翟羽佳，蔡若楠，陳璽同，李欣恒，王欣，薛紅，付學(xué)鵬

不同基因型大豆根際及根內(nèi)促生菌的分離篩選

翟羽佳1，蔡若楠1，陳璽同1，李欣恒1，王欣1，薛紅2，付學(xué)鵬1

（1. 齊齊哈爾大學(xué) 生命科學(xué)與農(nóng)林學(xué)院，黑龍江 齊齊哈爾 161006；2. 黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 克山分院，黑龍江 齊齊哈爾 161006）

從10種不同基因型大豆（齊農(nóng)26、齊農(nóng)28、齊農(nóng)33、齊農(nóng)41、合豐50、合豐51、合豐55、黑河43、黑河45、農(nóng)慶29）根際土壤及根內(nèi)篩選具有促生能力的菌株共56株．其中，14株具有結(jié)瘤能力，2株具有固氮能力，44株具解磷能力，43株具溶磷能力，24株具IAA產(chǎn)生能力．由此可見，多株菌株同時具有多項促生能力．分別從中挑選3株綜合促生能力較好的菌株QN15，N12，H16進(jìn)行盆栽實驗．結(jié)果表明，施加以上菌原液及稀釋液均能顯著提高植株株高、莖粗、根瘤數(shù)、結(jié)莢數(shù)、植株地上部分鮮質(zhì)量及干質(zhì)量．其中，與施加LB對照組相比，施加QN15原液、QN15稀釋液、N12原液、N12稀釋液、H16原液、H16稀釋液分別提高植株地上生物量18%，29%，2%，26%，31%，2%．這些結(jié)果將為促生菌在農(nóng)業(yè)上的應(yīng)用提供參考．

大豆；促生菌；分離篩選

在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，化肥的過度使用導(dǎo)致土壤肥力、糧食產(chǎn)量和質(zhì)量下降．為此，許多國家開始研發(fā)微生物肥料，其中植物根際促生菌（Plant Growth Promoting Rhizobacteria，PGPR）的開發(fā)和利用成為了研究熱點．PGPR是一類生活在土壤中或附著在植物根部的菌類微生物，可促進(jìn)植物生長發(fā)育及其對礦質(zhì)營養(yǎng)的吸收和利用，同時能抑制有害微生物生長[1]．它們與土壤微生物群表現(xiàn)出協(xié)同和拮抗的相互作用，并參與一系列生態(tài)活動[2]．這些根際微生物可能會大量產(chǎn)生促生長物質(zhì)，從而間接影響植物的整體形態(tài)．因此，PGPR在農(nóng)業(yè)中的潛力穩(wěn)步增加，以一種新的方式逐漸取代化肥、殺蟲劑等的使用．

PGPR促進(jìn)植物生長發(fā)育的方式是幫助植物獲取營養(yǎng)．在這方面，研究和應(yīng)用最多的是根瘤菌和豆科植物之間的固氮共生．豆科植物能夠與根瘤菌建立共生關(guān)系，形成根瘤，研究結(jié)果表明，根瘤可以有效固定空氣中的氮氣，并轉(zhuǎn)化成植物可以利用的氨態(tài)氮，使用根瘤菌可以大量減少農(nóng)作物生產(chǎn)過程中對工業(yè)氮肥的依賴[3]．這種能力是在大田作物栽培中使用細(xì)菌接種劑的基礎(chǔ)[4]．根瘤菌的施用可以使作物增產(chǎn)，如施用含根瘤菌、固氮菌的復(fù)合菌劑可以使大豆增產(chǎn)36.1%[5]，同時大豆根際還存在大量具有溶磷、解磷、產(chǎn)IAA（吲哚乙酸）等功能的其他促生微生物，以及具有多項促生能力的菌株．

