魏焱鑫，魏 毓，劉新光，2，田燕歌，2，劉學芳，2，趙 迪，2，趙 鵬，2△

（1河南中醫(yī)藥大學呼吸疾病中醫(yī)藥防治省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心，河南省中醫(yī)藥防治呼吸病重點實驗室，河南 鄭州 450046；2河南中醫(yī)藥大學中醫(yī)藥科學院，河南 鄭州 450046）

慢性阻塞性肺疾?。╟hronic obstructive pulmonary disease，COPD）是一種可預防可治療的常見呼吸系統(tǒng)疾病，以持續(xù)呼吸道癥狀和氣流受限為特征［1］。吸煙等有害物質暴露是誘發(fā)、加重疾病進展的重要因素，可增加患者對于細菌和病毒的易感性［2］，導 致COPD 急 性 加 重（acute exacerbation of COPD，AECOPD）。AECOPD 以肺功能迅速下降、咳嗽咳痰增多、呼吸困難、生活質量惡化和死亡率顯著升高為特征［3-5］。氣道上皮細胞由閉鎖小帶蛋白1（zonula occludens-1，ZO-1）、閉 合 蛋 白（occludin，OCC）等緊密連接蛋白和上皮鈣黏素（E-cadherin，ECad）等黏附連接蛋白構成一個連續(xù)的屏障結構，能夠抵御空氣過敏原、污染物和病原體等有害物質入侵，及時啟動免疫應答清除有害物質［6］，維持氣道微環(huán)境穩(wěn)態(tài)［7-8］。研究發(fā)現(xiàn)COPD 患者支氣管上皮ZO-1、OCC和E-Cad表達降低，上皮屏障功能減弱［9-12］；香煙煙霧抑制小鼠支氣管上皮ZO-1 表達，損傷氣道上皮屏障，誘導COPD 發(fā)生及其急性加重［13］。因此，保護氣道上皮屏障是改善AECOPD的潛在途徑。

中醫(yī)藥治療AECOPD 具有一定優(yōu)勢，可明顯減輕患者癥狀。AECOPD 多以實證類為主，其中痰熱壅肺為常見證候，治法當以清肺化痰、降逆平喘為基本原則［14］。據(jù)此擬定的通塞顆粒（Tongsai granules，TSG）方藥具有清熱滌痰活血、宣肺降氣平喘、扶正虛、祛邪實之功效。TSG 可有效減輕AECOPD 患者癥狀，改善肺功能，提高動脈血氧含量，抑制炎癥反應［15-16］，但其作用機制有待進一步闡釋。本研究通過建立AECOPD 模型大鼠和香煙煙霧誘導氣道上皮細胞屏障損傷模型，探討TSG 保護氣道上皮屏障緩解AECOPD的作用及其機制。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1 動物 SD 大鼠24 只（雄性，6～8 周，200～240 g），購自北京維通利華實驗動物有限公司，許可證號SYXK（Yu） 2020-0004。本研究通過河南中醫(yī)藥大學實驗動物福利倫理審查委員會審查批準（倫理審查批號：DWLL202003210）。

1.2 細胞 人支氣管上皮細胞BEAS-2B 購于上海子實生物有限公司。

1.3 香煙與細菌 紅旗渠過濾嘴香煙（烤煙型，煙堿量1.0 mg，煙氣一氧化碳含量11 mg，焦油量10 mg）由河南中煙工業(yè)有限責任公司生產(chǎn)。肺炎克雷伯桿菌（Klebsiellapneumoniae，Kp；菌株編號：46117）由中國醫(yī)學細菌保藏管理中心提供。

1.4 藥物 TSG由葶藶子、地龍、浙貝母、酒大黃、蜜麻黃、赤芍、矮地茶、人參、麥冬和石菖蒲組成，以上藥材均購自瑞龍藥業(yè)有限公司。莫西沙星（moxifloxacin，MXF）購自德國拜耳醫(yī)藥公司；硫酸沙丁胺醇（salbutamol，STL）購自江蘇阿邦益生藥業(yè)有限公司。

1.5 試劑 DMEM 高糖培養(yǎng)基（Solarbio）；胎牛血清（Lonsera）；PBS 和10% SDS-PAGE 凝膠試劑盒（雅酶）。ZO-1、E-Cad、OCC、表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）和GAPDH 抗體，以及辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG Ⅱ抗（Proteintech）；細胞外信號調節(jié)激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）和 磷 酸 化ERK（phosphorylated ERK，p-ERK）抗體（Genetex）；磷酸化EGFR（phosphorylated EGFR，p-EGFR）抗體（Cell Signaling Technology）。

