廉貞霞，李 霞,2，姜鷹雁，楊 帥，劉延新,2，楊海霞*

（1.山東省藥學(xué)科學(xué)院 山東省生物藥物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 250101；2.山東福瑞達(dá)醫(yī)藥集團(tuán)有限公司 山東省黏膜與皮膚給藥技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 250101）

N,N-二異丙基乙胺（N,N-diisopropylethylamine，DIPEA）是重要的醫(yī)藥、化工原料，可作為關(guān)鍵中間體使用，且在醫(yī)藥、電子和農(nóng)藥等各領(lǐng)域有著廣泛應(yīng)用[1]。其不僅可用于制造醫(yī)藥麻醉劑、農(nóng)藥除草劑，還可用作胺、二氧化碳和鹵代烴縮合生成脲烷反應(yīng)中的縮合劑及高壓條件下酯水解的催化劑[2]。DIPEA是一種優(yōu)良的有機(jī)溶劑，歐盟將來可能對(duì)其作為基因毒性雜質(zhì)進(jìn)行控制。

二異丙胺作為DIPEA生產(chǎn)的主要原料[3]，也是主要工藝雜質(zhì)。目前尚未檢索到DIPEA中有關(guān)物質(zhì)測(cè)定方法的報(bào)道。本文根據(jù)二異丙胺及DIPEA易揮發(fā)的性質(zhì)及DIPEA的其他文獻(xiàn)測(cè)定方法[4-6]，建立了氣相色譜測(cè)定DIPEA中有關(guān)物質(zhì)的方法，二異丙胺作為已知雜質(zhì)進(jìn)行控制。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

Agilent 7890A型氣相色譜儀，包括G4513A型進(jìn)樣器和FID檢測(cè)器（美國(guó)安捷倫科技有限公司）；XS-205DU型電子分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司）。

1.2 藥品與試劑

DIPEA（批號(hào)：20180320，20180502，20191008）；二異丙胺（北京壇墨質(zhì)檢科技股份有限公司，批號(hào)：20171310）；乙腈（色譜純，天津賽孚瑞科技有限公司，批號(hào)：20170415002）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：DB-624毛細(xì)管柱（30 m×0.53 mm，3.0 μm），載氣為氮?dú)?，流速?.2 ml/min，進(jìn)樣口溫度為210 ℃，F(xiàn)ID檢測(cè)器，檢測(cè)器溫度為250 ℃，程序升溫：起始溫度為50 ℃，維持5 min，再以每分鐘20 ℃的速率升溫至200 ℃，維持3 min。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液 二異丙胺對(duì)照品溶液：精密稱取二異丙胺對(duì)照品約15 mg，置10 ml量瓶中，加乙腈溶解并稀釋至刻度，搖勻。精密量取1 ml，置10 ml量瓶中，加乙腈稀釋并定容至刻度，搖勻，作為對(duì)照品貯備液，精密量取5 ml，置100 ml量瓶中，加乙腈稀釋并定容至刻度，搖勻，即得。

2.2.2 供試品溶液 取DIPEA約50 mg，精密稱定，置10 ml量瓶中，加乙腈溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2.3 空白對(duì)照溶液 以乙腈作為空白對(duì)照溶液。

2.3 測(cè)定法

精密量取供試品溶液及二異丙胺對(duì)照品溶液各1 μl，注入氣相色譜儀，記錄色譜圖，已知雜質(zhì)二異丙胺按外標(biāo)法計(jì)算，不得過0.15 %，其他單雜及總雜按面積歸一法計(jì)算，其他單雜不得過0.15 %，總雜不得過0.5 %。

2.4 專屬性試驗(yàn)

分別精密量取對(duì)照品溶液、供試品溶液和空白對(duì)照溶液各1 μl，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜圖，見圖1。結(jié)果表明，空白對(duì)照溶液不干擾樣品中有關(guān)物質(zhì)的測(cè)定；供試品溶液中已知雜質(zhì)二異丙胺與各個(gè)峰之間及其他各雜質(zhì)峰之間分離度均大于1.5，均已達(dá)到完全分離，表明所建立方法專屬性良好。

圖1 專屬性試驗(yàn)GC圖譜

2.5 檢測(cè)限和定量限

取對(duì)照品溶液，用乙腈逐級(jí)稀釋，直接進(jìn)樣，記錄色譜圖。以信噪比約為3時(shí)的溶液質(zhì)量濃度為檢測(cè)限，結(jié)果得二異丙胺的檢測(cè)限為0.44 μg/ml，相當(dāng)于供試品溶液濃度的0.0088 %；以信噪比約為10時(shí)的溶液質(zhì)量濃度為定量限，結(jié)果得二異丙胺的定量限為0.74 μg/ml，相當(dāng)于供試品溶液濃度的0.0148 %。

2.6 線性關(guān)系試驗(yàn)

