韋愛君，賀杜鵑，張梅奎△

（1陜西中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，陜西 咸陽 712046；2解放軍總醫(yī)院醫(yī)療保障中心遠(yuǎn)程醫(yī)學(xué)科，北京 100853）

同型半胱氨酸（homocysteine，Hcy）是一種蛋白質(zhì)含硫氨基酸，代謝涉及再甲基化途徑和轉(zhuǎn)硫途徑［1］。Hcy 在生理狀態(tài)下呈低水平，過高則會(huì)出現(xiàn)一些病理性變化。諸多研究表明，Hcy被認(rèn)為是動(dòng)脈粥樣硬化、血管內(nèi)皮障礙、心血管疾病、外周血管炎癥發(fā)病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。近年來，同型半胱氨酸被報(bào)道作為一種神經(jīng)毒性氨基酸，參與阿爾茨海默病、癡呆等神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生發(fā)展［2］。有研究發(fā)現(xiàn)，Hcy 通過增加氧化應(yīng)激反應(yīng)和升高NO 水平來增加神經(jīng)變性及神經(jīng)毒性［3］。本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)，Hcy 參與慢性應(yīng)激誘導(dǎo)的腦神經(jīng)源性生長因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）減少和相關(guān)認(rèn)知功能障礙［4］。也有研究表明，Hcy 誘導(dǎo)缺血性腦卒中的小膠質(zhì)細(xì)胞激活并誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)［5］。小膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的常駐免疫細(xì)胞，當(dāng)機(jī)體受到高強(qiáng)度或持續(xù)性應(yīng)激損傷時(shí)，小膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)生M1型極化，釋放神經(jīng)毒性物質(zhì)及促炎因子，誘導(dǎo)神經(jīng)炎癥的發(fā)生［6］。小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)在神經(jīng)退行性疾病的發(fā)展進(jìn)程中起著重要的作用［7］。同型半胱氨酸對(duì)于小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)研究仍缺乏機(jī)制探索。

Rap1a 是Ras 家族相關(guān)蛋白（Ras-related protein，Rap）中的一種，是一種小GTP 酶［8］，這些蛋白質(zhì)的活性形式以瞬時(shí)GTP 結(jié)合狀態(tài)存在，介導(dǎo)信號(hào)傳導(dǎo)［9］。Rap1a 廣泛分布于各種組織細(xì)胞中，與細(xì)胞的增殖、極性的形成、分化、黏附、血管重塑等多種生物學(xué)功能密切相關(guān)［10］。最早關(guān)于Rap1a 的研究表明，Rap1a可能為癌基因，參與腫瘤發(fā)生的進(jìn)展。例如，最早就有文獻(xiàn)報(bào)道，Rap1a 表達(dá)參與miR-337-3p 介導(dǎo)的宮頸癌細(xì)胞的遷移、侵襲及凋亡［11］。此外，Rap1a 介導(dǎo)的整合素途徑在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖中激活G 蛋白偶聯(lián)受體，這就提示Rap1a 在體內(nèi)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤腫瘤生長中起著關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用［12］。近年來，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)Rap1a 可通過多種信號(hào)通路調(diào)節(jié)機(jī)體免疫炎癥反應(yīng)，其中有研究結(jié)果顯示，Rap1a 可激活心臟成纖維細(xì)胞下游AGE/RAGE 信號(hào)通路，誘導(dǎo)炎癥介質(zhì)磷酸化的NF-κB 表達(dá)增加，并促進(jìn)可能的氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)，這就表明Rap1a 參與調(diào)控炎癥反應(yīng)［13］。也有研究結(jié)果表明，長鏈非編碼RNA TGFB3-AS1 通過Rap1a/Wnt 信號(hào)通路促進(jìn)Hcy 誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞炎癥，這就表明Rap1a/Wnt 信號(hào)通路在炎癥調(diào)節(jié)方面起著重要的作用［14］。另外，也有研究發(fā)現(xiàn)，Rap1a 過表達(dá)促進(jìn)了miR-340-5p 誘導(dǎo)的COX2、IL-1β、IL-6、TNF-α 等炎癥因子的表達(dá)水平，Rap1a通過增加炎癥反應(yīng)，加重慢性縮窄性大鼠的神經(jīng)性疼痛［15］。目前雖然有大量研究表明Rap1a 參與介導(dǎo)多種細(xì)胞的炎癥反應(yīng)。但是Rap1a 在神經(jīng)系統(tǒng)炎癥調(diào)節(jié)方面報(bào)道仍然較少，因此，我們的研究旨在探索Rap1a在Hcy誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥反應(yīng)中的作用。

