王根柱 王亦茹 常學(xué)忠

作者單位：450000 河南省鄭州市第三人民醫(yī)

原發(fā)性肝癌是起源于肝臟上皮或間葉組織的惡性腫瘤,是我國(guó)發(fā)病率排名第四、死亡率排名第二的癌癥類型,其發(fā)病受環(huán)境、飲食、病毒感染等多種因素影響,有起病隱匿、惡化速度快等特點(diǎn),患者發(fā)病早期多無(wú)特異性表現(xiàn),隨癌細(xì)胞增殖可逐漸表現(xiàn)肝區(qū)疼痛、腹痛、黃疸、發(fā)熱等癥狀,此時(shí)就診患者多為中晚期,存在較高預(yù)后不良的可能[1]。臨床分期是指導(dǎo)原發(fā)性肝癌治療方法選擇的重要參考,根據(jù)《原發(fā)性肝癌診療規(guī)范(2017年版)》指示,我國(guó)原發(fā)性肝癌分期主要依據(jù)全身狀況、肝功能、肝外轉(zhuǎn)移、血管侵犯、腫瘤數(shù)目、腫瘤大小6個(gè)方面分為Ⅰa-Ⅳ期,其中以存在肝外轉(zhuǎn)移的Ⅲb期以后不建議進(jìn)行手術(shù)治療,因此術(shù)前明確患者病理分期具有重要意義[2]。臨床原發(fā)性肺癌診斷常見(jiàn)甲胎蛋白、超聲檢查、磁共振成像等檢查,雖然臨床研究顯示存在較高診斷效能,但對(duì)疑似患者仍需要經(jīng)穿刺活檢證實(shí)或采取,可對(duì)患者造成一定創(chuàng)傷。微小RNA(MicroRNA,mi-RNA)是一類由內(nèi)源基因編碼的非編碼單鏈RNA分子,近年隨基因組學(xué)發(fā)展,越來(lái)越多研究人員發(fā)現(xiàn)mi-RNA與腫瘤增殖、侵襲能力的關(guān)聯(lián),同時(shí)有報(bào)道稱mi-RNA在肝硬化發(fā)展為肝癌過(guò)程中發(fā)揮重要作用,提醒其可作為診斷、治療原發(fā)性肝癌患者的生物標(biāo)志物[3-4]?；诖吮狙芯刻接懺l(fā)性肝癌患者血清miR-375、miR-155與臨床分期及預(yù)后的關(guān)系,旨在為臨床診療積累經(jīng)驗(yàn)。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

回顧我院2016年7月至2021年7月間收治的86例原發(fā)性肝癌患者資料,其中男性55例,女性31例;年齡45～76歲,平均(55.12±3.48)歲;肝炎病史25例,肝硬化病史17例;平均甲胎蛋白(874.38±29.76)ng/mL;體力活動(dòng)狀態(tài)(performance status,PS)評(píng)分:0分13例,1分34例,2分28例,3分10例,4分1例;Child-Pugh肝功能分級(jí):A級(jí)34例,B級(jí)50例,C級(jí)2例;腫瘤數(shù)量:單發(fā)20例,多發(fā)66例;臨床分期(china liver cancer staging,CNLC):Ⅰa期5例,Ⅰb期18例,Ⅱa期13例,Ⅱb期15例,Ⅲa期15例,Ⅲb期7例,Ⅳ期13例;所有患者肺癌類型均為肝細(xì)胞癌。兩組均對(duì)研究知情同意。

納入標(biāo)準(zhǔn):①年齡>18歲;②符合《原發(fā)性肝癌診療規(guī)范(2017年版)》中診斷標(biāo)準(zhǔn)[2],經(jīng)病理學(xué)檢查確診;③首次確診;④臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn):①活動(dòng)性肝炎;②合并其他器官系統(tǒng)惡性腫瘤;③入院前接受相關(guān)治療。