然而，微生物對植物的影響作用遠(yuǎn)不僅如此，促生微生物也與植物具有緊密的遺傳學(xué)關(guān)聯(lián)，不同基因型植株根系招募的有益微生物不同，植物功能類型的基因受到根際微生物群落組成的影響．因此，本研究從10種不同基因型大豆根際土壤及根內(nèi)篩選具有促生能力的菌株，以期得到同時具有多項促生能力的菌株，為微生物菌劑的開發(fā)及利用奠定基礎(chǔ)，從而更有效地提高大豆產(chǎn)量．

1　材料與方法

1.1　實驗材料

1.1.1大豆品種齊農(nóng)26，齊農(nóng)28，齊農(nóng)33，齊農(nóng)41，合豐50，合豐51，合豐55，黑河43，黑河45，農(nóng)慶29（黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院齊齊哈爾分院）．

1.1.2土壤土壤為齊齊哈爾市富拉爾基區(qū)田土，其基本理化性質(zhì)為：有機(jī)質(zhì)質(zhì)量濃度23.23 g/kg，堿解氮質(zhì)量濃度293 mg/kg，有效磷質(zhì)量濃度238.58 mg/kg，速效鉀質(zhì)量濃度93.21 mg/kg，pH7.23，電導(dǎo)率1.31 ms/cm．土壤過篩（4目），去掉大顆粒土壤和雜質(zhì)，裝盆前充分混合均勻備用．

1.1.3培養(yǎng)基LB培養(yǎng)基（1 L）：酵母5.0 g，NaCl 8.0 g，蛋白胨10.0 g，瓊脂20.0 g，pH7.0，液體培養(yǎng)基不加瓊脂．

7種分離培養(yǎng)基（1 L）：TSB培養(yǎng)基、TYG培養(yǎng)基、TWYE培養(yǎng)基、YEM培養(yǎng)基、M408培養(yǎng)基、M715培養(yǎng)基、Flour培養(yǎng)基，參考文獻(xiàn)[6]的方法．

蒙金娜有機(jī)磷培養(yǎng)基（1 L）：葡萄糖10.0 g，（NH4）2SO40.5 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，MnSO4·4H2O 0.3 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.03 g，KCl 0.3 g，NaCl 0.3 g，CaCO35.0 g，卵磷脂0.2 g，瓊脂20.0 g，pH7.0，液體培養(yǎng)基不加瓊脂．

PKO培養(yǎng)基（1 L）：葡萄糖10.0 g，（NH4）2SO40.5 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，MnSO4·4H2O 0.03 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.03 g，KCl 0.3 g，NaCl 0.3 g，Ca3（PO4）210.0 g，瓊脂20.0 g，pH7.0，液體培養(yǎng)基不加瓊脂．

1.2　實驗方法

1.2.1大豆種植選擇齊齊哈爾市廣泛種植的10種不同基因型大豆，盆栽種植后，置放于齊齊哈爾大學(xué)溫室（晝16 h 25℃/夜8 h 18℃），每個基因型種植5盆，每盆播種3粒，生長期間不施加化肥，每隔2 d澆水一次，每次200 mL．

1.2.2根際和根內(nèi)微生物的分離取生長到R5階段的不同基因型大豆植株根系，通過抖根法去除根系附著的大塊土壤后，將附帶根瘤的根系用無菌剪刀剪至無菌培養(yǎng)瓶中，放置超凈工作臺中，用無菌磷酸鹽緩沖溶液（PBS）洗滌后收集大豆根，包括根瘤[7]，用研缽和研杵將根樣品在15 mL無菌PBS（pH=7.0）中研磨，6層無菌紗布過濾．濾液用無菌PBS稀釋1 000倍．最后，將100 μL稀釋的濾液分別在7種分離培養(yǎng)基上涂布，并在28℃下靜置孵育1～2 d．待單菌落長出后，挑出單個菌落在各自的固體培養(yǎng)基上劃線純化，從這些固體培養(yǎng)基上再次挑取單菌落進(jìn)行純化，隨后將所有單一菌株儲存在40%的甘油中，在-80℃保存．