本研究以小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞系BV2 細(xì)胞為研究對(duì)象，探討Rap1a在Hcy誘導(dǎo)的BV2細(xì)胞炎癥反應(yīng)中的作用機(jī)制，為Hcy 介導(dǎo)的神經(jīng)炎癥性疾病的預(yù)防和治療提供新的依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 材料與試劑

小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞系BV2 細(xì)胞購于武漢普諾賽公司；Hcy 為Sigma 產(chǎn)品；高糖培養(yǎng)液購自Gibco；青霉素和鏈霉素購自Solarbio；BCA 法蛋白定量試劑盒購自天根生化科技有限公司；慢病毒由武漢樞密公司負(fù)責(zé)構(gòu)建；Rap1a Ⅰ抗購于Cell Signaling Technology；β-actin Ⅰ抗購于Proteintech Group；辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG 購自中杉金橋公司；Trizol 試劑和逆轉(zhuǎn)錄cDNA 試劑盒購于Themo Fisher；實(shí)時(shí)熒光定 量TB Green?Premix Ex TaqTMⅡ（Tli RNase H Plus）的試劑盒購于TaKaRa；PAGE 凝膠購于Meilunbio；小鼠ELISA 檢測試劑盒購自Abclonal；本實(shí)驗(yàn)所用引物由擎科生物有限公司合成。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) BV2 細(xì)胞（腦組織來源的小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞）購自武漢普諾賽；培養(yǎng)液為含有10%胎牛血清、100 U/mL 青霉素和100 U/mL 鏈霉素的高糖培養(yǎng)液，于37 ℃、5% CO2和飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2.2 細(xì)胞傳代 鏡下觀察細(xì)胞密度達(dá)到80%即可進(jìn)行細(xì)胞傳代。用含終濃度50、100 和150 μmol/L Hcy的培養(yǎng)液干預(yù)細(xì)胞24 h，建立高同型半胱氨酸血癥（hyperhomocysteinemia，HHcy）細(xì)胞模型，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.3 細(xì)胞分組及Rap1a 過表達(dá)和干擾慢病毒轉(zhuǎn)染將培養(yǎng)的處于對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞種于6 孔板，用終濃度為50、100 和150 μmol/L 的Hcy 干預(yù)BV2 細(xì)胞24 h 后，篩選最佳Hcy 干預(yù)濃度；正常對(duì)照組僅加入等體積的完全培養(yǎng)液；依據(jù)病毒滴度通過預(yù)實(shí)驗(yàn)篩選出慢病毒的最佳感染復(fù)數(shù)（multiplicity of infection，MOI）為80，將過表達(dá)Rap1a 慢病毒（Rap1aoverexpressing lentivirus，oeRap1a）、Rap1ashRNA（shRap1a）及二者對(duì)應(yīng)的無序序列oeRap1a-scramble（oeRap1a-sc）、shRap1a-scramble（shRap1a-sc）分別轉(zhuǎn)染至小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞系BV2 細(xì)胞后用100 μmol/L Hcy 處理，6 h 后換正常培養(yǎng)液。過表達(dá)慢病毒Rap1a實(shí)驗(yàn)分組為：oeRap1a-sc組、oeRap1a組、Hcy組和Hcy+oeRap1a 組；敲減慢病毒Rap1a 實(shí)驗(yàn)分組為：shRap1a-sc 組、shRap1a 組、Hcy 組 和Hcy+shRap1a組。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.4 RT-qPCR 檢測mRNA 表達(dá) 細(xì)胞培養(yǎng)24 h 后，收集細(xì)胞，用Trizol 法提取細(xì)胞RNA，用微量分光光度計(jì)測定樣本RNA 純度及濃度，根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑配制體系說明書將RNA 反轉(zhuǎn)為cDNA 備用。實(shí)驗(yàn)檢測用引物序列詳見表1，RT-qPCR 反應(yīng)體系根據(jù)SYBR Green 說明書進(jìn)行配制，以cDNA 為模板擴(kuò)增各目的基因，計(jì)算各目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

