBS洗滌,使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)Treg水平。

細(xì)胞因子水平檢測(cè):分別在輸血前、輸血后14 d時(shí)采集2組患者血樣,離心取血清使用酶聯(lián)免疫試劑盒檢測(cè)其中白介素-2(IL-2)、白介素-10(IL-10)、白介素-17(IL-17)、干擾素(IFN-γ)。

1.4 觀察指標(biāo)

比較輸血前和輸血后14 d時(shí),2組患者外周血CD4+T細(xì)胞亞群水平(Th1、Th2、Th17、Treg)、細(xì)胞因子水平(IL-2、IL-10、IL-17、IFN-γ)。比較輸血后3個(gè)月內(nèi)2組患者感染發(fā)生率。輸血后隨訪3年,比較2組患者無(wú)進(jìn)展生存期(PFS)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 外周血CD4+T細(xì)胞亞群水平比較

輸血前2組患者Th1、Th2、Th17、Treg水平比較無(wú)明顯差異。輸血后14 d時(shí),輻照組患者Th1、Th17、Treg水平略高于輸血前,Th2水平略低于輸血前,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);普通組患者Th1水平顯著低于輸血前,Th2、Treg水平顯著高于輸血前(P<0.05),Th17水平略高于輸血前,但比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);輻照組Th1水平顯著高于普通組,Th2、Treg水平顯著低于普通組(P<0.05),2組Th17比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見(jiàn)表1。

表1 2組患者外周血CD4+T細(xì)胞亞群水平比較

2.2 細(xì)胞因子水平比較

輸血前2組患者IL-2、IL-10、IL-17、IFN-γ水平比較無(wú)明顯差異。輸血后14 d時(shí),輻照組患者IL-10、IL-17水平略高于輸血前,IL-2、IFN-γ水平略低于輸血前,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);普通組患者IL-2、IFN-γ水平顯著低于輸血前,IL-10、IL-17水平顯著高于輸血前(P<0.05);輻照組患者IL-2、IFN-γ水平顯著高于普通組,IL-10、IL-17水平顯著低于普通組(P<0.05),見(jiàn)表2。

2.3 感染發(fā)生率比較

輸血后3個(gè)月內(nèi),輻照組感染發(fā)生率為3.08%(2/65),普通組感染發(fā)生率為8.57%(3/35),輻照組感染發(fā)生率低于普通組,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.521,P=0.471)。

2.4 PFS比較

輻照組平均PFS為34.14個(gè)月(95%CI=31.266～35.477),普通組平均PFS為33.37個(gè)月(95%CI=32.878～34.862),2組PFS比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Log Rank χ2=0.479,P=0.489),見(jiàn)圖1。

圖1 2組患者PFS比較

3 討論

肝癌患者圍術(shù)期由于貧血、血容量不足等原因,常使用異體輸血輔助治療,但異體輸血中部分活性因子會(huì)影響患者免疫功能,導(dǎo)致輸血后患者感染風(fēng)險(xiǎn)增加,不利于其回復(fù),因此需研究適當(dāng)方式緩解異體輸血對(duì)患者免疫功能的影響[6]。