1.2.3菌株結(jié)瘤、固氮能力測定使用PCR（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）測定法鑒定菌株結(jié)瘤因子合成基因（NodA）和氮固定標(biāo)志基因（NifH），PCR引物在上海生工合成，具體序列見表1．PCR反應(yīng)體系為25 μL體系（酶12.5 μL，上下游引物各0.5 μL，煮沸后的菌液1 μL，去離子水10.5 μL），置于PCR儀中，95℃預(yù)變性30 min，95℃變性30 s，40℃退火30 s，72℃延伸1 min，72℃終延伸7 min，其中變性、退火、延伸三步進(jìn)行35個循環(huán)，最終將得到的PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測．

表1　NodA，NifH引物序列

1.2.4菌株溶磷、解磷能力測定將待測菌株接種到含15 mL無菌原分離液體培養(yǎng)基的無菌離心管中，28℃ 180 r/min震蕩培養(yǎng)2 d，取2.5 μL菌液以四分法分別點接于蒙金娜有機(jī)磷固體培養(yǎng)基和PKO固體培養(yǎng)基上，28℃黑暗中恒溫培養(yǎng)，10 d后觀察各菌株的溶磷、解磷圈形成情況．

1.2.5菌株產(chǎn)IAA能力測定將待測菌株接種到15 mL含200 mg/mL色氨酸的無菌LB液體培養(yǎng)基的無菌離心管中，28℃ 180 r/min震蕩培養(yǎng)2 d，得到菌株發(fā)酵液，8 000 r/min離心10 min，取上清液50 μL滴在白瓷板的凹槽內(nèi)，再加入50 μL Salkowski比色液（0.5 mol/L FeCl3溶液15 mL，濃硫酸300 mL，蒸餾水500 mL），以等量0.05 mg/mL IAA標(biāo)液做陽性對照，無菌LB液體培養(yǎng)基做陰性對照，避光顯色30 min，觀察顏色變化[10]．

1.2.6菌株安全性評價參考文獻(xiàn)[11]的方法檢測菌株的溶血性．將篩選到的綜合促生能力較好的菌株接種到原分離液體培養(yǎng)基中，28℃ 180 r/min震蕩培養(yǎng)2 d，取2.5 μL待測菌液，點接于血瓊脂平板，每個菌株三次重復(fù)，置于保溫箱35～37℃培養(yǎng)18～24 h，觀察有無溶血圈產(chǎn)生．

1.2.7盆栽實驗選擇綜合促生能力較強的菌株，在齊齊哈爾大學(xué)溫室進(jìn)行盆栽實驗，驗證其促生能力．盆栽使用塑料花盆的大小為13 cm×15 cm，每盆種植10粒大豆種子（黑河43），發(fā)芽7 d后，根據(jù)幼苗長勢情況間苗至每盆3株，留下的苗長勢一致．將待測菌株分別在其對應(yīng)的液體培養(yǎng)基中28℃ 180 r/min震蕩培養(yǎng)至OD600=1時，取10 mL菌液及10 mL稀釋20倍后的菌液分別澆灌至大豆幼苗根部，每個處理設(shè)置4盆重復(fù)，分別取10 mL無菌液體培養(yǎng)基及10 mL無菌水澆灌作為對照組，其他條件一致．間苗后2 d開始澆灌菌液，每10天澆灌一次，共澆灌兩次，澆灌菌液30 d后，采集植株進(jìn)行形態(tài)學(xué)指標(biāo)測定，包括株高、莖粗、根瘤數(shù)、結(jié)莢數(shù)、地上部干質(zhì)量、地上部鮮質(zhì)量、根部干質(zhì)量、根部鮮質(zhì)量．

1.2.8數(shù)據(jù)處理植株形態(tài)學(xué)指標(biāo)使用Microsoft Excel 2019進(jìn)行數(shù)據(jù)匯總；利用GraphPad Prism 8軟件，采用檢驗對不同處理間的數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析（<0.05）及作圖．