表1 引物序列Table 1. Primer sequences

2.5 ELISA 法檢測炎癥因子IL-6、IL-1β 和TNF-α 濃度 收集細(xì)胞，具體按照ELISA 試劑盒說明書進(jìn)行操作，首先準(zhǔn)備配制好標(biāo)準(zhǔn)品和洗滌液，將包被IL-6、IL-1β、TNF-α 抗體的96 孔板洗滌3 次，前2 列每孔依次加入100 μL 配制好的標(biāo)準(zhǔn)品，在其他孔中加入100 μL待測樣品，37 ℃孵育2 h，棄去原有液體，洗板3 次，每孔加入100 μL 生物素化抗體工作液，37 ℃孵育1 h，重復(fù)上述洗滌步驟，每孔加入100 μL 鏈霉親和素-HRP工作液，37℃孵育30 min，再次重復(fù)上述洗滌步驟，加入100 μL 底物溶液，37 ℃避光孵育15～20 min，加入50 μL終止液，5 min內(nèi)檢測450 nm 波長的A值樣品的含量可根據(jù)其A值由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出相應(yīng)的濃度。本實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.6 Western blot 檢測Rap1a 蛋白的表達(dá) 細(xì)胞培養(yǎng)24 h 后提取細(xì)胞總蛋白，BCA 法檢測樣品中的蛋白濃度，制備25 μg 蛋白上樣品，進(jìn)行SDS-PAGE，再將帶有蛋白的PVGE 凝膠轉(zhuǎn)移至PVDF 膜，用5%脫脂奶粉封閉2 h，TBST 洗膜3 次，每次5 min，配制I 抗（Rap1a 抗體、β-actin 抗體，均按1∶1 000 稀釋），4 ℃孵育過夜，12～16 h 后回收Ⅰ抗，TBST 洗膜3 次，每次5 min，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔Ⅱ抗（1∶5 000），室溫孵育2 h，TBST 洗膜3 次，加入ECL超敏發(fā)光液，顯影拍照，以β-actin 為內(nèi)參照，Image Lab軟件進(jìn)行定量分析。本實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用GraphPad Prism 9.4.1 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示。首先評(píng)估數(shù)據(jù)是否為正態(tài)分布，再進(jìn)行正態(tài)分布數(shù)據(jù)的方差齊性檢驗(yàn)，方差齊的兩組數(shù)據(jù)采用t檢驗(yàn)，多組數(shù)據(jù)采用單因素方差分析（one-way ANOVA）。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 Hcy對(duì)BV2細(xì)胞M1型極化的影響

小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞系BV2 細(xì)胞經(jīng)50、100、150 μmol/L 等不同濃度Hcy 干預(yù)24 h 后，RT-qPCR 結(jié)果顯示，Hcy濃度為100 μmol/L 以上時(shí)，小膠質(zhì)細(xì)胞M1型極化標(biāo)志物CD80、CD86 mRNA 表達(dá)水平均高于對(duì)照組（P＜0.05），見圖1。

Figure 1. Effect of Hcy on M1 polarization markers in BV2 cells. The mRNA level of CD80 and CD86 in microglia were detected.Mean±SD. n=4. **P＜0.05 vs control group.圖1 Hcy對(duì)BV2細(xì)胞M1型極化標(biāo)志物表達(dá)的影響

