＊趙玉娟 魏寶軍* 賈金煥 馬蘇杰 張建麗

（1.華北制藥河北華民藥業(yè)有限責(zé)任公司 河北 052165 2.抗生素酶催化與結(jié)晶技術(shù)國(guó)家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室 河北 052165 3.河北省頭孢類藥物制備技術(shù)創(chuàng)新中心 河北 052165 4.華北制藥河北華民藥業(yè)有限責(zé)任公司河北省企業(yè)技術(shù)中心 河北 052165）

頭孢菌素類抗生素是一類重要的抗菌藥物，抗感染效果較好，在市場(chǎng)中占較大比重。到目前為止，全球頭孢菌素類抗生素已擁有70多個(gè)品種，已廣泛應(yīng)用于臨床治療當(dāng)中。它是一種分子中含有頭孢烯的半合成抗生素，是β-內(nèi)酰胺類抗生素中的7-氨基頭孢烷酸（7-ACA）的衍生物，屬于β-內(nèi)酰胺類抗生素[1-2]。頭孢菌素類抗生素具有以下優(yōu)點(diǎn)：對(duì)細(xì)菌的選擇作用強(qiáng)，但對(duì)人幾乎沒(méi)有毒性；可破壞細(xì)菌的細(xì)胞壁，并且在繁殖期殺菌；具有抗菌作用強(qiáng)、抗菌譜廣、耐青霉素酶、過(guò)敏反應(yīng)較青霉素類少等[3]。

7-ACA是7-氨基頭孢烷酸的簡(jiǎn)稱，是一種重要的生物堿類藥物，是半合成抗頭孢類藥物的重要中間體，在醫(yī)藥制造和醫(yī)藥領(lǐng)域中具有廣泛的應(yīng)用。以7-ACA作為母核與不同的物料反應(yīng)，可以合成頭孢呋辛、頭孢唑林、頭孢克羅、頭孢哌酮鈉、頭孢吡肟、頭孢拉定、頭孢曲松鈉等頭孢菌素類抗生素產(chǎn)品。

雜質(zhì)是藥品的關(guān)鍵質(zhì)量屬性之一，在藥品生產(chǎn)過(guò)程及儲(chǔ)存期間都有可能產(chǎn)生，其對(duì)藥品的安全性、可靠性、有效性造成潛在影響，故雜質(zhì)控制研究是一項(xiàng)浩大的工程，是藥品質(zhì)量研究的主要內(nèi)容。在《中國(guó)藥典》2020版第四部通則的《9102 藥品雜質(zhì)指導(dǎo)原》及ICH Q3A中均指出起始物料是有機(jī)雜質(zhì)之一，而作為頭孢菌素類抗生素產(chǎn)品母核的7-ACA的殘留量也影響著藥品質(zhì)量。故在合成工藝過(guò)程中控制7-ACA殘留含量，可以更好地提高產(chǎn)品的質(zhì)量。

1.實(shí)驗(yàn)部分

(1)儀器與試藥

儀器：安捷倫1260型高效液相色譜儀（美國(guó)安捷倫公司）、島津LC-20AB型高效液相色譜儀（日本島津公司）、XS105DU電子天平（精度0.01mg，瑞士梅特勒-托利多公司）、FE20 pH計(jì)（瑞士梅特勒-托利多公司）。

試藥：7-氨基頭孢烷酸（7-ACA）對(duì)照品（批號(hào)130538-200902，含量96.9%，中國(guó)食品藥品檢定研究院）。二水和磷酸二氫鈉、十二水合磷酸氫二鈉、氫氧化鈉、碳酸氫鈉、鹽酸（分析純）；乙腈（色譜純）；水（去離子水）。

(2)色譜條件

色譜柱為十八烷基硅烷鍵合硅膠填充柱（迪馬Diamonsil C18 4.6×250mm，5μm或能效相當(dāng)），流動(dòng)相為磷酸鹽緩沖液（pH7.0）-乙腈-水（V:V:V=100:60:840），檢測(cè)波長(zhǎng)為254nm（UV），流速為1.0ml/min，柱溫為30℃，進(jìn)樣量為20μl。

