李媛媛，趙富生，張可心，陳永蘭，張 娜，姜昕悅，谷春付，武 庚

（牡丹江醫(yī)學院，黑龍江 牡丹江 157000）

糖尿?。╠iabetes mellitus，DM）是一種常見多發(fā)的慢性代謝性疾病，據(jù)糖尿病聯(lián)合會發(fā)布的報告顯示，2021 年全球20～79 歲人群DM 患病率為10.5%，到2045 年將上升至12.2%［1］。糖尿病皮膚潰瘍（diabetic cutaneous ulcer，DCU）是DM 患者常見的并發(fā)癥之一，致殘率高且治療昂貴，嚴重影響DM 患者的生活質量。目前，DCU 治療方法主要包括控制血糖、抗感染和清創(chuàng)治療等，但效果并不理想，因此迫切需要探索新的治療策略［2］。DM 皮膚創(chuàng)面難以愈合的病理機制主要包括創(chuàng)面局部生長因子分泌減少、氧化應激、血管受損、慢性炎癥反應等［3］。研究表明，在創(chuàng)傷愈合過程中，適度自噬具有維持局部組織內環(huán)境穩(wěn)定，減輕氧化應激和炎癥反應，促進血管生成和組織重建等作用［4］。DM 創(chuàng)傷后產(chǎn)生的大量活性氧可導致創(chuàng)面組織自噬失調，加劇局部組織炎癥反應，進而影響創(chuàng)面愈合［5］。因此，調節(jié)DM 創(chuàng)面組織的自噬活性，可能是一種有效的治療策略。

硫化氫（hydrogen sulfide，H2S）被認為是繼一氧化氮和一氧化碳之后的第三種氣體信號分子。機體內H2S 主要由胱硫醚γ-裂解酶（cystathionine γ-lyase，CSE）、胱硫醚β-合成酶和3-巰基丙酮酸硫轉移酶三種酶催化合成［6］。H2S 具有抗炎癥、抗凋亡、抗氧化應激、調控自噬以及舒張血管等多種生理功能［7-9］。然而，H2S 是否可以調控自噬，促進DM 皮膚創(chuàng)面血管形成和愈合，目前尚不清楚。本研究通過建立DM大鼠皮膚損傷模型，觀察H2S 對DM 大鼠皮膚創(chuàng)面愈合的影響，并探究其可能機制。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1 實驗動物 SPF 級雄性SD 大鼠36 只，8 周齡，體質量（250±10） g，購自遼寧長生生物技術股份有限公司，許可證號為SCXK（遼）2020-0001。大鼠飼養(yǎng)于牡丹江醫(yī)學院實驗動物中心，環(huán)境溫度22～24 ℃，通風良好。實驗過程符合國家及單位實驗動物管理和使用規(guī)定。

1.2 主要試劑及儀器 鏈脲佐菌素（streptozocin，STZ；北京索萊寶科技有限公司）；H2S 熒光探針C-7Az（7-azido-4-methylcoumarin）、硫氫化鈉（sodium hydrosulfide，NaHS； Sigma-Aldrich）；CSE、CD31、微管相關蛋白1 輕鏈3（microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3）、caspase-3、Bcl-2 和Bax 抗體（武漢三鷹生物技術有限公司）；beclin-1、P62、磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）、蛋白激酶B（protein kinase B，PKB/Akt）、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）、p-PI3K、p-Akt 和p-mTOR 抗體，碘化丙啶（propidium iodide，PI），以及TUNEL染色液（碧云天生物技術有限公司）。激光共聚焦顯微鏡（LSM700，Zeiss）。

2 方法

2.1 糖尿病大鼠皮膚創(chuàng)傷模型的建立及分組 DM大鼠模型制備前禁食18 h（不禁水），腹腔注射1% STZ（50 mg/kg）誘導DM，72 h 后尾靜脈采血檢測大鼠血糖，血糖≥16.67 mmol/L表示DM模型制備成功。飼養(yǎng)三周后，制備皮膚創(chuàng)傷模型［10］。具體操作如下：大鼠腹腔注射1.5%戊巴比妥鈉（30 mg/kg），清除大鼠背部毛發(fā)，常規(guī)消毒，剪切直徑為2 cm 全層皮膚，深至筋膜。將DM 皮膚創(chuàng)傷大鼠隨機分為DM 組和DM+NaHS 組，未注射STZ 大鼠為正常對照（control）組，每組12只。DM+NaHS組大鼠于創(chuàng)面建立當日腹腔注射NaHS（56 μmol/kg），每天1 次，連續(xù)注射21 d［11］。DM組和control組大鼠每日腹腔注射等體積生理鹽水。