2 Hcy對(duì)BV2細(xì)胞釋放部分炎癥因子的影響

Hcy 濃度為100 μmol/L 以上可誘導(dǎo)BV2 細(xì)胞發(fā)生M1型極化，接下來用RT-qPCR 法及ELISA 法檢測部分炎癥因子的mRNA 及含量變化，結(jié)果顯示，100 μmol/L 以上濃度Hcy 干預(yù)BV2 細(xì)胞，部分炎癥因子IL-6、IL-1β、TNF-α mRNA 水平及細(xì)胞勻漿中蛋白水平均顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），見圖2。

Figure 2. Effect of Hcy on the mRNA （A） and protein （B） expression of IL-6，IL-1β and TNF-α in BV2 cells. Mean±SD. n=4. *P＜0.05，**P＜0.01 vs control group.圖2 Hcy對(duì)BV2細(xì)胞部分炎癥因子水平的影響

3 Hcy對(duì)BV2細(xì)胞Rap1a水平的影響

RT-qPCR 和Western blot 結(jié)果提示，100 μmol/L以上濃度Hcy 干預(yù)BV2 細(xì)胞后，Rap1a 的mRNA 表達(dá)和蛋白表達(dá)水平均顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），見圖3。這個(gè)結(jié)果提示，Hcy 能夠促進(jìn)BV2 細(xì)胞中Rap1a的表達(dá)。接下來我們將Rap1a mRNA 表達(dá)水平與BV2 細(xì)胞M1 型極化標(biāo)志物CD80 mRNA 表達(dá)水平及炎癥因子IL-1β、TNF-α 含量作相關(guān)性分析，結(jié)果提示，CD80 mRNA 表達(dá)水平及炎癥因子的含量均與Rap1a 的mRNA 表達(dá)水平存在顯著正相關(guān)：R2分別為0.9153、0.8881和0.3528（P＜0.05）。

Figure 3. Effect of Hcy on mRNA （A） and protein （B） expression of Rap1a. Mean±SD. n=3. *P＜0.05 vs control group.圖3 Hcy對(duì)Rap1a mRMA及蛋白表達(dá)的影響

4 過表達(dá)Rap1a 可促進(jìn)Hcy 誘導(dǎo)的BV2 細(xì)胞炎性極化

為了探索Rap1a 在Hcy 誘導(dǎo)BV2 細(xì)胞炎性極化中的作用，將BV2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染oeRap1a 慢病毒，熒光顯微鏡觀察病毒感染效率達(dá)80%以上為有效（圖4A）；RT-qPCR 及Western blot 驗(yàn)證BV2 細(xì)胞中轉(zhuǎn)染oeRap1a 后Rap1a 的mRNA 及蛋白表達(dá)水平均顯著升高（P＜0.05），見圖4B。

Figure 4. Effect of overexpression of Rap1a on Hcy-induced inflammatory polarization in BV2 cells. A： fluorescence images of BV2 cells transfected with Rap1a overexpression virus； B： the mRNA and protein expression levels of Rap1a in BV2 cells after Rap1a overexpression； C： the mRNA expression levels of M1 polarization marker and inflammatory cytokines IL-6，IL-1β and TNF-α in BV2 cells after overexpression of Rap1a； D： the secretion levels of inflammatory cytokines IL-6，IL-1β and TNF-α in BV2 cells after overexpression of Rap1a. Mean±SD. n=3. *P＜0.05，**P＜0.01 vs oeRap1a-sc group； #P＜0.05，##P＜0.01 vs Hcy group.圖4 過表達(dá)Rap1a對(duì)Hcy誘導(dǎo)的BV2細(xì)胞炎性極化的影響

在BV2細(xì)胞轉(zhuǎn)染oeRap1a慢病毒后，RT-qPCR結(jié)果顯示，oeRap1a 組細(xì)胞M1 型極化標(biāo)志物及部分炎癥 因 子IL-6、IL-1β、TNF-α mRNA 表達(dá)水平與oeRap1a-sc 組相比顯著升高（P＜0.05）（圖4C）；ELISA 結(jié)果顯示，oeRap1a 組細(xì)胞炎癥因子分泌水平較oeRap1a-sc組顯著升高（P＜0.05）（圖4D）。

