＊何勤勤 鄧詩(shī)婷 林歡 楊澤林 何玉冰 韓寒冰 黃新敏

（廣東石油化工學(xué)院 生物與食品工程學(xué)院 廣東 525000）

化橘紅是我國(guó)著名的南藥，由蕓香科植物化州柚（Citrus grandis cv.‘Tomentosa’）加工而成，化橘紅中主要的活性成分是揮發(fā)油、黃酮類物質(zhì)及多糖[1-2]。柚皮苷和野漆樹苷是化橘紅中含量最高的黃酮類物質(zhì)[3]，具有祛痰、鎮(zhèn)咳、抑制哮喘、降血壓、降心率和抗氧化等效用[4-5]。近年來，隨著人類生活水平提高，不良飲食、作息習(xí)慣等造成的高尿酸血癥患病率逐年上升，已經(jīng)成為人類第二大代謝性疾病[5-6]。黃嘌呤氧化酶是體內(nèi)催化黃嘌呤或次黃嘌呤轉(zhuǎn)化為尿酸的關(guān)鍵酶，通過抑制黃嘌呤氧化酶的活性，可降低尿酸的形成[7]。在對(duì)黃酮類化合物活性的分析中發(fā)現(xiàn)，具有黃酮骨架的化合物可抑制黃嘌呤氧化酶活性[8]。李夢(mèng)榮等[5]研究表明車前草內(nèi)黃酮化合物異澤蘭黃素通過氫鍵、范德華力、π-σ鍵和疏水作用力等與黃嘌呤氧化酶結(jié)合進(jìn)而抑制酶活性?；诖耍疚牟捎靡掖继崛』偌t果實(shí)及花中黃酮類化合物并進(jìn)行體外黃嘌呤氧化酶抑制效果研究，同時(shí)分析不同化橘紅果、花代用茶浸泡方式浸出液對(duì)黃嘌呤氧化酶的抑制效果，以期為化橘紅在治療高尿酸血癥和痛風(fēng)中的應(yīng)用提供指導(dǎo)。

1.材料與方法

(1)實(shí)驗(yàn)材料

化橘紅果實(shí)（果齡60d）及花（花瓣剛展開）采自橘品天下科技發(fā)展（化州）有限公司基地，采摘后運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，烘干后粉碎過40目篩得到小粉末用于提取?；偌t果實(shí)及花代用茶制備參照傳統(tǒng)方法，將果實(shí)烘干后切成厚度3mm的薄片為果實(shí)代用茶，花烘干后為花代用茶。黃嘌呤氧化酶、黃嘌呤等購(gòu)于上海源葉生物科技有限公司。柚皮苷、野漆樹苷、柚皮素、芹菜素等標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)于ChemFaces公司。其他分析純?cè)噭┑荣?gòu)于天津市大茂化學(xué)試劑廠。

(2)儀器

萬分之一電子天平（AR224CN，奧豪斯儀器有限公司）、數(shù)控超聲波清洗器（PS-60A，江蘇省昆侖山市超聲儀器有限公司）、光吸收全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀（ReadMax 1200，上海閃譜生物科技有限公司）、高效液相色譜（LC-20A，株式會(huì)社島津制作所）。

(3)化橘紅黃酮類化合物提取

化橘紅果實(shí)、花黃酮類化合物提取參照韓寒冰等[3]方法進(jìn)行優(yōu)化，以60%乙醇作為提取溶劑，在30℃下采用300W超聲輔助提取2h，提取完成后7500r/min離心10min，上清液即為化橘紅黃酮類化合物提取液。上清液以韓寒冰等[3]建立的方法采用高效液相色譜檢測(cè)四種主要成分柚皮苷、野漆樹苷、柚皮素、芹菜素的含量，并以總和代表總黃酮含量。隨后將提取液稀釋為50μg/mL、100μg/mL和150μg/mL用于分析黃嘌呤氧化酶抑制活性。

(4)化橘紅果實(shí)和花代用茶浸液制備

結(jié)合化橘紅代用茶使用習(xí)慣，取0.5g化橘紅果實(shí)或者花，按照不同料液比加入溫度90℃的水，浸泡10min后過濾，收集過濾液，其中果實(shí)料液比為1:100、1:200、1:300、1:400、1:500，花料液比為1:50、1:100、1:150、1:200、1:250。取0.5g化橘紅果實(shí)或者花，果實(shí)按照1:300料液比，花按照1:150料液比加入60℃、70℃、80℃、90℃、100℃的水，浸泡10min后過濾，收集過濾液。取0.5g化橘紅果實(shí)或者花，果實(shí)按照1:300料液比，花按照1:150料液比加入90℃的水，浸泡5min、10min、15min、20min、25min，過濾收集過濾液，濾液用于分析不同時(shí)間浸提液對(duì)黃嘌呤氧化酶抑制活性。根據(jù)單因素結(jié)果，采用正交實(shí)驗(yàn)法進(jìn)行不同料液比、不同水溫度、不同浸泡時(shí)間化橘紅果實(shí)和花代用茶浸提（表1）。正交實(shí)驗(yàn)表如表1，分別取0.5g化橘紅果實(shí)和花，按照正交試驗(yàn)表進(jìn)行浸泡和過濾，濾液用于檢測(cè)黃嘌呤氧化酶抑制活性。