2.2 標本采集 創(chuàng)面建立第21 天，每組隨機選取6只大鼠乙醚麻醉斷頸處死，取創(chuàng)面皮膚組織，一半制備石蠟切片用于HE染色，另一半制備冰凍切片行免疫熒光染色；各組剩余6 只大鼠，取創(chuàng)面組織于-80 ℃冰箱保存，用于Western blot 分析。實驗動物處理流程見圖1。

2.3 創(chuàng)面愈合率分析 手術第0、7、14、21 天采集創(chuàng)面圖像，用ImageJ 軟件分析創(chuàng)面面積，計算創(chuàng)面愈合率。創(chuàng)面愈合率（%）=（原始創(chuàng)面面積-未愈合創(chuàng)面面積）/原始創(chuàng)面面積×100%。

2.4 創(chuàng)面組織H2S含量檢測 取冰凍切片，復溫、固定后，加C-7Az 工作液（1∶100），激光共聚焦顯微鏡采集圖像，用ImageJ 軟件分析熒光強度。取皮膚創(chuàng)面組織裂解、勻漿、離心，BCA 法測定蛋白濃度。SDS-PAGE 分離蛋白，轉膜、封閉后，加入CSE 抗體（1∶1 000），4 ℃孵育過夜，次日加入相應Ⅱ抗，37 ℃孵育2 h，加ECL 發(fā)光試劑，置成像儀中成像。采用ImageJ軟件分析目的蛋白條帶相對灰度值。

2.5 HE 染色 取石蠟切片（5 μm），二甲苯脫蠟、水化、蘇木精-伊紅染色，常規(guī)脫水、中性樹脂封片，光鏡下觀察組織形態(tài)結構及血管分布，通過ImageJ 軟件分析創(chuàng)面愈合情況。

2.6 創(chuàng)面組織血管生成檢測 （1）取冰凍切片固定、封閉，加CD31 抗體（1∶200），4 ℃孵育過夜，次日加Cy3標記的Ⅱ抗，DAPI染色細胞核，激光共聚焦顯微鏡采集圖像，ImageJ 軟件分析CD31 熒光強度。（2）蛋白分離、轉膜后，加CD31 抗體（1∶1 000）和β-actin抗體（1∶2 000），4 ℃孵育過夜，次日加相應Ⅱ抗，顯影成像，用ImageJ軟件分析CD31條帶相對灰度值。

2.7 創(chuàng)面組織血管內皮細胞自噬檢測 （1）取冰凍切片，加入CD31和beclin-1抗體（1∶100），4 ℃孵育過夜，次日加FITC 和Cy3 標記的Ⅱ抗，DAPI 染細胞核。采用ImageJ 軟件分析CD31+/beclin-1+細胞數(shù)。（2）蛋白分離、轉膜后，加入LC3抗體（1∶500）、P62抗體（1∶1 000）、beclin-1 抗體（1∶1 000）和β-actin 抗體（1∶2 000），4 ℃孵育過夜，次日加入相應Ⅱ抗，顯影成像。用ImageJ軟件分析目的蛋白條帶相對灰度值。

2.8 創(chuàng)面組織血管內皮細胞凋亡檢測 （1）取冰凍切片固定，加入CD31 抗體（1∶200）、TUNEL 染色液、caspase-3 抗體（1∶200）和PI 染色液（50 mg/L），4 ℃孵育過夜，次日加入相應Ⅱ抗，DAPI 染細胞核。激光共聚焦顯微鏡采集圖像，用ImageJ 軟件分析CD31+/TUNEL+細胞數(shù)。（2）蛋白分離、轉膜后，加入Bcl-2 抗體（1∶1 000）、Bax 抗體（1∶1 000）和β-actin 抗體（1∶2 000），4 ℃孵育過夜，次日加入相應Ⅱ抗，37 ℃孵育2 h，顯影成像，ImageJ軟件分析目的蛋白相對灰度值。

2.9 創(chuàng)面組織PI3K/Akt/mTOR通路蛋白表達檢測蛋白分離、轉膜后，加入Ⅰ抗（PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、mTOR 和p-mTOR 抗體，1∶1 000；β-actin抗體，1∶2 000），4 ℃孵育過夜，顯影成像，ImageJ 軟件分析目的蛋白相對灰度值。