2 方法

2.1 動物模型建立與分組 將SD大鼠24只隨機分為control 組、model 組、TSG 組和MXF+STL 組。第1～8 周采用反復香煙煙霧（cigarette smoke，CS）暴露［（3 000±500）×10-6，每天2 次，每次30 min］聯(lián)合Kp感染（6×1011CFU/L，每只100 μL，每5 d 一次）復制COPD 大鼠模型［17］。第9 周第3 天，經(jīng)鼻滴入Kp（6×1017CFU/L，100 μL）建立AECOPD 大鼠模型。第9周第1～2 天和第4～7 天，control 組和model 組大鼠給予生理鹽水灌胃，TSG 組給予TSG（生藥8.01 g·kg-1·d-1，每天2 次）灌胃，MXF+STL 組給予MXF（36 mg·kg-1·d-1，每天1 次）和STL（1.08 mg·kg-1·d-1，每天1次）混合液灌胃［18］。藥物灌胃劑量采用等效劑量（D）系數(shù)換算公式計算：D大鼠=D人×HI大鼠/HI人×（W大鼠/W人）2/3（HI：體積系數(shù)；W：體重）。第10 周第1 天，以2%戊巴比妥鈉（40 mg/kg）腹腔注射麻醉大鼠，處死解剖后取左肺10%甲醛滴注15 min 后浸泡固定，取右肺組織檢測相應指標（圖1A）。

Figure 1. Flow chart of the animal experiments （A），and schematic diagram showing the preparation of the active ingredients of TSG（B）. CS： cigarette smoke； Kp： Klebsiella pneumoniae； TSG： Tongsai granules.圖1 動物實驗流程和TSG活性部位制備

2.2 細胞模型建立與分組 BEAS-2B 細胞使用含10%胎牛血清的DMEM 高糖培養(yǎng)液于37 ℃、5% CO2環(huán)境下培養(yǎng)，以每皿1.5×105個接種于35 mm 培養(yǎng)皿12 h，待細胞密度達80%更換為DMEM 高糖培養(yǎng)基饑餓3 h，給予TSG 活性部位TSG1～5（100 mg/L）及TSG2（20、50和100 mg/L）作用3 h后，加入10% CS提取物（CS extract，CSE）作用24 h［19］。

2.3 復方藥物及活性成分制備 TSG 采用水煎法和乙醇提取濃縮藥液，冷凍干燥后獲得濃縮藥粉，每克干粉相當于原生藥2.627 g，用于動物灌胃。將TSG 濃縮藥粉溶于甲醇中，與大孔樹脂混合，大孔樹脂加入層析柱，分別使用0%、10%、30%、60%和90%乙醇沖洗獲得活性部位TSG1～5（圖1B）。通過蒸餾濃縮和冷凍干燥后，將提取液濃縮粉溶解于DMSO，成為100 g/L濃縮液，以備細胞實驗用。

2.4 HE染色及免疫組化染色 HE染色觀察肺組織結構損傷，免疫組化染色檢測白細胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）、IL-6、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、基質金屬蛋白酶2（matrix metalloproteinase 2，MMP2）和MMP9 的表達。使用Case-Viewer軟件在×200視野下，每張肺組織切片隨機選取6個肺泡及氣道視野拍攝，通過Image-Pro Plus 6.0軟件計算綜合吸光度（integrated absorbance，IA）。

2.5 肺功能測定 第10周采用WBP 系統(tǒng)測定呼氣峰流速（peak expiratory flow，PEF）。

2.6 免疫熒光染色 肺組織切片脫蠟封閉30 min后，孵育ZO-1 和OCC 抗體于4 ℃過夜，PBS 洗滌后使用熒光Ⅱ抗于室溫孵育50 min，DAPI染色15 min后，封片在熒光顯微鏡下觀察。使用CaseViewer 軟件在×200 和×400 視野下，每張肺組織切片隨機選取6個氣道視野拍攝。

2.7 Western blot 制備肺組織勻漿及細胞裂解液上清，采用BCA 蛋白定量統(tǒng)一樣本濃度，通過電泳、轉膜和封閉后，孵育ZO-1、E-CA、OCC、p-EGFR、EGFR、p-ERK、ERK 和GAPDH 抗體于4℃過夜，1× TBST洗滌后室溫孵育Ⅱ抗1 h后顯影，檢測蛋白表達。

