付群 張玲 龐幸 劉巖 韓蓉 楊嫣驪

作者簡介：付群（1987—），男，江西樟樹人，碩士。研究方向：公共衛(wèi)生、食品安全。

通信作者：楊嫣驪（1990—），女，江蘇蘇州人，本科。研究方向：藥品安全。E-mail： yangyanli@sipac.gov.cn。

摘 要：阿膠因其獨有的藥用價值在食品、藥品等領(lǐng)域中被廣泛應(yīng)用。市場上的阿膠類產(chǎn)品良莠不齊，市場監(jiān)管辨別真?zhèn)渭皳郊俚氖侄味酁閲宜幍涞臉?biāo)準(zhǔn)方法液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法，但該方法樣品處理復(fù)雜、檢測成本高、檢測靈敏度不足且易產(chǎn)生假陽性結(jié)果。本研究對分布于蘇州市工業(yè)園區(qū)的多家藥店的阿膠類產(chǎn)品進(jìn)行隨機(jī)取樣，用PCR檢測技術(shù)對其動物源性成分進(jìn)行檢測和分析，為市場監(jiān)管提供新的參考及思路。

關(guān)鍵詞：阿膠；動物源性成分；PCR技術(shù)；線粒體DNA

Analysis of PCR-Based Detection Results of Donkey-Hide Gelatin Health Products Sold in Suzhou Industrial Park

FU Qun1， ZHANG Ling2， PANG Xing1， LIU Yan3， HAN Rong4， YANG Yanli1*

（1.Suzhou Industrial Park Food and Drug Safety Inspection Unit， Suzhou 215000， China; 2.Suzhou Institute for Food Control， Suzhou 215000， China; 3.College of Pharmaceutical Sciences， Soochow University， Suzhou 215000， China; 4.Suzhou Prem Biotechnology Co.， Ltd.， Suzhou 215000， China）

Abstract： Donkey-hide gelatin is widely used in the fields of food and medicine because of its unique medicinal value. The ass hide glue products on the market are good and bad， most of the methods for market supervision to distinguish authenticity and adulteration are liquid chromatography-mass spectrometry， which is the standard method of national pharmacopoeia， but this method has some disadvantages， such as complex sample processing， high detection cost， low detection sensitivity and easy to produce false positive results. In this study， samples of donkey-hide products were collected from a number of pharmacies randomly distributed in Suzhou Industrial Park. The animal-derived ingredients of donkey-hide products were detected and analyzed by PCR， which provided provide new reference and train of thought for market supervision.

Keywords： donkey-hide gelatin; animal-derived ingredients; PCR technology; mitochondrial DNA

阿膠是一種由馬科動物驢的皮熬制而成，具有藥用價值的滋補品。近年來，隨著食品衛(wèi)生健康規(guī)范的不斷改革，阿膠也逐漸從藥用方向轉(zhuǎn)向保健、食療等諸多方向。目前，市場上有藥用型阿膠生產(chǎn)批文的企業(yè)有數(shù)十家，有食用阿膠生產(chǎn)資質(zhì)的企業(yè)數(shù)量更多，致使阿膠市場異?；靵y。隨著市場對阿膠需求量的不斷增加，驢皮供不應(yīng)求，導(dǎo)致阿膠成本上漲。許多企業(yè)為了追求利益，在熬制阿膠的過程中摻入豬、牛、羊和馬等價格低廉的動物皮冒充驢皮，致使阿膠的藥用功效降低。

為了整頓阿膠市場，國家先后出臺了多種檢測標(biāo)準(zhǔn)，如《阿膠補血口服液中牛皮源成分檢查項補充檢驗方法》（BJY 201805）、《阿膠補血膏中牛皮源成分檢查項補充檢驗方法》（BJY 201804）等，以上標(biāo)準(zhǔn)檢驗方法及目前中國藥典2020版均采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)為檢測手段，以液相色譜為分離系統(tǒng)，質(zhì)譜為檢測系統(tǒng)，通過不同物種的特征肽鑒別阿膠產(chǎn)品的動物源性[1-2]。該技術(shù)所需的質(zhì)譜儀多為國外進(jìn)口，價格昂貴，且需配套的高效液相色譜儀、氮氣（發(fā)生器）、不間斷電源、樣本前處理裝置（離心機(jī)、氮吹儀、固相萃取裝置、通風(fēng)柜等）以及獨立、通風(fēng)、室溫和濕度合適的實驗室空間，增加了實驗室的運行維護(hù)成本?；赑CR技術(shù)的分子生物學(xué)技術(shù)目前已被應(yīng)用于動物源性的鑒定，如食品檢測中的肉源摻假檢測、動物源中藥材等。本研究采用多重PCR檢測方法（專利號：201810482987.3；201810016749.3），以牛、羊、豬、馬、驢、雞、鴨、狗、鼠、狐貍和兔這11種肉源線粒體DNA（Mitochondrial DNA，mtDNA）為檢測靶基因[3-4]，對分布于蘇州市工業(yè)園區(qū)的50家藥店在售的56個阿膠類商品隨機(jī)取樣并進(jìn)行多重篩查檢測，對篩查結(jié)果陽性的樣品通過單重PCR的國標(biāo)或?qū)＠椒ㄟM(jìn)行進(jìn)一步復(fù)檢確認(rèn)。本文研究了目前市場上阿膠產(chǎn)品質(zhì)量狀況及常見摻假肉源種類，為市場監(jiān)管部門提供新的檢測方法和監(jiān)管思路。