2　結(jié)果與分析

2.1　根系相關(guān)微生物的分離

本研究從10種不同基因型大豆根際土壤及根內(nèi)共篩選到224株細(xì)菌，根據(jù)菌株的分離來源分別編號，以備下一步促生功能鑒定．

2.2　菌株促生能力測定

2.2.1結(jié)瘤及固氮能力測定將篩選得到的224株菌株利用2種引物NodA和NifH進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并利用瓊脂糖凝膠電泳比對．最終得到14株具有結(jié)瘤因子合成基因的菌株，分別為H15，H16，H21，H4-3，HF25，HF28，HF50-11，HF55-23，N12，N13，QN15，Q26-08，QN41-2，QN41-21．其中，2株具有固氮基因的菌株，分別為H16，QN12．結(jié)果見圖1和表2．

圖1　結(jié)瘤及固氮能力測定

注：M為Marker；F為H16+NodA；G為H16+NifH；H為HF25+NodA；J為QN15+NodA；L為H21+NodA；N為N12+NodA；P為N13+NodA．

表2　各菌株促生能力

注：+為具有該功能，+越多，功能越強；－為不具有該功能．

2.2.2溶磷、解磷能力測定將篩選得到的224株菌株利用溶磷圈法在蒙金娜有機(jī)磷培養(yǎng)基檢測，根據(jù)溶磷圈產(chǎn)生情況（見圖2）得到具有溶磷能力的菌株43株（見表2）．

圖2　各菌株溶磷圈結(jié)果

注：按照平板從左至右、從上至下，菌株從左上開始順時針的順序依次為H22，H23，H13，H24；H4-2，H4-3，H4-22，H4-1；H4-11，H4-12，HF55-01，HF55-22；HF50-12，HF50-17，HF50-18，HF50-19；HF20，HF22，HF25，HF27；HF55-21，HF55-23，Q26-06，Q26-08；Q26-10，Q26-22，Q26-11，Q26-09；Q26-07，QN12，QN41-22，QN41-23；QN28-01，QN28-02，QN28-06，H4-13；QN41-2，QN41-3，QN41-21，N14；N12，N15，QN13，QN15；H16，H21，H15，H14．

利用解磷圈法在PKO培養(yǎng)基檢測，根據(jù)解磷圈產(chǎn)生情況（見圖3）得到具有解磷能力的菌株44株（見表2）．

圖3　各菌株解磷圈結(jié)果

注：按照平板從左至右、從上至下，菌株從左上開始順時針的順序依次為H13，H10，H11，H12；H14，H17，H18，H15；H24，HF28，HF26，HF20；H4-2，H4-3，H4-11，H4-12；HF50-11，HF50-12，HF22，HF25；QN41-22，QN41-23，HF27，N15；H16，H21，H22，H23；N13，N12，N14，HF55-01；HF50-18，HF50-17，HF50-19，HF50-16；QN28-01，QN28-02，QN28-06，QN41-1；Q26-09，Q26-10，Q26-07，Q26-06；QN13，QN15，QN11，QN12；QN14，H4-22，Q26-11，Q26-08；Q26-22，H4-13，HF55-22，H4-1；HF55-19，HF55-20，HF55-21，HF55-23；QN41-4，QN41-2，QN41-3，QN41-21．

2.2.3產(chǎn)IAA能力測定利用Salkowski比色法測定，根據(jù)顯色結(jié)果（見圖4）可見，有24株菌株出現(xiàn)粉紅色，即得到具有產(chǎn)IAA能力的菌株24株（見表2）．