表1 正交實(shí)驗(yàn)法浸提化橘紅果實(shí)因素水平表

(5)黃嘌呤氧化酶抑制效果分析

黃嘌呤氧化酶抑制效果檢測(cè)方法參照王亞楠等[10]方法。使用酶標(biāo)儀在295nm波長(zhǎng)下檢測(cè)吸光度。根據(jù)一定時(shí)間內(nèi)測(cè)定的吸光度計(jì)算酶活力。加入化橘紅提取物的酶活力表示為U1；加入0.01mL磷酸緩沖液作為陽(yáng)性對(duì)照組的酶活力表示為U2，酶相對(duì)抑制率=（1-U1/U2）×100%。

(6)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

所有實(shí)驗(yàn)均3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SigmaPlot 11進(jìn)行數(shù)據(jù)分析及制圖。

2.結(jié)果與分析

(1)化橘紅果實(shí)和花提取液中黃酮類物質(zhì)含量

化橘紅果實(shí)中總黃酮4095.07μg/mL，其中柚皮苷4016.67μg/mL，野漆樹苷48.39μg/mL，柚皮素25.33μg/mL，芹菜素4.68μg/mL（表2）。花中的總黃酮為673.76μg/mL，其中柚皮苷626.18μg/mL，野漆樹苷36.53μg/mL，柚皮素3.88μg/mL，芹菜素7.17μg/mL（表2）。

表2 化橘紅果實(shí)和花提取液中黃酮類物質(zhì)含量

(2)化橘紅果實(shí)和花黃酮類化合物提取液對(duì)黃嘌呤氧化酶抑制效果

酶活性抑制結(jié)果顯示化橘紅果實(shí)和花的黃酮類化合物提取液對(duì)黃嘌呤氧化酶活性的抑制效果隨濃度上升而加強(qiáng)。其中150μg/mL的果實(shí)提取液抑制效果為53.13%，而150μg/mL的花提取液抑制效果為49.47%（圖1）。

圖1 化橘紅黃酮類化合物提取液對(duì)黃嘌呤氧化酶抑制效果

(3)不同因素對(duì)化橘紅果實(shí)和花代用茶浸液黃嘌呤氧化酶抑制效果的影響

化橘紅果實(shí)和花浸提液黃嘌呤氧化酶抑制率隨著料液比的升高而呈現(xiàn)下降趨勢(shì)（圖2A，B）。隨著浸提水溫上升，浸提液酶抑制率呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，水溫100℃時(shí)，果實(shí)和花酶抑制率分別為54.3%和47.7%（圖2C）。隨著浸泡時(shí)間延長(zhǎng)，浸提液酶抑制率呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，浸泡時(shí)間在15min之后，抑制率上升緩慢（圖2D）。結(jié)合代用茶引用習(xí)慣，化橘紅果實(shí)正交試驗(yàn)因素水平選擇料液比1:200、1:300、1:400，料液比1:100、1:150、1:200，溫度80℃、90℃、100℃，浸泡時(shí)間5min、10min、15min。

圖2 單因素對(duì)化橘紅果實(shí)及花浸提液黃嘌呤氧化酶活性影響

正交實(shí)驗(yàn)法影響果實(shí)和花浸出液酶抑制效果的因素依次為料液比＞浸泡時(shí)間＞溫度，其中果實(shí)浸出液最佳條件是料液比1:200、水溫100℃、浸泡時(shí)間15min，花浸出液最佳條件是料液比1:100、水溫100℃、浸泡時(shí)間15min（表3）。在優(yōu)化方案下化橘紅果實(shí)浸提液酶抑制率為55.1%，花浸提液酶抑制率為51.1%，該結(jié)果與正交實(shí)驗(yàn)相符合（表3）。

表3 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

3.討論

本研究結(jié)果顯示化橘紅果實(shí)及花乙醇提取物中均含有柚皮苷、野漆樹苷、柚皮素和芹菜素4種黃酮類物質(zhì)，這與其他研究結(jié)果一致[2-3]?；偌t果實(shí)和花的黃酮類化合物提取液均能抑制黃嘌呤氧化酶活性，150μg/mL的果實(shí)提取液抑制效果為53.13%，150μg/mL的花提取液抑制效果為49.47%，有研究結(jié)果表明柚皮苷可能通過三個(gè)傳統(tǒng)氫鍵與黃嘌呤氧化酶結(jié)合進(jìn)而起到抑制作用[11]。正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示果實(shí)料液比1:200，花料液比1:100，在水溫100℃浸泡15min，該條件下獲得的化橘紅果實(shí)及花浸出液達(dá)到最高的黃嘌呤氧化酶抑制效果，驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果表明抑制效果分別為55.1%和51.1%。隨著我國(guó)中醫(yī)藥科技的發(fā)展與復(fù)興，臨床用中藥來控制痛風(fēng)取得積極的成果，本研究結(jié)果顯示化橘紅果實(shí)和花提取液及代用茶浸提液均對(duì)黃嘌呤氧化酶有抑制效果，可進(jìn)一步進(jìn)行應(yīng)用開發(fā)研究，為化橘紅用于預(yù)防和治療高尿酸血癥提供參考依據(jù)。