1 材料與方法

1.1 儀器

普通聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）儀，杭州朗基科學(xué)儀器有限公司；凝膠成像儀，杭州朗基科學(xué)儀器有限公司；DYY-6C型電泳儀，北京六一儀器場；Nanodrop 2000/2000C分光光度計，Thermo scientific公司；微量移液器，德國Eppendorf公司。

1.2 試劑

DNA提取試劑（PCR級柱式動物線粒體DNAout）盒，天恩澤基因科技有限公司；TAE（50×）凝膠電泳液，BioSharp公司；瓊脂糖，BIOWEST維百奧生物科技公司；本研究所用引物均購自GENEWIZ生物科技有限公司；DreamTaq Green PCR Master Mix、GeneRuler 100 bp DNA ladder及DNA loading Dye，Thermo Scientific公司；SuperRed/GelRed核酸染料，BioSharp公司；PBS溶液，HyClone公司。

1.3 抽檢樣品

本次抽檢的阿膠制品分別來自蘇州市工業(yè)園區(qū)中金雞湖商務(wù)區(qū)、獨墅湖科創(chuàng)區(qū)、陽澄湖度假區(qū)以及高端貿(mào)易制造區(qū)的50家藥店，共計56份阿膠產(chǎn)品，其中口服液制品8例，膠漿制品11例，其余均為固態(tài)顆粒、片劑、板狀和膏制品。

1.4 樣品前處理與核酸提取

塊狀樣品：取1 g樣品，研磨成粉末狀，放入離心管，加入600 μL PBS緩沖液，60 ℃水浴30 min，12 000 r·min-1離心1 min，吸取上清1 μL作為PCR模板。顆粒狀樣品：取1 g樣品放入離心管，加入600 μL PBS緩沖液，60 ℃水浴30 min，12 000 r·min-1離心1 min，吸取上清1 μL作為PCR模板。阿膠漿、口服液類樣品：取2個2 mL離心管，每管中分別加入1.5 mL樣品，12 000 r·min-1離心1 min。將上清液轉(zhuǎn)移至吸附柱并離心，廢棄收集管中液體，重復(fù)多次，直至3 mL樣品全部經(jīng)吸附柱處理。將吸附柱置于1.5 mL離心管中，加入50 μL 65～80 ℃預(yù)熱的TE洗脫液進(jìn)行洗脫，室溫放置2 min，12 000 r·min-1離心1 min，管底沉淀即為提取的核酸。

1.5 多重PCR體系對阿膠產(chǎn)品中的肉源篩查

本研究采用前期構(gòu)建的多重PCR方法對阿膠進(jìn)行初篩，該多重PCR方法由四重PCR和八重PCR雙聯(lián)合多重體系組成，可以檢測樣品中是否含有牛、羊、豬、馬、驢、雞、鴨、狗、鼠、狐貍和兔共

11種肉源性成分，具體引物及檢測方法等參照文獻(xiàn)內(nèi)容[3-4]。多重PCR檢測是為了篩選出除驢以外的肉源成分，再采用單重PCR檢測進(jìn)一步驗證。

2 結(jié)果與分析

2.1 單重PCR驗證

對樣品中出現(xiàn)牛、羊、豬、馬和驢5種動物源阿膠產(chǎn)品，通過單重PCR國家標(biāo)準(zhǔn)方法及相關(guān)專利方法對檢測結(jié)果進(jìn)一步驗證，其中，豬、牛、羊按照《肉類罐頭中牛、羊、豬、雞、鴨源性成分檢測方法PCR法》（QB/T 5505—2020）進(jìn)行測定。由于阿膠加工過程中核酸的分解導(dǎo)致核酸濃度大幅降低，單重PCR驗證階段對所有樣品均進(jìn)行兩輪PCR反應(yīng)，第1輪PCR旨在放大樣品核酸中靶標(biāo)DNA序列分子，經(jīng)電泳分析篩選出部分動物源性DNA載量較大的樣品，然后以第1輪的PCR產(chǎn)物為模板對此輪未檢出條帶的樣品繼續(xù)進(jìn)行第2輪PCR反應(yīng)，第2輪反應(yīng)結(jié)束后再進(jìn)行電泳凝膠結(jié)果分析，具體引物及產(chǎn)物如表1所示，相關(guān)PCR反應(yīng)程序如表2～表5所示。