2.8 網(wǎng)絡藥理學分析 采用UPLC-Q/TOF-MS/MS分析TSG2 所含成分，通過Swiss Target 數(shù)據(jù)庫（http：//www. swisstargetprediction. ch/）和PharmMapper 數(shù)據(jù)庫（http：//lilab-ecust. cn/pharmmapper/index.html）篩選成分潛在靶點，Genecard（https：//www.genecards. org/）數(shù)據(jù)庫鑒定AECOPD 相關基因，STRING數(shù)據(jù)庫（https：//string-db. org/）考察蛋白質相互作用（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡及靶點相關KEGG通路，使用Cytoscape 3.9.1可視化結果數(shù)據(jù)。

3 統(tǒng)計學分析

通過SPSS 23.0 軟件進行統(tǒng)計學分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（mean±SD）表示。采用單因素方差分析，方差齊者采用LSD-t法，方差不齊者采用Dunnett's T3法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 TSG減輕AECOPD大鼠肺組織病變

肺組織HE染色結果（圖2A）顯示，control組大鼠肺組織未見明顯病理損傷；model組大鼠肺氣管壁增厚，周圍大量炎性細胞浸潤，肺泡壁部分斷裂融合，肺泡腔擴大并伴有炎性細胞浸潤；與model 組比較，TSG 組和MXF+STL 組以上病理損傷均有所減輕。與control 組比較，model 組大鼠支氣管壁厚度（bronchial wall thickness，BWT）和肺泡平均線性截距（mean linear intercept，MLI）顯著升高，平均肺泡數(shù)（mean alveolar number，MAN）顯著降低（P＜0.01）；與model 組比較，TSG 組和MXF+STL 組BWT 和MLI 均顯著降低，MAN均顯著升高（P＜0.01），見圖2B～D。

Figure 2. Tongsai granules （TSG） suppressed lung histopathological changes and improved lung function of the rats with acute exacerbation of chronic obstructive pulmonary disease. A： histopathologic changes of lung tissues at week 10 （HE staining，×200 and ×500）： B，C and D： comparison of lung injury indicators，including bronchial wall thickness （BWT），alveolar mean linear intercept （MLI） and mean alveolar number （MAN）； E： comparison of peak expiratory flow （PEF） at week 10.MXF： moxifloxacin； STL： salbutamol. Mean±SD. n=6. **P＜0.01 vs control group； ##P＜0.01 vs model group.圖2 TSG減輕AECOPD大鼠肺組織病理變化并改善肺功能

2 TSG改善AECOPD大鼠肺功能

肺功能檢測結果顯示，與control 組比較，model組大鼠PEF 顯著降低，（P＜0.01）；與model 組比較，TSG 組和MXF+STL 組大鼠PEF 顯著上升（P＜0.01），見圖2E。

3 TSG 減少AECOPD 大鼠肺組織炎癥因子及MMP表達

免疫組化結果顯示，與control 組比較，model 組大鼠肺組織IL-1β、IL-6、TNF-α、MMP2 和MMP9 表達水平顯著升高（P＜0.05或P＜0.01）；與model組比較，TSG 組和MXF+STL 組大鼠肺組織IL-1β、IL-6、TNFα、MMP2 和MMP9 表達水平顯著降低（P＜0.05 或P＜0.01），見圖3。

Figure 3. Tongsai granules （TSG） inhibited the increases in the levels of inflammatory cytokines and matrix metalloproteases（MMPs） in lung tissues of AECOPD rats. The expression levels of interleukin （IL）-6，IL-1β，tumor necrosis factor （TNF）-α，MMP2 and MMP9 in lung tissues of rats were analyzed by immunohistochemistry （×200），and the integrated absorbance （IA） values were analyzed. MXF： moxifloxacin； STL： salbutamol. Mean±SD. n=6. *P＜0.05，**P＜0.01 vs control group； ##P＜0.01 vs model group.圖3 TSG降低AECOPD大鼠肺組織炎癥因子及MMP表達

4 TSG 增加AECOPD 大鼠肺組織上皮連接蛋白表達

Western blot 結果顯示，與control 組比較，model組大鼠肺組織ZO-1、E-Cad 和OCC 表達水平均顯著降低（P＜0.01）；與model 組比較，TSG 組大鼠肺組織ZO-1、E-Cad和OCC 表達水平顯著升高，MXF+STL 組ZO-1 和E-Cad 表達水平顯著升高，OCC 表達水平顯著下降（P＜0.05 或P＜0.01），見圖4A。免疫熒光染色結果顯示，model組大鼠肺組織上皮連接蛋白ZO-1和OCC 表達水平降低；與model 組相比，TSG 組和MXF+STL組ZO-1和OCC表達水平升高，見圖4B。