3 統(tǒng)計學處理

應用SPSS 18.0 軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料以均數(shù)±標準差（mean±SD）表示，創(chuàng)面愈合實驗采用多因素方差分析重復測量。其余實驗采用單因素方差分析，方差齊用LSD 法，方差不齊用Dunnett's T3檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 NaHS對皮膚創(chuàng)面愈合的影響

手術第0、7、14、21 天，各組大鼠創(chuàng)面愈合情況如圖2 所示。DM+NaHS 組創(chuàng)面愈合率在術后第7、14、21 天顯著高于DM 組（P＜0.05），但低于control 組愈合水平（P＜0.05）。

Figure 2. The skin wound healing of rats at different time points in each group. Mean±SD. n=12. *P＜0.05 vs control group； #P＜0.05 vs DM group.圖2 不同時間點各組大鼠皮膚創(chuàng)面愈合情況

2 NaHS對皮膚創(chuàng)面組織H2S含量的影響

C-7Az 熒光染色及分析如圖3A～3B 所示，與control 組相比，DM 組C-7Az 熒光強度顯著降低（P＜0.01）；與DM 組相比，DM+NaHS 組C-7Az 熒光強度顯著升高（P＜0.01），但未恢復到control 組水平（P＜0.01）。CSE 蛋白表達如圖3C 所示，與control 組相比，DM 組CSE 表達水平顯著降低（P＜0.01）；與DM組相比，DM+NaHS 組CSE 表達顯著升高（P＜0.01），但仍低于control組水平（P＜0.01）。

3 NaHS對皮膚創(chuàng)面組織形態(tài)學的影響

HE 染色如圖4A 所示，control 組創(chuàng)面修復良好，可見肉痂、毛囊及較多毛細血管；DM 組創(chuàng)面表層薄，陳舊性肉芽組織多，毛細血管少；DM+NaHS 組創(chuàng)面表層較厚，可見新生肉芽組織、大量纖維成分及毛細血管。創(chuàng)面寬度分析如圖4B 所示，與DM 組相比，DM+NaHS 組表皮層創(chuàng)面寬度顯著減?。≒＜0.01），但仍寬于control組水平（P＜0.01）。

4 NaHS對皮膚創(chuàng)面組織血管生成的影響

如圖5A 所示，control 組血管數(shù)量多，分布均勻；DM 組血管管徑細且數(shù)量少，分布雜亂；DM+NaHS 組血管數(shù)量較多。CD31 免疫熒光染色結果顯示，與control 組相比，DM 組CD31 熒光強度顯著降低（P＜0.01）；DM+NaHS 組CD31 熒光強度較DM 組顯著增加（P＜0.01），但仍低于control 組（P＜0.01），見圖5B、C。Western blot 結果顯示，與control 組相比，DM 組CD31 表達水平顯著降低（P＜0.01）；DM+NaHS 組CD31 表達水平較DM 組顯著升高（P＜0.01），但未恢復到control組水平（P＜0.05），見圖5D。

Figure 5. Angiogenesis of skin wound tissues of rats in each group. A： representative HE stained images of rat skin wound tissues in each group （scale bar=100 μm）； B： representative immunofluorescence staining images of CD31 in skin wound tissues of each group （red represents CD31，while blue represents nuclei stained with DAPI； scale bar=50 μm）； C： fluorescence intensity comparison of CD31 in rat skin wound tissues of each group； D： comparison of relative expression of CD31 in rat skin wound tissues of each group. Mean±SD. n=6. *P＜0.05，**P＜0.01 vs cntrol group； ##P＜0.01 vs DM group.圖5 各組大鼠皮膚創(chuàng)面組織血管生成比較

5 NaHS對皮膚創(chuàng)面組織血管內皮細胞自噬的影響

血管內皮細胞自噬檢測如圖6A、6B 所示，與control 組相比，DM 組CD31+/beclin-1+陽性細胞增多（P＜0.01）；經(jīng)NaHS 干預后，DM+NaHS 組CD31+/beclin-1+陽性細胞顯著減少（P＜0.01），但仍多于control組（P＜0.01）。

Figure 6. Comparison of endothelial autophagy in rat skin wound tissues of each group. Representative immunofluorescence staining images of CD31 and beclin-1 in rat skin wound tissues of each group （red and green represent beclin-1 and CD31，respectively，while blue represents nuclei stained with DAPI； scale bar=100 μm） and comparison of the number of CD31+/beclin-1+ cells. Mean±SD. n=6. **P＜0.01 vs control group； ##P＜0.01 vs DM group.圖6 各組大鼠皮膚創(chuàng)面組織血管內皮細胞自噬比較