5 敲減Rap1a 可改善Hcy 誘導(dǎo)的BV2 細(xì)胞炎性極化

為進(jìn)一步研究Hcy 是否通過Rap1a 調(diào)控BV2 細(xì)胞的炎性極化，在BV2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染shRap1a 慢病毒，熒光顯微鏡觀察病毒轉(zhuǎn)染效率達(dá)80%以上為有效（圖5A）；RT-qPCR 及Western blot 檢測轉(zhuǎn)染shRap1a 的BV2 細(xì)胞中Rap1a的mRNA 及蛋白表達(dá)水平均顯著降低（P＜0.01）（圖5B）。

Figure 5. Effect of Rap1a knockdown on Hcy-induced inflammatory polarization of BV2 cells. A： fluorescence images of BV2 cells transfected with Rap1a knockdown virus； B： the mRNA and protein expression levels of Rap1a in BV2 cells after Rap1a knockdown； C： the mRNA expression levels of M1 polarization marker and inflammatory factors IL-6，IL-1β and TNF-α in BV2 cells after Rap1a knockdown； D： the secretion levels of inflammatory cytokines IL-6，IL-1β and TNF-α in BV2 cells after Rap1a knockdown. Mean±SD. n=3. **P＜0.05，**P＜0.01 vs shRap1a-sc group； #P＜0.05，##P＜0.01 vs Hcy group.圖5 敲減Rap1a對(duì)Hcy誘導(dǎo)的BV2細(xì)胞炎性極化的影響

在BV2細(xì)胞轉(zhuǎn)染shRap1a慢病毒后，RT-qPCR結(jié)果顯示，Hcy+shRap1a組細(xì)胞M1型極化標(biāo)志物CD80和CD86 及部分炎癥因子IL-6、IL-1β、TNF-α mRNA表達(dá)水平與Hcy 組相比顯著下降（P＜0.05），見圖5C；ELISA 結(jié)果顯示，Hcy+shRap1a 組細(xì)胞炎癥因子分泌水平與Hcy 組相比顯著下降（P＜0.05），見圖5D。該結(jié)果提示敲減Rap1a可減弱Hcy 誘導(dǎo)的BV2細(xì)胞炎性極化，這就說明Rap1a參與調(diào)控Hcy誘導(dǎo)的BV2細(xì)胞M1型極化及炎癥反應(yīng)。

討 論

Hcy 是蛋氨酸轉(zhuǎn)化為半胱氨酸過程中形成的中間氨基酸［16］。通過轉(zhuǎn)甲基產(chǎn)生，并通過再甲基化或轉(zhuǎn)硫途徑代謝［17］。血漿Hcy 水平升高涉及多種病理過程，其中介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)是重要的致病機(jī)制［18］。多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，高同型半胱氨酸作為動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，通過誘發(fā)氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)加重動(dòng)脈損傷［19］。其中，有研究報(bào)道，HHcy 通過激活NOX-ROS-NLRP3炎癥小體途徑，進(jìn)一步加速動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)程［20］。炎癥與多種疾病的病理過程相關(guān)，毫無疑問，Hcy 與外周血管內(nèi)皮、心肌細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等多種細(xì)胞的炎癥有著密切的聯(lián)系，其中的機(jī)制研究也不在少數(shù)。然而，目前Hcy 與神經(jīng)炎癥方面的研究也有報(bào)道，例如有研究發(fā)現(xiàn)，高同型半胱氨酸血癥小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞處于活化狀態(tài)，并且釋放大量促炎因子，介導(dǎo)神經(jīng)炎癥的發(fā)生［21］。眾所周知，小膠質(zhì)細(xì)胞在神經(jīng)損傷的急性期或亞急性期，其自身通過吞噬作用發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用［22］。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，許多神經(jīng)退行性疾病都與大腦的慢性炎癥有關(guān)，小膠質(zhì)細(xì)胞作為大腦的免疫細(xì)胞，介導(dǎo)神經(jīng)炎癥的發(fā)生［23］。近年來，神經(jīng)炎癥性疾病困擾著越來越多的人類，并且臨床治療存在局限性，因此，我們研究HHcy 對(duì)于神經(jīng)炎癥性疾病的發(fā)生發(fā)展具有一定的臨床價(jià)值。