1.2 檢測(cè)方法

入院時(shí)取患者外周靜脈血5 mL,常溫靜置30 min,以3000 rpm轉(zhuǎn)速離心10 min分離血清保存至-80 ℃冰箱備用。取500 μL血清利用TRIzol RNA試劑盒提取總RNA,應(yīng)用分光光度計(jì)檢測(cè)RNA濃度、純度,結(jié)果A260/A280在1.8～2.0判定RNA正常。使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA并取2 μg進(jìn)行實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增,反應(yīng)參數(shù):94 ℃ 2 min,94 ℃ 30 s,58 ℃ 30s,循環(huán)40次,結(jié)果利用2-ΔΔCt法計(jì)算血清miR-375、miR-155表達(dá)量。

1.3 評(píng)價(jià)指標(biāo)

①將患者依據(jù)《原發(fā)性肝癌診療規(guī)范(2017年版)》中診斷流程臨床分期(Ⅰ～Ⅳ期),統(tǒng)計(jì)各分期患者血清miR-375、miR-155表達(dá)水平,應(yīng)用Spearman相關(guān)系數(shù)做臨床分期與血清miR-375、miR-155表達(dá)水平相關(guān)性分析。②將患者依據(jù)是否存在肝外轉(zhuǎn)移分為轉(zhuǎn)移組(臨床分期Ⅰa～Ⅲa期)、非轉(zhuǎn)移組(臨床分期Ⅲb～Ⅳ期),比較兩組患者血清miR-375、miR-155表達(dá)水平,應(yīng)用受試者曲線(ROC)分析診斷臨床分期的效能。③將患者依據(jù)ROC曲線所得截?cái)嘀?將患者分為miR-375高表達(dá)、低表達(dá),miR-155高表達(dá)、低表達(dá),比較不同表達(dá)水平患者預(yù)后(平均生存時(shí)間),采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線。④應(yīng)用COX比例風(fēng)險(xiǎn)模型分析影響患者預(yù)后獨(dú)立影響因素。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 不同臨床分期患者血清miR-375、miR-155表達(dá)水平比較

不同臨床分期患者血清miR-375、miR-155表達(dá)水平比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見(jiàn)表1。

表1 不同臨床分期患者血清miR-375、miR-155表達(dá)水平比較

2.2 血清miR-375、miR-155表達(dá)水平與臨床分期的相關(guān)性分析

血清miR-375表達(dá)水平與臨床分期呈負(fù)相關(guān)(P<0.05),miR-155表達(dá)水平與臨床分期呈正相關(guān)(P<0.05),見(jiàn)表2、圖1、2。

圖1 血清miR-375表達(dá)水平與臨床分期的相關(guān)性

圖2 血清miR-155表達(dá)水平與臨床分期的相關(guān)性

表2 血清miR-375、miR-155表達(dá)水平與臨床分期的相關(guān)性參數(shù)

2.3 血清miR-375、miR-155表達(dá)水平診斷腫瘤轉(zhuǎn)移的ROC曲線

轉(zhuǎn)移組血清miR-375表達(dá)水平低于非轉(zhuǎn)移組,miR-155表達(dá)水平高于非轉(zhuǎn)移組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見(jiàn)表3。血清miR-375、miR-155表達(dá)水平及聯(lián)合診斷腫瘤轉(zhuǎn)移的AUC分為0.898、0.847、0.941,見(jiàn)表4、圖3。

圖3 血清miR-375、miR-155診斷腫瘤轉(zhuǎn)移的ROC曲線

表3 轉(zhuǎn)移組與非轉(zhuǎn)移組患者血清miR-375、miR-155表達(dá)水平比較

表4 血清miR-375、miR-155診斷腫瘤轉(zhuǎn)移的ROC參數(shù)