精密稱取二異丙胺對(duì)照品14.70 mg，置10 ml量瓶中，加乙腈溶解并稀釋至刻度，搖勻。精密量取1 ml，置10 ml量瓶中，加乙腈稀釋并定容至刻度，搖勻，作為對(duì)照品貯備液。精密量取對(duì)照品貯備液0.1，0.4，0.5，0.6，1.0 ml，分別置于10 ml量瓶中，用乙腈稀釋并定容至刻度，搖勻，即得系列濃度對(duì)照品溶液。取定量限溶液及系列濃度對(duì)照品溶液，依次按濃度從低到高進(jìn)樣，以峰面積A為縱坐標(biāo)，以濃度c（μg/ml）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性回歸方程為A=1.4716c-0.1560，r=0.9998。結(jié)果表明在0.74～14.70 μg/ml范圍內(nèi)，二異丙胺峰面積與濃度均呈良好的線性關(guān)系。

2.7 精密度試驗(yàn)

精密量取2.2.1項(xiàng)下對(duì)照品溶液1 μl，注入氣相色譜儀進(jìn)行分析，連續(xù)進(jìn)樣6針，記錄色譜圖。計(jì)算得二異丙胺峰面積的RSD為1.56 %（n=6），表明方法精密度良好。

2.8 回收率試驗(yàn)

取已測(cè)定二異丙胺含量的DIPEA約50 mg，精密稱定，分別置9個(gè)10 ml量瓶中，分別精密量取2.2.1項(xiàng)下的對(duì)照品貯備液0.2，0.25，0.3 ml各3份，分別加入上述9個(gè)量瓶中，作為80 %，100 %，120 %濃度水平的溶液，每個(gè)濃度平行3份，按2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，扣除樣品中已知二異丙胺的含量，以測(cè)得量與加入量計(jì)算回收率，結(jié)果見表1。二異丙胺的平均回收率為95.81 %，RSD為2.96 %。表明方法準(zhǔn)確度良好。

表1 回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.9 重復(fù)性試驗(yàn)及中間精密度

按2.2項(xiàng)下方法配制對(duì)照品溶液和供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定二異丙胺、其他單雜及總雜含量，平行測(cè)定6份。二異丙胺含量的RSD為2.86 %，其他單雜含量的RSD為2.67 %，總雜含量的RSD為1.84 %（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

另取樣品，于不同日期換不同的分析員，在不同的氣相色譜儀上，按重復(fù)性試驗(yàn)項(xiàng)下方法，用同一批樣品同法試驗(yàn)，并對(duì)試驗(yàn)結(jié)果和重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果，共12個(gè)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。二異丙胺含量的RSD為3.26 %，其他單雜含量的RSD為2.51 %，總雜含量的RSD為2.74 %（n=12）。表明方法中間精密度良好。

2.10 耐用性試驗(yàn)

取對(duì)照品溶液、供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，改變柱溫度、檢測(cè)器和進(jìn)樣口溫度、載氣流量，對(duì)二異丙胺，最大單雜及總雜質(zhì)的檢測(cè)結(jié)果均無明顯影響，表明方法耐用性良好。

2.11 樣品測(cè)定

取3批DIPEA各約50 mg，精密稱定，按2.2項(xiàng)下方法制備對(duì)照品溶液、供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。已知雜質(zhì)二異丙胺按外標(biāo)法計(jì)算，其他單雜及總雜按面積歸一法計(jì)算，結(jié)果見表2。結(jié)果表明，3批樣品中有關(guān)物質(zhì)測(cè)定結(jié)果均符合限度要求。

表2 樣品測(cè)定結(jié)果（n=3）

3 討論

3.1 溶劑的選擇

DIPEA易溶于醇、醚等有機(jī)溶劑，甲醇作為空白溶劑時(shí)對(duì)測(cè)定有干擾。更換乙腈作為溶劑，不干擾測(cè)定，故選用乙腈作為DIPEA有關(guān)物質(zhì)檢查的溶劑。

3.2 方法選擇

取2.2項(xiàng)下對(duì)照品溶液、供試品溶液、0.5 %對(duì)照溶液（精密量取供試品溶液0.5 ml，置100 ml量瓶中，加乙腈稀釋并定容至刻度，搖勻），按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，分別采用面積歸一法，自身對(duì)照法及外標(biāo)法計(jì)算二異丙胺含量，其他單雜及總雜結(jié)果見表3。

表3 不同方法樣品測(cè)定結(jié)果

由表3可見，3個(gè)方法的結(jié)果相近，最終確定已知雜質(zhì)二異丙胺含量按外標(biāo)法計(jì)算，其他單雜及總雜含量按面積歸一法計(jì)算。

3.3 限度討論

根據(jù)各批樣品檢驗(yàn)結(jié)果，DIPEA中二異丙胺限度同最大單雜限度均定為0.15 %，總雜質(zhì)限度定為0.5 %。

3.4 小結(jié)

方法學(xué)驗(yàn)證和樣品測(cè)定結(jié)果表明，建立的色譜方法分離度好、靈敏度高、操作簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確度好，可用于測(cè)定DIPEA中有關(guān)物質(zhì)的含量，能更好地控制DIPEA的產(chǎn)品質(zhì)量。