Figure 4. Tongsai granules （TSG） increased the expression of epithelial junction proteins in AECOPD rats. A： the protein levels of zonula occludens-1 （ZO-1），occludin （OCC） and E-cadherin （E-Cad） in lung tissues were detected by Western blot； B：the expression levels of ZO-1 and OCC in lung tissues were detected by immunofluorescence （×200 and ×400）. MXF：moxifloxacin； STL： salbutamol. Mean±SD. n=6. **P＜0.01 vs control group； ##P＜0.01 vs model group.圖4 TSG升高AECOPD大鼠肺組織上皮連接蛋白表達

5 TSG2顯著升高支氣管上皮細胞連接蛋白表達

如圖5A 所示，TSG1～3可抑制CSE 誘導的BEAS-2B 細胞中ZO-1 表達水平降低，TSG1～4 可抑制OCC表達水平降低（P＜0.01），其中TSG2 效果較好。TSG2（20、50 和100 mg/L）呈濃度依賴性地升高ZO-1和OCC表達水平（P＜0.05或P＜0.01），見圖5B。

Figure 5. Treatment with TSG2 significantly increased the expression of zonula occludens-1 （ZO-1） and occludin （OCC） in bronchial epithelial cells. A： the protein levels of ZO-1 and OCC in the cells treated with TSG1～5 were detected by Western blot； B：the protein levels of ZO-1 and OCC in the cells treated with TSG2 （20，50 and 100 mg/L） were detected by Western blot.Mean±SD. n=3. **P＜0.01 vs control group； #P＜0.05，##P＜0.01 vs model group.圖5 TSG2顯著增加支氣管上皮細胞連接蛋白表達

6 TSG2干預AECOPD的網(wǎng)絡藥理分析

UPLC-Q-Extractive-Orbitrap MS 檢 測TSG2 化 學成分，共發(fā)現(xiàn)33 種化合物（圖6A）。通過檢索Swiss Target 和PharmMapper 數(shù)據(jù)庫獲得3 種化合物麻黃堿、偽麻黃堿和巖白菜素的328 個靶點（圖6B）。通過Genecard 疾病數(shù)據(jù)庫獲取AECOPD 相關疾病基因3 864 個。取328 個靶點和3 864 個疾病基因交集構建PPI 網(wǎng) 絡，degree≥29 的 前20 個核心節(jié)點用于KEGG 通路富集分析（圖6C、D）。分析結果表明，TSG2 調控多種信號通路，包括ERBB2、ERK、EGFR、interleukins和WNT等信號通路（圖6E）。

Figure 6. Network pharmacology analysis to elucidate the mechanism of TSG2 for the treatment of AECOPD. A： chemical composition of TSG2 determined by UPLC-Q-Extractive-Orbitrap MS； B： compound-target network composed of 3 compounds and 328 targets； C： Venn plot of 328 targets and 3 864 genes associated with AECOPD； D： the PPI network of targets and differently expressed genes constructed by STRING （pink circle： the top 20 nodes arranged by degree value）； E： KEGG pathway analysis of the top 20 nodes.圖6 TSG2干預AECOPD的網(wǎng)絡藥理分析

7 TSG2抑制EGFR/ERK 信號活化

Western blot 結果顯示，與control 組比較，model組細胞p-EGFR 和p-ERK 蛋白水平均顯著升高（P＜0.01）；與model 組比較，TSG2（20、50 和100 mg/L）可顯著降低p-EGFR 和p-ERK 蛋白水平（P＜0.05 或P＜0.01），見圖7。

Figure 7. Treatment with TSG2 inhibited epidermal growth factor receptor（EGFR）/extracellular signal-regulated kinase（ERK） signaling pathway in bronchial epithelial cells exposed to cigarette smoke extract （CSE）. The protein levels of p-EGFR and p-ERK were determined by Western blot. Mean±SD. n=3. *P＜0.05，**P＜0.01 vs control group； #P＜0.05，##P＜0.01 vs model group.圖7 TSG2抑制CSE誘導的支氣管上皮細胞EGFR/ERK 信號通路活化