CD4+T細(xì)胞亞群是免疫過(guò)程中重要成員,在抗感染、抗腫瘤中起到重要作用。其中Th1具有激活抗腫瘤活性等作用,介導(dǎo)細(xì)胞免疫;Th2主要分泌免疫因子,參與體液免疫;Th17細(xì)胞可分泌白細(xì)胞介素-21(IL-21)等因子,參與感染、腫瘤等疾病過(guò)程;Treg可分泌IL-10等因子,參與腫瘤免疫過(guò)程,Th1、Th2、Th17、Treg水平可反映肝癌患者免疫能力[7]。異體普通懸浮紅細(xì)胞輸注時(shí),其中存在的部分可溶性白細(xì)胞抗原等活性物質(zhì)會(huì)引起肝癌患者機(jī)體免疫功能抑制。本次研究結(jié)果中,輸血后14 d時(shí),輻照組患者Th1、Th17、Treg水平略高于輸血前,Th2水平略低于輸血前,比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;普通組患者Th1水平顯著低于輸血前,Th2、Treg水平顯著高于輸血前,Th17水平略高于輸血前,但比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;輻照組Th1水平顯著高于普通組,Th2、Treg水平顯著低于普通組,2組Th17比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,提示輻照紅細(xì)胞輸注可明顯緩解異體輸血所致的免疫抑制。原因在于,輻照紅細(xì)胞使用定量射線照射血液,利用淋巴細(xì)胞對(duì)電離輻射敏感的特點(diǎn),以特殊射線直接照射損傷細(xì)胞核,導(dǎo)致血液中T淋巴細(xì)胞活性喪失,并無(wú)法增殖分化,經(jīng)異體輸血輸注至肝癌患者體內(nèi)后,無(wú)法攻擊患者自身免疫系統(tǒng),可保持肝癌患者體內(nèi)CD4+T細(xì)胞亞群動(dòng)態(tài)平衡,維持其正常免疫應(yīng)答[8]。

IL-2、IL-10、IL-17、IFN-γ均為免疫因子,由CD4+T細(xì)胞亞群分泌。普通紅細(xì)胞輸注治療肝癌患者會(huì)抑制其免疫功能,從而影響其免疫因子分泌水平,提高感染風(fēng)險(xiǎn)[9]。本次研究結(jié)果中,輸血前2組患者IL-2、IL-10、IL-17、IFN-γ水平比較無(wú)明顯差異,輸血后14d時(shí),輻照組患者IL-10、IL-17水平略高于輸血前,IL-2、IFN-γ水平略低于輸血前,比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;普通組患者IL-2、IFN-γ水平顯著低于輸血前,IL-10、IL-17水平顯著高于輸血前;輻照組患者IL-2、IFN-γ水平顯著高于普通組,IL-10、IL-17水平顯著低于普通組;輻照組患者感染發(fā)生率低于普通組,比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;2組PFS比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,說(shuō)明輻照紅細(xì)胞輸注可避免普通紅細(xì)胞輸注對(duì)肝癌患者免疫因子水平和感染風(fēng)險(xiǎn)的影響,輻照紅細(xì)胞、普通紅細(xì)胞輸注對(duì)肝癌患者PFS均無(wú)明顯影響。原因在于,普通紅細(xì)胞經(jīng)射線輻照后免疫因子等物質(zhì)均失去活性,肝癌患者輸注輻照紅細(xì)胞后,其自身免疫功能受到異體輸血的影響較小,CD4+T細(xì)胞亞群仍可維持一定范圍內(nèi)的動(dòng)態(tài)穩(wěn)定,分泌免疫因子可維持動(dòng)態(tài)穩(wěn)定,因此對(duì)IL-2、IL-10、IL-17、IFN-γ水平無(wú)明顯影響[10]。輻照紅細(xì)胞輸注可減少異體輸血對(duì)肝癌患者免疫功能的影響,患者輸血后預(yù)后情況理想,對(duì)PFS無(wú)明顯影響,而普通紅細(xì)胞輸注在輸血后短期內(nèi)抑制肝癌患者免疫功能,患者輸血后短期內(nèi)感染風(fēng)險(xiǎn)隨之提高,本次研究結(jié)果中2組患者感染發(fā)生率比較無(wú)明顯差異可能與病例數(shù)較少有關(guān)。而患者自身機(jī)體恢復(fù)能力可幫助其陸續(xù)恢復(fù)免疫功能,因此對(duì)于其PFS也無(wú)明顯影響[11]。

綜上所述,輻照紅細(xì)胞輸注對(duì)肝癌患者CD4+T細(xì)胞亞群水平、細(xì)胞因子水平、輸血后感染風(fēng)險(xiǎn)的影響顯著低于普通紅細(xì)胞輸注,且對(duì)肝癌患者PFS無(wú)明顯影響,可作為臨床異體輸血處理參考方案之一。