本研究是以小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞系BV2 細(xì)胞為研究對(duì)象，外源性給予Hcy干預(yù)BV2細(xì)胞24 h，構(gòu)造HHcy模型，結(jié)果顯示100 μmol/L以上濃度Hcy刺激下BV2細(xì)胞M1 型極化標(biāo)志物及部分炎癥因子IL-6、IL-1β、TNF-α mRNA 表達(dá)水平及含量顯著升高，我們的結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道一致［24］。目前為止，Hcy與神經(jīng)炎癥方面有部分報(bào)道，但是其中的機(jī)制探索仍不完善。

為了探索Hcy 誘導(dǎo)BV2 細(xì)胞炎性極化的相關(guān)機(jī)制，我們發(fā)現(xiàn)Rap1a 作為一種小分子G 蛋白，屬于Ras家族的亞群之一Rap1，Rap1包括Rap1a和Rap1b兩個(gè)亞型，且兩者具有高度相似的同源性［25］。Rap1a充當(dāng)分子開關(guān)，將細(xì)胞外信號(hào)連接到細(xì)胞內(nèi)反應(yīng)，在各種細(xì)胞活動(dòng)中起著至關(guān)重要的作用［26］。Gao 等［27］研究發(fā)現(xiàn)，Hcy 可以促進(jìn)肝細(xì)胞中Rap1a 高表達(dá)，且miR-488-3p 可通過靶向Rap1a 促進(jìn)Hcy 介導(dǎo)的肝細(xì)胞自噬，表明Rap1a與Hcy在肝細(xì)胞上有響應(yīng)。近年許多學(xué)者旨在探索Rap1a 在各類細(xì)胞及組織中的炎癥反應(yīng)，然而，不同細(xì)胞類型中Rap1a 發(fā)揮著不同的功能。我們的研究結(jié)果中Hcy 促進(jìn)BV2 細(xì)胞中Rap1a 顯著升高，與文獻(xiàn)報(bào)道Hcy 促進(jìn)巨噬細(xì)胞Rap1a 表達(dá)升高結(jié)果相一致［28-29］。但也有文獻(xiàn)描述了一種新機(jī)制，Rap1 缺失導(dǎo)致細(xì)胞因子受體信號(hào)傳導(dǎo)和促炎機(jī)制NF-κB 激活來誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞的炎癥反應(yīng)［30］。這與我們的研究結(jié)果不完全一致，當(dāng)然，不同細(xì)胞類型中Rap1功能也不相同，加之雖然Rap1兩種亞型高度相似，但兩種亞型對(duì)不同細(xì)胞的調(diào)節(jié)功能也不完全相同。所以后續(xù)值得對(duì)Rap1 進(jìn)行進(jìn)一步探索。

為了明確Rap1a 是否參與調(diào)控Hcy 誘導(dǎo)的BV2細(xì)胞炎性極化，我們用過表達(dá)及敲減Rap1a慢病毒轉(zhuǎn)染BV2 細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)Rap1a 可以使BV2 細(xì)胞M1 型極化標(biāo)志物水平升高及部分炎癥因子表達(dá)顯著升高，與Hcy 干預(yù)BV2 細(xì)胞產(chǎn)生同樣的炎癥反應(yīng)，在一定程度上還可加劇這種炎癥反應(yīng)。反之，在Hcy 干預(yù)BV2 細(xì)胞的條件下，敲減Rap1a可明顯減輕這種炎癥反應(yīng)。這就表明Rap1a 參與調(diào)控Hcy誘導(dǎo)的小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞炎性極化。

綜上所述，我們的研究結(jié)果提示，以Rap1a 為靶點(diǎn)可調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，這就為臨床上Hcy 相關(guān)神經(jīng)炎癥性疾病的預(yù)防及治療提供新的理論依據(jù)。