2.2 樣品檢測結(jié)果

56份檢測樣品中，10份樣品檢測結(jié)果低于最低檢測限，未能檢出常見肉源成分，占樣品總量17.8%；10份樣品檢出了驢源性成分，其中僅1份樣品為單一的驢源性成分；其余36份樣品均未檢出驢源性成分。9份樣品不僅檢出了驢源性成分，還檢出了牛、馬、豬和羊中的1種或多種肉源成分，占樣品總量16.1%。36份樣品檢出了牛、馬、豬、羊中的

1種或多種肉源成分，占樣品總量64.3%。本研究中首先采用多重PCR方法檢測樣品中是否含有牛、羊、豬、馬、驢、雞、鴨、狗、鼠、狐貍和兔共11種肉源性成分[3-4]，采用多重PCR技術(shù)是為了高效篩選出樣品中是否含有除驢以外的肉源成分，多重PCR擴(kuò)增產(chǎn)物通過凝膠電泳中電泳條帶的大小判斷肉源種類，圖1為部分樣品多重PCR電泳結(jié)果。為進(jìn)一步驗證多重PCR檢測結(jié)果，再采用《肉類罐頭中牛、羊、豬、雞、鴨源性成分檢測方法 PCR法》（QB/T 5505—2020）中單重PCR檢測方法進(jìn)一步驗證多重PICR檢測結(jié)果，單重驗證PCR代表性電泳結(jié)果如圖2所示，檢測結(jié)果統(tǒng)計分析如表6～表8所示。

泳道M是100 bp GeneRuler，0是陰性對照，1或2為樣品檢測結(jié)果。圖A泳道1～2為牛；圖B泳道1中的兩個條帶為豬和牛；圖C為豬；圖D泳道1～2為驢；圖E為馬/馬騾。

3 結(jié)論

阿膠是市場上常見的動物源中藥，中國藥典規(guī)定阿膠必須由驢皮熬制而成。阿膠在加工過程中要經(jīng)歷高溫熬制等一系列加工步驟，導(dǎo)致阿膠中DNA含量大幅降低[6]。本研究基于3方面的考慮選擇了靶基因為mtDNA的PCR檢測方法：mtDNA基因包含不同物種之間的高DNA變異和同一物種個體之間的低DNA變異，可區(qū)分肉類物種[7]；肌肉中線粒體拷貝數(shù)高，如單個骨骼肌細(xì)胞中約有3 500個線粒體拷貝數(shù)[8]；線粒體為環(huán)狀閉合DNA，不易被破壞[9]。因此基于mtDNA的PCR檢測可有效提高樣品的檢出率。

為了全面了解目前阿膠產(chǎn)品可能出現(xiàn)的摻假動物源，本研究首先選用了“公共引物”介導(dǎo)的多重PCR技術(shù)，以狗、雞、牛、豬、馬、驢、狐貍、兔子、鼠、鴨、羊這11種肉源的線粒體DNA作為檢測靶標(biāo)，對56個檢測樣品進(jìn)行初篩。多重PCR方法可一次性鑒別多種目標(biāo)成分，與傳統(tǒng)的單重PCR方法相比，極大地節(jié)約了檢測時間和實驗試劑，降低了檢測成本。為進(jìn)一步確認(rèn)多重PCR檢測結(jié)果，通過單重PCR的國標(biāo)或?qū)＠椒▽Τ鹾Y陽性樣品進(jìn)行第2輪復(fù)檢。檢測結(jié)果顯示，56份阿膠樣品中有

45份檢出牛、豬、羊、馬/馬騾1種或多種其他動物源性成分，主要是牛和豬，其次為羊和馬/馬騾。由于檢測靶標(biāo)為mtDNA，本研究采用的檢測方法不能對馬和馬騾進(jìn)行區(qū)分。此外，本研究56個樣品中，有10個樣品未能有效檢出動物源性成分，表明阿膠制作過程中的DNA降解會使以DNA為靶標(biāo)的相關(guān)分子檢測方法受到限制。

目前，《中華人民共和國藥典》2020年版采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法作為阿膠中動物源性成分檢測的主要手段。其檢測對象為不同物種的特征肽，在動物源性的檢測中需要參比物進(jìn)行峰形對照[10]。而PCR類檢測方法則直接從DNA序列入手，通過特異引物對各物種特異性的一段序列大量擴(kuò)增，檢測靈敏度高于液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)，且無須參比物進(jìn)行對照，排除了外源假陽性尤其是驢動物源性的可能。因此，兩種分別基于特征肽和DNA的檢測方法的檢測結(jié)果可以相互印證。雖然基于PCR技術(shù)的分子生物學(xué)技術(shù)可應(yīng)用于動物源中藥材的種屬鑒定，但針對DNA序列的PCR類檢測方法尚無阿膠產(chǎn)品動物源摻假的法定檢測方法，本研究結(jié)果仍需進(jìn)一步采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用方法進(jìn)行確認(rèn)。建議將用于食品肉源鑒定PCR國家標(biāo)準(zhǔn)方法納入阿膠產(chǎn)品法定檢測方法的補充，打擊阿膠產(chǎn)品摻假行為，維護(hù)消費者的利益。

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