高瑞，郭磊，彭博，賈駿

0 引言

口腔鱗狀細(xì)胞癌（oral squamous cell carcinoma, OSCC）起源于口腔上皮組織，是最常見的頜面部惡性腫瘤。據(jù)統(tǒng)計(jì)，OSCC占口腔惡性腫瘤的90%以上，全球大約每年新增500 000例OSCC患者[1]，以40～60歲的男性患者多見，且其發(fā)病率隨年齡的增長而上升[2]。煙、酒、檳榔等均是OSCC的致病因素，且近些年發(fā)現(xiàn)口腔微生物群與OSCC的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[3]。OSCC具有惡性程度高、局部浸潤性強(qiáng)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率高等特點(diǎn)，晚期可發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，其5年生存率約55%[4-5]。盡管臨床上針對(duì)OSCC的手術(shù)及放化療等治療方法不斷改進(jìn)，但其預(yù)后并沒有明顯的好轉(zhuǎn)，仍缺乏有效的生物標(biāo)志物[6]。因此，發(fā)現(xiàn)OSCC特異性標(biāo)志物可能會(huì)提高OSCC患者的生存率，改善其預(yù)后狀況。

SEC61G（SEC61 translocon subunit gamma,SEC61G）本質(zhì)上是一種細(xì)胞膜蛋白，該膜蛋白是SEC61復(fù)合體的重要成員之一[7]。SEC61復(fù)合體是由SEC61α、β、γ三個(gè)亞基形成的異質(zhì)三聚體蛋白通道，是細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)裝置的核心組件[8]。多項(xiàng)研究表明，SEC61G在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤[9]、胃癌[10]、肝癌[11]等惡性腫瘤中表達(dá)失調(diào)，并可作為膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的潛在預(yù)后標(biāo)志物[9]。然而，SEC61G與OSCC之間的關(guān)系尚不清楚。

本研究首先利用TCGA數(shù)據(jù)庫分析了SEC61G在OSCC組織和癌旁組織中的表達(dá)情況，用免疫組織化學(xué)的方法對(duì)結(jié)果進(jìn)行了驗(yàn)證，并進(jìn)一步分析SEC61G的表達(dá)與OSCC患者臨床病理特性的相關(guān)性，最后探索SEC61G對(duì)OSCC的預(yù)后和診斷價(jià)值，以期為SEC61G作為OSCC診療的生物標(biāo)志物奠定理論基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

本研究于2015—2018年在鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院口腔醫(yī)院收集了64對(duì)OSCC石蠟組織及其癌旁組織。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）有詳細(xì)的臨床病理資料，包括患者的年齡、性別、吸煙史、腫瘤位置、T分期、N分期、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、組織分化；（2）術(shù)前未行放化療，均行外科手術(shù)治療且術(shù)后配合適當(dāng)?shù)姆呕煟唬?）無糖尿病等嚴(yán)重并發(fā)癥。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）臨床病理資料不全；（2）復(fù)發(fā)病例或術(shù)前接受過放化療；（3）非原發(fā)于口腔頜面部的腫瘤。

1.2 TCGA數(shù)據(jù)庫樣本

通過TCGA數(shù)據(jù)庫（https://portal.gdc.cancer.gov/）下載了OSCC患者的mRNA表達(dá)譜信息，舍棄掉沒有臨床信息對(duì)應(yīng)的數(shù)據(jù)，共得到329例OSCC組織和32例正常組織、32對(duì)配對(duì)的OSCC組織和癌旁組織（格式：TPM，平臺(tái)：RNAseq）。篩選出SEC61G的表達(dá)量和臨床資料，利用仙桃學(xué)術(shù)（https://www.xiantaozi.com/）在線分析軟件分析SEC61G在OSCC組織中的表達(dá)與患者N分期、臨床分期、放療史的相關(guān)性，并探討了SEC61G的表達(dá)對(duì)OSCC的預(yù)后、診斷價(jià)值，用ggplot2[3.3.6]包對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行可視化。