Western blot 結果如圖7A～7D 所示，與control 組相比，DM 組P62 表達水平降低（P＜0.01），LC3-II/LC3-I和beclin-1表達顯著升高（P＜0.01）；經(jīng)NaHS干預后，DM+NaHS 組P62 表達升高（P＜0.01），LC3-II/LC3-I 和beclin-1 表達顯著降低（P＜0.01），但未恢復到control組水平（P＜0.05）。

Figure 7. Comparison of the expression of autophagy-related proteins in skin wound tissues of each group. Mean±SD. n=6. *P＜0.05，**P＜0.01 vs control group； ##P＜0.01 vs DM group.圖7 各組大鼠皮膚創(chuàng)面組織自噬相關蛋白表達比較

6 NaHS對皮膚創(chuàng)面組織血管內皮細胞凋亡的影響

血管內皮細胞凋亡檢測如圖8A、8B 所示，與Control 組相比，DM 組CD31+/TUNEL+陽性細胞增加（P＜0.01）；經(jīng)NaHS 干預后，DM+NaHS 組CD31+/TUNEL+陽性細胞顯著減少（P＜0.01），但仍高于control組水平（P＜0.01）。創(chuàng)面組織caspase-3 和PI 染色如圖8C～8F 所示，與control 組相比，DM 組caspase-3 和PI 熒光強度增加（P＜0.01）；經(jīng)NaHS 干預后，DM+NaHS 組caspase-3 和PI 熒光強度顯著降低（P＜0.01），但仍高于Control組水平（P＜0.01）。

7 NaHS對皮膚創(chuàng)面組織凋亡相關蛋白表達的影響

Western blot 結果如圖9A、9B 所示，與control 組相比，DM 組創(chuàng)面組織Bcl-2 表達降低（P＜0.01），Bax表達升高（P＜0.01）；經(jīng)NaHS 干預后，DM+NaHS 組Bcl-2表達升高（P＜0.01），Bax表達降低（P＜0.01），但未恢復到control組水平（P＜0.05）。

8 NaHS對PI3K/Akt/mTOR通路蛋白表達的影響

Western blot 結果如圖10A～10D 所示，與control組相比，DM 組p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR 比值均顯著降低（P＜0.01）；經(jīng)NaHS 干預后，DM+NaHS 組p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR比值均顯著升高（P＜0.01），但未恢復到control 組水平（P＜0.05）。

Figure 10. Comparison of the expression of PI3K/Akt/mTOR signaling pathway-related proteins in rat skin wound tissues of each group. Mean±SD. n=6. *P＜0.05，**P＜0.01 vs control group； ##P＜0.01 vs DM group.圖10 各組大鼠皮膚創(chuàng)面組織PI3K/Akt/mTOR信號通路相關蛋白表達的比較

討 論

DM 患者長期高血糖狀態(tài)會引起全身小動脈和終末微小血管硬化，造成組織缺血缺氧易誘發(fā)潰瘍創(chuàng)面形成。由于氧化應激、慢性炎癥、微小血管病變等原因，DM 患者皮膚創(chuàng)面難以治愈，嚴重會發(fā)生壞疽導致截肢甚至危及生命。目前，DM 患者皮膚潰瘍尚無有效的治療手段。一些新興的治療方法，如干細胞治療、新型合成生物材料、生長因子療法等均存在治療成本高、免疫原性等局限性。因此，亟需探索安全、有效的治療措施促進DM創(chuàng)面的愈合。

H2S 作為一種新型氣體信號分子，在抗炎、抗氧化和抗凋亡多個方面發(fā)揮調節(jié)作用［12］。研究顯示，H2S 能夠抑制炎癥反應和氧化應激，緩解1 型DM 小鼠的焦慮樣行為［13］，減輕高血糖引起的動脈粥樣硬化［14］。在哺乳動物，H2S主要由兩種5'吡哆醛磷酸依賴酶，即CSE 和胱硫醚β-合成酶催化合成［15］。本研究結果顯示，DM 大鼠皮膚創(chuàng)面組織H2S 含量和CSE蛋白水平均顯著降低，提示DM創(chuàng)面延遲愈合可能與H2S 合成受損有關?；贖2S 參與調節(jié)機體多種病理生理過程，我們推測，NaHS能夠增加DM 大鼠皮膚創(chuàng)傷組織H2S 含量，上調創(chuàng)面組織CSE 蛋白表達，改善或促進DM大鼠皮膚創(chuàng)面愈合。