圖4　各菌株Salkowski比色法顯色結(jié)果

注：a從左至右依次為LB，H4-22，H4-13，H4-12，標(biāo)液，H4-11，QN12，QN13，Q26-11，Q26-22，N13，N14；b從左到右依次為LB，HF25，HF26，HF27，標(biāo)液，HF28，HF50-11，HF50-12，HF55-01，N12，H13，H14；c從左到右依次為LB，H15，H16，標(biāo)液，H21，H22；d從左到右依次為LB，N15，QN11，標(biāo)液，QN14，QN15．

2.2.4菌株安全性評價利用血平板法對篩選得到菌株進(jìn)行溶血性檢測，發(fā)現(xiàn)僅1株菌株出現(xiàn)溶血圈（見圖5），已對其進(jìn)行滅菌處理，銷毀所有備份．

圖5　各菌株溶血性檢測結(jié)果

2.2.5盆栽實驗根據(jù)促生能力測定，選擇同時具有結(jié)瘤、固氮、溶磷、產(chǎn)IAA能力的菌株H16，及同時具有結(jié)瘤、溶磷、產(chǎn)IAA能力的菌株QN15和N12進(jìn)行盆栽實驗，進(jìn)一步驗證其促生能力（見圖6）．結(jié)果表明，施加以上菌株發(fā)酵液原液及稀釋液均能夠顯著提高植株的株高、莖粗、根瘤數(shù)、結(jié)莢數(shù)、植株地上部分鮮質(zhì)量及干質(zhì)量．同時，施加QN15原液、稀釋液及H16原液顯著提高了植株根部鮮質(zhì)量，施加QN15原液、稀釋液、N12稀釋液及H16稀釋液顯著提高了植株根部干質(zhì)量，即菌株QN15原液及稀釋液的施加對植株以上8個指標(biāo)均有顯著提升．其中，與施加LB對照組相比，施加QN15原液、QN15稀釋液、N12原液、N12稀釋液、H16原液、H16稀釋液分別提高了植株地上生物量18%，29%，2%，26%，31%，2%．結(jié)果見圖7．

注：a從左到右依次為水對照，LB對照，QN15，稀釋20倍QN15；b從左到右依次為水對照，LB對照，N12，稀釋20倍N12；c從左到右依次為水對照，LB對照，H16，稀釋20倍H16．

圖7　施加不同菌液后植株形態(tài)學(xué)指標(biāo)

注：-為稀釋后的菌液；不同字母表示差異水平，≤0.05．

3　結(jié)論與討論

研究表明，植物相關(guān)微生物群可以影響宿主植物的性狀，包括抗病、營養(yǎng)狀況、生長速率和耐受性[12-16]，因此分離和鑒定對寄主植物具有這種影響的有益微生物具有一定意義．本研究選取大豆作為研究對象，以生物固氮（BNF）為靶點，篩選可能對BNF相關(guān)基因有益的微生物，如氮固定標(biāo)志基因（NifH）和結(jié)瘤因子合成基因（NodA），以測定菌株結(jié)瘤固氮能力[17-18]；而磷的有效性和氮的有效性一樣，普遍受到限制，尤其是對豆科作物[19-20]．因此，鑒定能夠改善大豆磷吸收的微生物也是本研究的重要目的．同時，還測試了IAA的產(chǎn)生能力，IAA能夠調(diào)節(jié)植物的生長和發(fā)育[21]，而微生物IAA的產(chǎn)生與寄主植物的生長促進(jìn)有關(guān)[22]．

本文從10種不同基因型大豆（齊農(nóng)26、齊農(nóng)28、齊農(nóng)33、齊農(nóng)41、合豐50、合豐51、合豐55、黑河43、黑河45、農(nóng)慶29）根際土壤及根內(nèi)共篩選到224株細(xì)菌，進(jìn)一步篩選得到具有促生能力的菌株56株．其中14株具有結(jié)瘤能力，2株具有固氮能力，44株具解磷能力，43株具溶磷能力，24株具IAA產(chǎn)生能力．