1.3 免疫組織化學(xué)染色

采用常規(guī)免疫組織化學(xué)法檢測SEC61G在OSCC組織及配對(duì)癌旁組織中的表達(dá)。具體步驟如下：在切片機(jī)上制備5 μm蠟塊切片，60℃烤片2 h，24 h后4℃保存；經(jīng)脫蠟、水化后，在每張切片上加50 μl的過氧化物酶阻斷劑，室溫條件下孵育10 min，PBS洗3次，每次5 min；置于1 000 ml EDTA（pH=8.0的乙二胺四乙酸）抗原修復(fù)液中修復(fù)抗原，PBS緩沖液浸泡、洗滌3次，約5分鐘/次，PBST沖洗5 min；50 μl封閉液封閉，滴加一抗、二抗；顯色，蘇木精對(duì)比染色，梯度酒精（50%、75%、95%、100%）脫水，中性樹脂封片，拍照。

染色結(jié)果的判讀：由兩位病理科醫(yī)生采用雙盲法評(píng)估，分別記錄切片中SEC61G陽性細(xì)胞的比例和染色強(qiáng)度。染色強(qiáng)度分級(jí)如下：0: 未著色；1: 淺黃色；2: 棕黃色；3: 棕褐色。染色面積分級(jí)如下：0: ≤5%；1: ＞5%～25%；2: ＞25%～50%；3:＞50%～75%；4: ＞75%～100%。＜3分為SEC61G低表達(dá)，≥3分為SEC61G高表達(dá)。根據(jù)兩者的得分之和判斷SEC61G的表達(dá)高低。如果兩名醫(yī)師的判定結(jié)果不一致，則由第三名醫(yī)師進(jìn)行閱片并確定最終結(jié)果。

1.4 隨訪

對(duì)納入的所有OSCC患者通過病歷查閱、門診復(fù)診、電話致電的方式進(jìn)行隨訪并記錄患者的生存狀態(tài)和總生存期，確保所有患者均接受3年以上的隨訪時(shí)間，中途失訪者的生存期以最后一次隨訪時(shí)間為準(zhǔn)。本研究從2016年6月開始隨訪，截止時(shí)間為2021年9月，每半年隨訪一次。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用SPSS23.0版進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，所有數(shù)值均使用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示?？ǚ綑z驗(yàn)用于分析SEC61G的表達(dá)與OSCC患者臨床病理特性的相關(guān)性。為了分析SEC61G的表達(dá)水平與OSCC患者預(yù)后的關(guān)系，根據(jù)免疫組織化學(xué)的結(jié)果，將64對(duì)OSCC石蠟標(biāo)本分為SEC61G低表達(dá)和高表達(dá)組，并結(jié)合患者的臨床隨訪資料，使用Kaplan-Meier法分析OSCC患者3年隨訪的生存資料，Log rank法比較SEC61G高表達(dá)和低表達(dá)組中OSCC患者總體生存期的差異。單因素和多因素Cox回歸分析影響OSCC患者預(yù)后的危險(xiǎn)因素。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TCGA數(shù)據(jù)庫中SEC61G在OSCC中的表達(dá)

在TCGA數(shù)據(jù)庫中，SEC61G在OSCC組織中的表達(dá)明顯高于正常組織（P=0.005），見圖1A；在32對(duì)配對(duì)的OSCC組織和癌旁組織中，SEC61G在腫瘤組織中的表達(dá)也明顯增加（P=0.003），見圖1B；SEC61G在OSCC中的表達(dá)與患者T分期（P=0.047）、放療史（P=0.036）相關(guān)，見圖1C～D。此外，SEC61G在乳腺癌、前列腺癌等大多數(shù)惡性腫瘤的表達(dá)均顯著增加（P＜0.05），見圖1E。

圖1 TCGA數(shù)據(jù)庫中SEC61G在OSCC和其他惡性腫瘤組織中的表達(dá)Figure 1 Expression of SEC61G in OSCC tissues and other tumor tissues obtained from the TCGA database

2.2 免疫組織化學(xué)檢測SEC61G在OSCC組織和癌旁組織中的表達(dá)