討 論

AECOPD 是導致COPD 患者肺功能急劇下降、疾病迅速惡化的主要原因［20-23］?，F(xiàn)有治療主要包括抗生素、支氣管擴張劑和吸入糖皮質激素等藥物，可有效減輕氣道阻塞，緩解呼吸困難［24-27］，但其作用有限且易導致免疫功能紊亂，增加再次感染風險。中醫(yī)藥治療AECOPD 具有獨特優(yōu)勢，可以有效減輕患者的癥狀，提高生活質量。TSG 是臨床治療AECOPD的有效方藥，方中以葶藶子和地龍共為君藥，清熱祛痰、降氣平喘通絡；配合麻黃、大黃、赤芍、貝母等藥合用，針對AECOPD 共奏清熱祛痰活血、宣肺降氣平喘、扶正虛、祛邪實之功效。本課題組前期臨床試驗證實，TSG 可有效減輕老年AECOPD 患者癥狀，改善其肺功能［15］，降低TNF-α、IL-1β、IL-6 和IL-8 水平［16］，同時降低血清I型膠原、可溶性細胞間黏附分子和E-選擇素水平［28］。本研究發(fā)現(xiàn)，TSG 可改善AECOPD大鼠肺功能，減輕肺病理變化，抑制炎癥反應，減少MMP表達等，這表明TSG可以有效緩解AECOPD。

氣道上皮屏障結構是抵御外界刺激保護機體氣道微環(huán)境穩(wěn)定的重要屏障，在COPD 發(fā)生發(fā)展中扮演著重要的角色［29］。氣道上皮細胞間連接方式主要包括緊密連接（tight junctions，TJs）和黏附連接（adherens junctions，AJs）［26］。TJs 環(huán)繞于支氣管上皮細胞頂部，可限制上皮細胞通透性和維持組織內環(huán)境的穩(wěn)定，由ZO-1 和OCC 等組成。AJs 位于緊密連接下方，執(zhí)行穩(wěn)定細胞粘附、調節(jié)肌動蛋白細胞骨架等多種功能，由E-Cad等蛋白等組成［26-27］。CS暴露可以誘發(fā)氣道上皮屏障失調，增加COPD 患者細菌和病毒感染風險，導致免疫細胞募集和持續(xù)炎癥［30］。研究表明，在COPD 患者支氣管氣道上皮中TJs 和AJs相關蛋白（包括ZO-1、E-Cad 和OCC）的表達下調，上皮屏障功能減弱［25，31］。本研究發(fā)現(xiàn)，AECOPD 大鼠氣道上皮連接蛋白表達水平降低，TSG 治療后可上調連接蛋白表達；此外CSE 可以直接誘導支氣管上皮細胞BEAS-2B 連接蛋白表達水平降低，誘導屏障損傷，而TSG 可以直接作用于氣道上皮保護屏障功能。因此，TSG 可以直接減輕CS 誘導的AECOPD 大鼠氣道上皮屏障功能損傷。

TSG 由10味中藥組成，成分復雜，不利于作用機制研究。本文采用大孔樹脂分離柱將TSG 分成5 個活性部位，發(fā)現(xiàn)其中TSG2 顯著抑制CSE 誘導的氣道上皮細胞中連接蛋白表達降低，因此以TSG2 為代表探討TSG 作用機制。通過質譜分析發(fā)現(xiàn)TSG2 含有33種化合物，將33種化合物通過檢索Swiss Target 和PharmMapper數(shù)據(jù)庫獲得靶點共328個對應3種化合物（麻黃堿、偽麻黃堿和巖白菜素），再檢索Genecard疾病數(shù)據(jù)庫，獲取AECOPD 相關疾病基因3 864 個。取328 個靶點和3 864 個疾病基因的188 個交集基因，構建PPI 網(wǎng)絡，取degree≥29 的前20 個核心節(jié)點用于KEGG通路富集分析，涉及ERBB2、ERK、EGFR、interleukins 和WNT 等信號通路。研究表明，EGFR和ERK 在氣道上皮屏障損傷中發(fā)揮重要作用，其中COPD 患者肺組織中EGFR、HER2 和ERK 磷酸化水平顯著升高［33］；CSE 激活小鼠肺組織ERK1/2 信號，破壞上皮屏障完整性［34］；而ERK1/2 抑制劑U0126 和EGFR 抑制劑AG1478 可顯著抑制CS 誘導的人支氣管上皮細胞系中TJs 解離［35］。本研究發(fā)現(xiàn)，TSG2 可顯著抑制CSE 誘導的支氣管上皮細胞中EGFR/ERK信號通路激活。因此，TSG 保護氣道上皮屏障可能與抑制EGFR/ERK信號通路有關。

綜上所述，TSG 可有效減輕AECOPD 大鼠肺組織病變，改善肺功能，抑制炎癥反應，保護氣道上皮屏障功能，可能與EGFR/ERK 信號通路相關。本研究為TSG的臨床應用提供理論依據(jù)。