2.4 不同血清miR-375、miR-155表達(dá)水平患者預(yù)后比較

以ROC曲線所得截?cái)嘀祫澐只颊哐錷iR-375、miR-155表達(dá)水平高低,其中miR-375高表達(dá)49例,低表達(dá)37例,miR-155高表達(dá)41例,低表達(dá)45例。miR-375高表達(dá)患者平均生存時(shí)間均長(zhǎng)于miR-375低表達(dá)患者,miR-155高表達(dá)患者平均生存時(shí)間均短于miR-155低表達(dá)患者,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見(jiàn)表5,圖4、5。

圖4 不同血清miR-375表達(dá)水平患者的生存曲線

圖5 不同血清miR-155表達(dá)水平患者的生存曲線

表5 不同血清miR-375、miR-155表達(dá)水平患者預(yù)后比較

2.5 患者預(yù)后影響因素分析

血清miR-375、miR-155表達(dá)水平是患者預(yù)后獨(dú)立影響因素(P<0.05),其中miR-375表達(dá)水平為獨(dú)立保護(hù)因素,miR-155表達(dá)水平為獨(dú)立危險(xiǎn)因素,見(jiàn)表6。

表6 患者預(yù)后影響因素分析

3 討論

原發(fā)性肝癌高發(fā)病率、高死亡率、預(yù)后差的特點(diǎn)是對(duì)居民健康的巨大威脅,盡早診治、及時(shí)治療是挽救患者生命的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。基于生命科學(xué)的蓬勃發(fā)展,從基因?qū)用嬖\療肝癌逐步應(yīng)用開(kāi)來(lái),其中mi-RNA近年來(lái)受到臨床廣泛關(guān)注。mi-RNA是廣泛存在于動(dòng)植物體內(nèi)的進(jìn)化上高度保守且具有良好穩(wěn)定性的內(nèi)源性非編碼小分子單鏈RNA,其不僅能參與人體生長(zhǎng)發(fā)育、調(diào)節(jié)生命活動(dòng),而且有多項(xiàng)報(bào)道說(shuō)明其在惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用[5],更有學(xué)者認(rèn)為其可能成為改善腫瘤耐藥的新靶點(diǎn)[6]。本研究以原發(fā)性肝癌患者為對(duì)象探究血清miR-375、miR-155與臨床分期,發(fā)現(xiàn)二者表達(dá)水平與患者臨床分期存在關(guān)聯(lián),提醒miR-375、miR-155參與原發(fā)性肝癌疾病發(fā)展過(guò)程。

miR-375是人染色體2q35區(qū)上cryba2和Cadc108基因區(qū)域間的片段,有多位學(xué)者發(fā)現(xiàn)其可在胃癌、食管癌等多種惡性腫瘤中異常表達(dá)。在本研究中可見(jiàn)隨患者臨床分期升高miR-375表達(dá)水平逐漸下降,推測(cè)其與抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)相關(guān),次結(jié)論在He等[7]動(dòng)物模型中已有證實(shí),其研究團(tuán)隊(duì)將miR-375模擬物結(jié)合到肝癌小鼠模型的AEG-1位點(diǎn)發(fā)現(xiàn)可抑制腫瘤生長(zhǎng)。臨床有研究生物信息學(xué)篩選出多種參與肝細(xì)胞癌進(jìn)展的核心基因,其中非染色體結(jié)構(gòu)維護(hù)凝縮蛋白Ⅰ復(fù)合體G亞基(NCAPG)被認(rèn)為在肝癌細(xì)胞中異常高表達(dá),與不良預(yù)后直接相關(guān)[8],而在Dai等[9]研究中發(fā)現(xiàn)miR-375與NCAPG2存在靶向關(guān)系,補(bǔ)充miR-375可下調(diào)NCAPG2表達(dá)水平從而抑制肝癌細(xì)胞增殖和遷移且誘導(dǎo)其細(xì)胞凋亡。本研究以肝外轉(zhuǎn)移為依據(jù)將患者分組比較miR-375表達(dá)表達(dá)水平,發(fā)現(xiàn)二組存在顯著差異,證明術(shù)前利用血清miR-375檢查診斷原發(fā)性肝癌患者肝外轉(zhuǎn)移的可能性,據(jù)臨床診療指南建議,肝外轉(zhuǎn)移Ⅲb期以上患者不建議行手術(shù)治療,因此術(shù)前檢查血清miR-375有助于治療選擇,避免患者額外損傷。此外經(jīng)生存分析可見(jiàn),血清miR-375低表達(dá)患者平均生存期更短,是患者預(yù)后不良的獨(dú)立影響因素,再次提醒原發(fā)性肺癌患者診療過(guò)程中血清miR-375的應(yīng)用前景。