與癌旁組織相比，OSCC組織中SEC61G蛋白的陽性表達(dá)率增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.031）。SEC61G在低分化OSCC組織中表達(dá)最高，在高分化OSCC組織中表達(dá)最低，見圖2。

圖2 免疫組織化學(xué)檢測SEC61G蛋白在OSCC組織中高表達(dá)Figure 2 Expression of SEC61G protein in OSCC tissues detected by immunohistochemical method

2.3 SEC61G的表達(dá)與OSCC患者臨床病理特征的相關(guān)性

根據(jù)免疫組織化學(xué)的結(jié)果，分為SEC61G低表達(dá)和高表達(dá)組，并與患者的臨床病理資料進(jìn)行相關(guān)性分析。結(jié)果表明，SEC61G的表達(dá)與OSCC患者N分期、臨床分期相關(guān)（P＜0.05），見表1。

表1 SEC61G的表達(dá)與OSCC患者臨床病理特征的相關(guān)性Table 1 Relationship between SEC61G expression and clinicopathological features of patients with OSCC

2.4 SEC61G表達(dá)與OSCC患者預(yù)后不良的相關(guān)性

SEC61G低表達(dá)組中OSCC患者的總體生存率明顯高于SEC61G高表達(dá)組（P=0.011），見圖3A。此外，在TCGA數(shù)據(jù)庫中，SEC61G低表達(dá)組中OSCC患者的總體生存期（P=0.008）、疾病特異性生存期（P=0.002）和無進(jìn)展生存期（P＜0.001）均顯著高于SEC61G高表達(dá)組，見圖3B～D。上述結(jié)果提示，SEC61G高表達(dá)與OSCC患者預(yù)后不良有關(guān)。

圖3 SEC61G高表達(dá)與OSCC患者預(yù)后不良有關(guān)Figure 3 High SEC61G expression was associated with poor prognosis of patients with OSCC

圖4 SEC61G對(duì)OSCC患者的診斷價(jià)值Figure 4 Diagnostic value of SEC61G in OSCC detected in the TCGA database

2.5 Cox回歸分析影響OSCC患者預(yù)后的因素

Cox單因素分析結(jié)果表明，N分期和SEC61G的表達(dá)是OSCC患者總體生存期的影響因素；多因素分析結(jié)果表明，SEC61G的表達(dá)是影響OSCC患者預(yù)后的獨(dú)立因素（P＜0.05），見表2。

表2 單因素和多因素Cox回歸分析影響OSCC患者預(yù)后的因素Table 2 Univariate and multivariate Cox analysis of prognostic factors for patients with OSCC

2.6 SEC61G對(duì)OSCC患者的診斷價(jià)值

在TCGA數(shù)據(jù)庫中分析了SEC61G對(duì)OSCC患者的診斷意義，結(jié)果顯示，ROC曲線下面積大于0.9（AUC=0.923），表明SEC61G的表達(dá)對(duì)于OSCC患者的診斷有較高的準(zhǔn)確性，可能是OSCC的一個(gè)診斷標(biāo)志物。

3 討論

OSCC是由生物、化學(xué)、遺傳等因素引起的口腔頜面部常見的惡性腫瘤，近些年發(fā)病率逐漸增高，一旦發(fā)生轉(zhuǎn)移預(yù)后往往較差，嚴(yán)重影響患者的生命健康[12]。由于OSCC早期癥狀不明顯，發(fā)現(xiàn)時(shí)多為中晚期，增加了治療難度，病死率較高，因此早期診斷對(duì)于提高OSCC患者的生存期尤為重要。從基因水平檢測與惡性腫瘤相關(guān)的蛋白或RNA，發(fā)現(xiàn)潛在的生物標(biāo)志物，已經(jīng)被證明對(duì)于提高腫瘤患者的診療方法、改善患者的預(yù)后狀況均有重要意義[13]。