(3)測(cè)定過(guò)程及計(jì)算方法

精密量取空白溶液、對(duì)照品溶液、供試品溶液濾液各20μl，分別注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖。反應(yīng)液中7-ACA殘留量的計(jì)算公式如下：

式中：m對(duì)照品—對(duì)照品的重量（mg）；P對(duì)照品—對(duì)照品的含量（%）；A對(duì)照品—對(duì)照品溶液的主峰面積；N對(duì)照品—對(duì)照品溶液的稀釋倍數(shù)。

式中：f平均—對(duì)照品溶液校正因子的平均值；A供試品—供試品溶液中7-ACA峰面積；N樣—供試品溶液的稀釋倍數(shù)。

(4)溶液制備

空白溶液：

a.流動(dòng)相過(guò)濾，進(jìn)樣。b.純化水過(guò)濾，進(jìn)樣。

7-ACA對(duì)照品貯備液：

精密稱取對(duì)照品約30mg，置100ml量瓶中，用磷酸鹽緩沖液溶解后，再用此緩沖液稀釋至刻度，搖勻，作為7-ACA對(duì)照品貯備液。

7-ACA對(duì)照品溶液：

精密移取對(duì)照品貯備液1.0ml，置50ml量瓶中，用流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，過(guò)濾。

供試品溶液：

量取反應(yīng)液適量，精密移取，置含有少量有機(jī)溶劑的50ml量瓶中，依次加入10%鹽酸溶液、純化水、10%碳酸氫鈉溶液各適量，緩慢振搖使反應(yīng)，再加純化水稀釋至刻度，搖勻，過(guò)濾。

加標(biāo)供試品溶液：

精密移取7-ACA對(duì)照品貯備液0.8ml，置25ml容量瓶中，再用已制備的供試品溶液稀釋至刻度，搖勻，過(guò)濾。

2.結(jié)果

(1)專屬性試驗(yàn)

精密移取空白溶液、對(duì)照品溶液、加標(biāo)供試品溶液、供試品溶液各20μl，分別注入高效液相色譜儀，對(duì)色譜圖進(jìn)行分析圖1。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，空白溶液對(duì)7-ACA殘留量檢測(cè)無(wú)明顯干擾，供試品溶液和加標(biāo)供試品溶液中7-ACA峰保留時(shí)間（分別為8.013min、7.989min）與對(duì)照品溶液的主峰保留時(shí)間（8.037min）一致，對(duì)照品溶液、供試品溶液和加標(biāo)供試品溶液中7-ACA峰純度因子分別為999.987、992.772、999.831，均大于990，說(shuō)明峰純度良好；供試品溶液和加標(biāo)供試品溶液中7-ACA峰與其前后相鄰峰分離度均大于1.5，符合要求，說(shuō)明該測(cè)定7-ACA殘留量分析方法專屬性良好。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)見(jiàn)表1。

圖1 典型色譜圖

表1 專屬性結(jié)果

(2)檢測(cè)限和定量限

精密移取對(duì)照品溶液逐級(jí)稀釋，配制低濃度溶液，按“1.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行檢測(cè)，記錄色譜圖，主峰信噪比大于3時(shí)為檢測(cè)限，信噪比大于10時(shí)為定量限。試驗(yàn)測(cè)得7-ACA檢測(cè)限濃度為52.12ng/ml；定量限濃度為173.72ng/ml。配制6份定量限濃度的溶液分別注入高效液相色譜儀進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜圖，主峰峰面積的RSD為2.0%，主峰保留時(shí)間的RSD為0.04%。

(3)線性試驗(yàn)