本研究結(jié)果中顯示原發(fā)性肝癌患者血清miR-155表達(dá)水平與臨床分期正相關(guān),考慮其在肝癌細(xì)胞增殖遷移中發(fā)揮推動(dòng)作用。miR-155促腫瘤發(fā)展最初見(jiàn)于淋巴瘤研究中,發(fā)現(xiàn)其過(guò)量表達(dá)可使外周血CD8+T細(xì)胞減少并抑制T細(xì)胞受體信號(hào)傳導(dǎo),從而推動(dòng)淋巴瘤進(jìn)展[10]。在肝臟相關(guān)活動(dòng)中,Wang等[11]研究發(fā)現(xiàn)HBeAg可通過(guò)誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞過(guò)量表達(dá)miR-155,利用其促進(jìn)炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生的機(jī)制來(lái)加速肝損傷。而乙肝病毒感染引起的免疫反應(yīng)、慢性炎癥正是誘發(fā)原發(fā)性肝癌的重要危險(xiǎn)因素[12],可見(jiàn)miR-155高表達(dá)參與的炎癥可能推動(dòng)癌變進(jìn)程。此外,Xin等[13]研究人員發(fā)現(xiàn)miR-155通過(guò)抑制肝癌細(xì)胞中的H3F3A促進(jìn)CDK2的磷酸化修飾進(jìn)而競(jìng)爭(zhēng)性抑制P21WAF1/CIP1的轉(zhuǎn)錄和翻譯,達(dá)到促腫瘤發(fā)生的作用,值得一提的該研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)過(guò)量的P21WAF1/CIP1可抵消miR-155的癌變功能,可能成為未來(lái)治療肝癌的方向。本研究結(jié)果顯示血清miR-155檢測(cè)存在較高診斷肝外轉(zhuǎn)移的效能,特異度可達(dá)95.00%且與miR-375聯(lián)合診斷可明顯提高敏感度至86.36%。而經(jīng)生存分析顯示,血清miR-155高表達(dá)是原發(fā)性肝癌患者預(yù)后不良的危險(xiǎn)因素,表達(dá)水平更高的患者存在更短的平均生存時(shí)間,考慮與miR-155參與腫瘤細(xì)胞化療藥物耐藥機(jī)制相關(guān)。雖然miR-155表達(dá)與肝癌患者化療耐藥關(guān)聯(lián)的報(bào)道較少,但其在其他癌癥耐藥中的作用報(bào)道逐漸增多,胡波等[14]研究顯示吉非替尼獲得性耐藥非小細(xì)胞肺癌患者中miR-155表達(dá)異常高表達(dá),可能與預(yù)后相關(guān)。而黃惠敏等[15]發(fā)現(xiàn)在急性淋巴細(xì)胞白血病患兒中過(guò)量的miR-155可通過(guò)激活Wnt/β-Catenin信號(hào)通路,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖,從而抑制凋亡,導(dǎo)致化療耐藥。

綜上所述,原發(fā)性肝癌患者體內(nèi)存在miR-375、miR-155異常表達(dá),二者水平與臨床分期、預(yù)后存在明顯關(guān)聯(lián),可作為治療前分期診斷生物指標(biāo),對(duì)后續(xù)治療方法選擇存在一定指導(dǎo)意義,疾病管理中監(jiān)測(cè)二者表達(dá)水平有助于預(yù)后判斷。