SEC61是一種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜轉(zhuǎn)運(yùn)復(fù)合體，定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜，對(duì)新合成的前體多肽運(yùn)輸?shù)絻?nèi)質(zhì)網(wǎng)至關(guān)重要[8]。除了SEC61外，由SEC62和SEC63形成的完整的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)位酶也參與蛋白質(zhì)的折疊、翻譯后修飾和轉(zhuǎn)運(yùn)[7,14]。研究表明，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通道蛋白與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，例如SEC62和SEC63在多種惡性腫瘤中發(fā)生突變或表達(dá)異常[15-16]。然而，關(guān)于SEC61和惡性腫瘤的研究較少。SEC61G是SEC61的三個(gè)亞基之一，據(jù)報(bào)道，SEC61G在多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中的表達(dá)顯著增加，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖，并參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激[9]。Gao等研究表明SEC61G在肝癌組織中的表達(dá)顯著高于癌旁組織，且其表達(dá)水平與肝癌患者的總體生存期相關(guān)，可能是肝癌的一個(gè)治療靶點(diǎn)[11]。另有研究表明，SEC61G在腎癌組織中表達(dá)失調(diào)，敲低SEC61G可促進(jìn)腎癌細(xì)胞凋亡和上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）[17]。Zheng等通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)SEC61G在肺腺癌中表達(dá)上調(diào)，與肺腺癌患者預(yù)后不良有關(guān)，且降低SEC61G表達(dá)可抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲、促進(jìn)其凋亡[18]，Xu等的研究也得到同樣的結(jié)果[19]。Jin等研究表明降低SEC61G表達(dá)可抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲、促進(jìn)其凋亡，并可誘導(dǎo)EMT[20]。此外，Ma等研究發(fā)現(xiàn)SEC61G通過調(diào)節(jié)糖酵解促進(jìn)乳腺癌的發(fā)生發(fā)展，可能是乳腺癌的一個(gè)潛在治療靶點(diǎn)[21]。然而，SEC61G在OSCC中的作用并不清楚。

針對(duì)惡性腫瘤中差異基因的表達(dá)和預(yù)后分析，有助于發(fā)現(xiàn)新的腫瘤標(biāo)志物。在本研究中，首先初步通過TCGA數(shù)據(jù)庫分析了SEC61G在OSCC組織和正常組織中的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)SEC61G在OSCC組織中的表達(dá)明顯上調(diào)，與患者N分期、臨床分期、放療史相關(guān)，并且在前列腺癌和膽管癌等大多數(shù)惡性腫瘤中的表達(dá)均顯著增高，表明SEC61G可能是一個(gè)癌基因。然后，進(jìn)一步通過免疫組織化學(xué)檢測了SEC61G在64例OSCC石蠟組織及其配對(duì)癌旁組織中的表達(dá)，根據(jù)其表達(dá)水平分為SEC61G高表達(dá)和低表達(dá)組，并與患者臨床病理特征進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示SEC61G在OSCC組織中的表達(dá)顯著高于癌旁組織，且其表達(dá)與患者N分期、臨床分期相關(guān)，再次驗(yàn)證了TCGA數(shù)據(jù)庫的分析結(jié)果。同時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)SEC61G低表達(dá)組中OSCC患者的總體生存期、疾病特異性生存期和無進(jìn)展生存期均顯著高于SEC61G高表達(dá)組，提示SEC61G高表達(dá)與OSCC患者預(yù)后不良有關(guān)。此外，Cox回歸分析的結(jié)果顯示SEC61G的表達(dá)是OSCC患者預(yù)后的獨(dú)立影響因素。最后，利用TCGA數(shù)據(jù)庫中的臨床資料分析SEC61G對(duì)OSCC的診斷價(jià)值，結(jié)果表明SEC61G有作為OSCC診斷標(biāo)志物的潛力。

綜上，SEC61G在OSCC組織中高表達(dá)，且其高表達(dá)與OSCC患者預(yù)后不良有關(guān)，可能是OSCC的一個(gè)預(yù)后、診斷標(biāo)志物。然而，本研究也存在一定的不足之處，比如臨床樣本量較少且缺乏相關(guān)的細(xì)胞功能學(xué)實(shí)驗(yàn)。未來可聯(lián)合多中心增加臨床樣本量，并進(jìn)一步探討SEC61G影響OSCC發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī)制。

利益沖突聲明：

所有作者均聲明不存在利益沖突。