雖然菌株促生能力得到證實，但并不代表在植物根系施用時能夠?qū)χ参锉旧砥鸬酱偕饔?，雖然植物根系會釋放信號因子，招募潛在的促生微生物，但在土壤和根際中，微生物群落的組成機(jī)制十分復(fù)雜，土著微生物的競爭能力較強，人為接種的促生菌存活率受到各種因素制約，能否成功定殖在植物根系具有不確定性．因此，選取綜合促生能力較強菌株進(jìn)行盆栽實驗，最終成功篩選3株能夠顯著提高植株的株高、莖粗、結(jié)莢數(shù)、根瘤數(shù)、地上部鮮質(zhì)量和干質(zhì)量的促生細(xì)菌（<0.05），同時發(fā)現(xiàn)同一菌株不同濃度的施加對植株形態(tài)學(xué)指標(biāo)的影響不顯著．

在對大豆植株取樣時發(fā)現(xiàn)，不同基因型大豆根系情況有很大差異，黑河43無論是植株生長情況或根系根瘤大小情況，整體較齊農(nóng)28長勢更好，因此后續(xù)菌株回接實驗選擇了黑河43品種．經(jīng)過前人的研究以及本研究的結(jié)論，推測可能的原因為黑河43品種的大豆在生長過程中招募有益微生物能力較強，可以吸引支持植物生長的微生物在大豆根部聚集，為植物生長提供促進(jìn)作用；而齊農(nóng)28品種在此方面的能力較弱，在取樣時期莖部及根系生長情況較差，成型根瘤較小，導(dǎo)致根系相關(guān)微生物豐富度顯著低于黑河43，因此篩選促生菌株時，植株基因型的選擇也極為重要．

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Isolation，screening of rhizosphere and root growth promoting bacteria from different genotypes of soybean

ZHAI Yujia1，CAI Ruonan1，CHEN Xitong1，LI Xinheng1，WANG Xin1，XUE Hong2，F(xiàn)U Xuepeng1

（1. School of Life Sciences，Agriculture and Forestry，Qiqihar University，Qiqihar 161006，China；2. Keshan Branch，Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences，Qiqihar 161006，China）

Screened 56 strains with growth promoting ability from the rhizosphere soil and roots of 10 different genotypes of soybeans（Qinong 26，Qinong 28，Qinong 33，Qinong 41，Hefeng 50，Hefeng 51，Hefeng 55，Heihe 43，Heihe 45，Nongqing 29）．Among them，14 strains had nodulation ability，2 strains had nitrogen fixation ability，44 strains had the ability to dissolve inorganic phosphorus，43 strains had the ability to dissolve organic phosphorus，and 24 strains had IAA production ability．It follows that，multiple strains have multiple growth promoting abilities at the same time．Three strains with better comprehensive growth promoting abilities，QN15，N12 and H16，were selected for pot experiment validation．The results showed that the application of the above bacterial stock solution and diluent significantly increased the plant height，stem diameter，nodule number，pod number，fresh and dry mass of the aboveground parts of the plant．Compared with the LB control group，applying QN15 stock solution，QN15 diluent，N12 stock solution，N12 diluent，H16 stock solution，H16 diluent respectively increased the aboveground biomass of plants by 18%，29%，2%，26%，31%，2%．These results will provide reference for the application of probiotics in agriculture．

soybeans；growth promoting bacteria；separation screening

1007-9831（2023）12-0074-09

Q93

A

10.3969/j.issn.1007-9831.2023.12.013

2023-07-12

黑龍江省屬本科高校基本科研業(yè)務(wù)費科研創(chuàng)新平臺項目（135509317）；2023年大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)項目（x202310232041）

翟羽佳（1999-），女，黑龍江五大連池人，在讀碩士研究生，從事微生物資源開發(fā)與利用研究．E-mail：1051233959@qq.com

付學(xué)鵬（1979-），男，山東臨沂人，副教授，博士，從事微生物資源開發(fā)與利用研究．E-mail：02383@qqhru.edu.cn