自噬是一種依賴溶酶體的分解代謝過程，對維持機體內環(huán)境穩(wěn)態(tài)起著重要作用［16］。LC3、P62和beclin-1 蛋白是自噬形成過程中的關鍵蛋白。當自噬激活時，胞漿中LC3-I 被轉化為LC3-II，后者在溶酶體分解代謝轉化為LC3-I。P62作為一種自噬特異性底物，與LC3 相互作用進入自噬體內，被溶酶體降解。P62蛋白降低的同時伴隨LC3-II蛋白上調，提示自噬活性增加［17］。有研究報道，血管緊張素IV 通過抑制FoxO1 誘導的自噬，減輕DM 小鼠心肌損傷［18］。研究顯示，自噬在DM 創(chuàng)面愈合的炎癥期、增殖期和組織重建期發(fā)揮重要作用，自噬增強或抑制可導致細胞凋亡，不利于DM創(chuàng)傷的恢復［19］。本研究結果顯示，DM 大鼠皮膚創(chuàng)面組織內皮細胞自噬活性顯著增強，創(chuàng)面組織LC3-II/LC3-I 和beclin-1 表達增加，P62表達減少，提示DM大鼠皮膚創(chuàng)面組織內皮細胞自噬過度激活，給予外源性H2S能夠抑制創(chuàng)面組織內皮細胞的自噬活性，促進DM大鼠創(chuàng)面組織血管形成和創(chuàng)面愈合。

自噬和凋亡為調控細胞生物學功能的兩種基本分子機制，其信號分子通過各種關聯(lián)和干擾，影響多種疾病的病理生理過程，如冠心病等［20］。索拉非尼可通過髓樣細胞白血病1 激活beclin-1 誘導肝癌細胞自噬性死亡［21］。caspase-3 家族蛋白是細胞凋亡的重要效應因子，為細胞凋亡的執(zhí)行蛋白，其激活預示著凋亡進入不可逆轉階段［22］。Bax 是機體中重要的凋亡基因之一，具有促進細胞凋亡的作用。Bcl-2 是一種抗凋亡蛋白，可維持線粒體膜的完整性，阻止促凋亡蛋白釋放，發(fā)揮抗凋亡作用［23］。本研究結果顯示，DM 大鼠皮膚創(chuàng)面組織內皮細胞凋亡數(shù)量顯著增多，caspase-3 和Bax 表達增加，Bcl-2 表達減少，推測可能與自噬過度激活有關。然而，NaHS 能夠減輕DM 大鼠創(chuàng)面組織血管內皮細胞自噬和凋亡，發(fā)揮抗凋亡作用，促進皮膚創(chuàng)面的愈合。

PI3K/Akt/mTOR 是調控細胞自噬的信號通路，參與細胞增殖、分化和凋亡過程。本研究結果顯示，DM 大鼠皮膚創(chuàng)面組織PI3K/Akt/mTOR 信號通路蛋白表達顯著降低。由此推測，PI3K/Akt/mTOR 信號通路可能參與DM皮膚創(chuàng)面的愈合過程。研究表明，半胱氨酸通過激活Akt/PI3K/mTOR 通路減輕內質網(wǎng)應激和炎癥反應，改善高糖誘導的人脂肪基質干細胞代謝異常［24］。此外，有研究報道胰高血糖素樣肽1受體激動劑可激活PI3K/Akt/mTOR 信號通路減輕高糖誘導的髓核細胞損傷［25］。本研究結果顯示，NaHS干預能夠上調DM 大鼠皮膚創(chuàng)面組織PI3K/Akt/mTOR 通路蛋白表達，增加創(chuàng)面組織毛細血管密度，提高創(chuàng)面愈合率，促進DM大鼠皮膚創(chuàng)面愈合。由此推測，H2S 可能通過調節(jié)PI3K/Akt/mTOR 信號通路，減輕創(chuàng)面組織血管內皮細胞自噬及凋亡，發(fā)揮促進DM創(chuàng)傷愈合的作用。

綜上所述，H2S 能夠促進DM 大鼠皮膚創(chuàng)面愈合，其作用機制可能與激活PI3K/Akt/mTOR 信號通路，抑制血管內皮細胞自噬及凋亡，促進創(chuàng)面組織血管形成有關。本研究為DCU治療提供了新的實驗依據(jù)，但實驗結果均為體內研究，下一步將采用細胞模型進一步探討H2S可能激活的信號通路及分子機制。