取適量7-ACA對(duì)照品，精密稱定，置100ml容量瓶中，用適量磷酸鹽緩沖液（pH7.0）溶解，再用此緩沖液稀釋至刻度，搖勻，作為7-ACA對(duì)照品貯備液；精密移取7-ACA對(duì)照品貯備液，進(jìn)行不同倍數(shù)的稀釋制得濃度分別為2.895μg/ml、4.343μg/ml、5.791μg/ml、7.238μg/ml、9.555μg/ml、11.582μg/ml的溶液，作為對(duì)照品的線性溶液。精密量取上述各線性溶液，分別注入高效液相色譜儀，記錄主峰面積。以對(duì)照品溶液的濃度（C，μg/ml）為橫坐標(biāo)，測(cè)得各溶液的主峰面積（A，mAU）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸方程。由實(shí)驗(yàn)得7-ACA回歸方程：A=27.333C+2.7421。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，7-ACA在2.895～11.582μg/ml濃度范圍內(nèi)，峰面積與濃度呈良好線性關(guān)系（100%響應(yīng)值的25%為66.1410，r=1.0000）。

(4)進(jìn)樣精密度試驗(yàn)

將7-ACA對(duì)照品溶液注入高效液相色譜儀，記錄7-ACA峰面積，連續(xù)進(jìn)樣6次。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，7-ACA峰面積的RSD（n=6）為0.35%，表明本分析方法進(jìn)樣精密度良好。

(5)重復(fù)性試驗(yàn)

按“1.4”項(xiàng)下配制對(duì)照品溶液6份，依次注入高效液相色譜儀，分析色譜圖，記錄7-ACA峰面積。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，7-ACA峰面積的RSD（n=6）為0.98%，表明本分析方法重復(fù)性良好。

(6)回收率試驗(yàn)

取7-ACA對(duì)照品適量，精密稱定，置合適的量瓶中，用適量磷酸鹽緩沖液（pH7.0）使溶解，再用此緩沖液稀釋至刻度，搖勻。分別制備低、中、高3個(gè)水平的對(duì)照品溶液，每個(gè)水平的溶液制備3份。每份溶液分別進(jìn)樣檢測(cè)，記錄色譜圖，用峰面積并計(jì)算回收率，平均回收率為96.9%（RSD=1.4%，n=9）。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)見(jiàn)表2。

表2 回收率試驗(yàn)數(shù)據(jù)

(7)溶液穩(wěn)定性溶液

按“1.4”項(xiàng)下配制供試品溶液，室溫下放置，分別在0h、30min、80min、2h后分別進(jìn)樣，記錄色譜圖。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，7-ACA保留時(shí)間RSD為0.13%，供試品中7-ACA殘留含量與0h的最大差值為0.01mg/ml，供試品溶液在室溫下放置2h比較穩(wěn)定。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果及實(shí)驗(yàn)的可操作性、及時(shí)性，7-ACA殘留供試品溶液配制后需及時(shí)進(jìn)樣進(jìn)行測(cè)定。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)見(jiàn)表3。

表3 供試品溶液穩(wěn)定性測(cè)定結(jié)果

(8)耐用性考察

為了考察色譜條件微小變動(dòng)因素對(duì)7-ACA峰與其前后雜質(zhì)峰分離度的影響，分別改變柱溫（25℃、30℃和35℃）、緩沖鹽溶液的pH值（6.8、7.0和7.2）以及流動(dòng)相比例（105:55:840、100:60:840和95:65:840）來(lái)考察分析方法的耐用性，7-ACA峰與其前后峰的分離度均符合要求。

3.總結(jié)與討論

建立了用高效液相色譜檢測(cè)頭孢菌素類抗生素產(chǎn)品工藝過(guò)程中7-ACA殘留含量的分析方法，在生產(chǎn)過(guò)程中能夠更好地控制反應(yīng)的終止點(diǎn)，對(duì)工業(yè)生產(chǎn)具有實(shí)際指導(dǎo)意義；同時(shí)，可以充分利用反應(yīng)物料，降低生產(chǎn)成本；控制反應(yīng)液中7-ACA含量可降低其在最終產(chǎn)品中的殘存量，提高產(chǎn)品質(zhì)量。該方法具有專屬性良好，分離度滿足要求，操作簡(jiǎn)便，精密度、穩(wěn)定性、回收率均符合方法學(xué)驗(yàn)證的要求，為頭孢類品種檢測(cè)母核7-ACA殘留含量提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，能夠更好地確保產(chǎn)品質(zhì)量。