劉單單 蘇妙貞 梁穎思 楊丹婷 丁清龍

基金項(xiàng)目：廣東省市場(chǎng)監(jiān)督管理局科技計(jì)劃項(xiàng)目（2021ZS03）。

作者簡(jiǎn)介：劉單單（1990—），女，河南商丘人，碩士，工程師。研究方向：食品安全與檢測(cè)技術(shù)。

通信作者：丁清龍（1990—），男，河北滄州人，碩士，工程師。研究方向：食品安全檢測(cè)。E-mail：1129749459@qq.com。

摘 要：目的：參加英國(guó)FAPAS分析實(shí)驗(yàn)室組織的能力驗(yàn)證，了解驗(yàn)證并提高實(shí)驗(yàn)室對(duì)于特定項(xiàng)目的檢測(cè)能力。方法：依據(jù)組織方提供的試樣說(shuō)明書(shū)處理試樣，分別參照雞肉、馬肉、羊肉、豬肉的檢測(cè)相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，全程采用人員比對(duì)方式，雞源性成分同時(shí)采用方法比對(duì)的方式，對(duì)檢出的源性成分進(jìn)行測(cè)序并在NCBI上對(duì)測(cè)出序列結(jié)果進(jìn)行比對(duì)。結(jié)果：在試樣（29106）中分別檢出馬源性成分和豬源性成分，經(jīng)測(cè)序比對(duì)與檢出源性成分一致。結(jié)論：本次實(shí)驗(yàn)室能力驗(yàn)證結(jié)果為滿意，可為同類檢測(cè)機(jī)構(gòu)提供參考。

關(guān)鍵詞：牛肉；能力驗(yàn)證；動(dòng)物源性成分；人員比對(duì)

Analysis of the Detection Results of Chicken， Horse Meat， Lamb and Pork Components in FAPAS Beef Samples

LIU Dandan， SU Miaozhen， LIANG Yingsi， YANG Danting， DING Qinglong*

（Guangdong Institute of Food Inspection， Guangzhou 510435， China）

Abstract： Objective： To participate in the proficiency testing organized by the UK FAPAS analytical laboratory， understand the validation and improve the laboratorys testing capabilities for specific projects. Method： Process the samples according to the sample instructions provided by the organizer， and refer to the relevant testing standards for chicken， horse meat， lamb， and pork. Personnel comparison is used throughout the process. Chicken derived ingredients are also compared using method comparison， and the detected source ingredients are sequenced and compared on NCBI. Result： Horse derived components and pig derived components were detected in this sample （29106）， and they were consistent with the detected source components through sequencing comparison. Conclusion： The results of this laboratory capability verification are satisfactory and can provide reference for similar testing institutions.

Keywords： beef; capability verification; animal derived ingredients; personnel comparison

近年來(lái)關(guān)于食品中肉類制品摻假的報(bào)道層出不窮，例如引起全球關(guān)注的歐洲馬肉事件，及國(guó)內(nèi)報(bào)道出的其他動(dòng)物源性摻假事件等[1]，肉制品摻假越來(lái)越引起人們對(duì)食品安全的關(guān)注。隨著技術(shù)的發(fā)展，分子檢測(cè)技術(shù)也越來(lái)越多地應(yīng)用到動(dòng)物源性成分的檢測(cè)，尤其是各種實(shí)時(shí)熒光PCR，可對(duì)樣品進(jìn)行定性或定量檢測(cè)[2]；近年來(lái)，新型核酸檢測(cè)技術(shù)的廣泛應(yīng)用，如環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（Loop-Mediated Isothermal Amplification，LAMP）、微流控芯片、分子信標(biāo)技術(shù)等，使得快速恒溫以及高通量檢測(cè)動(dòng)物源性成分成為可能[3-6]。DNA分子生物學(xué)方法為目前首選的用于肉制品源性成分鑒定的方法，其中應(yīng)用最廣泛的是實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)[7-8]。能力驗(yàn)證是體現(xiàn)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)能力和實(shí)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制的有效手段[9]，參加能力驗(yàn)證對(duì)于持續(xù)提高實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)能力和質(zhì)量控制水平具有重要意義。廣東省食品檢驗(yàn)所連續(xù)兩年參加了食品中動(dòng)物源性成分生物鑒定，分別于2022年5月參加了中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院測(cè)試評(píng)價(jià)中心（Analysis Capability Assessment System of Chinese Academy of Inspection & Quarantine，ACAS）組織的食品中牛、羊、豬、馬源性成分檢測(cè)能力驗(yàn)證ACAS-PT1397（2022）[10]和2023年2月參加了英國(guó)FAPAS（Food Analysis Performance Assessment Scheme）組織的食品中雞肉、馬肉、羊肉或者豬肉一或多個(gè)成分檢測(cè)能力驗(yàn)證FAPAS-29106（2023）?，F(xiàn)將2023年FAPAS Proficiency Test 29106的能力驗(yàn)證情況報(bào)告如下，并對(duì)兩年的能力驗(yàn)證結(jié)果進(jìn)行分析討論，以期為同類檢測(cè)機(jī)構(gòu)提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

ME203天平（美國(guó)梅特勒-托利多科技有限公司）；AB2-3S1生物安全柜（新加坡ESCO公司）；Nano核酸蛋白分析儀（日本島津企業(yè)管理有限公司）；CFX-96實(shí)時(shí)熒光PCR儀（美國(guó)伯樂(lè)公司）；T100-PCR儀（美國(guó)伯樂(lè)公司）；Sub-cell GT電泳儀（美國(guó)伯樂(lè)公司）；GelDoc XR+凝膠成像儀（美國(guó)伯樂(lè)公司）；Quant Studio 6 Flex實(shí)時(shí)熒光PCR儀（美國(guó)賽默飛世爾科技公司）；Centrifuge 5430離心機(jī)（德國(guó)艾本德公司）。

DNA提取試劑盒（德國(guó)QIAGEN公司）；Premix Ex TaqTM（Probe qPCR）（日本TaKaRa公司）；Premix Ex Taq（日本TaKaRa公司）；羊源性成分檢測(cè)試劑參照標(biāo)準(zhǔn)SN/T 2051—2008，選用試劑為Real Time PCR Ovine DNA Detection Kit（日本TaKaRa公司）；內(nèi)參基因、豬源性成分的上游引物、下游引物及探針按照SN/T 3730.8—2013提供的序列信息合成；內(nèi)參基因（或需要檢測(cè)）、雞源性成分的上游引物、下游引物、探針（或有）按照SN/T 2978—2011和GB/T 38164—2019提供的序列信息合成；馬源性成分的上游引物、下游引物、探針按照SN/T 3730.5—2013提供的序列信息合成。以上序列信息合成和PCR產(chǎn)物測(cè)序均由生工生物工程上海股份有限公司完成。

1.2 樣品來(lái)源

英國(guó)FAPAS分析實(shí)驗(yàn)室能力驗(yàn)證樣品（FAPAS Proficiency Test 29106），牛肉（凍干）試驗(yàn)材料1份，塑料瓶裝，重約20 g；陽(yáng)性樣品為市場(chǎng)上購(gòu)買的雞肉、馬肉、羊肉和豬肉，陰性樣品為牛源性標(biāo)準(zhǔn)品；實(shí)驗(yàn)用水為無(wú)菌ddH2O。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

雞源性成分檢測(cè)參照SN/T 2978—2011和

GB/T 38164—2019；馬源性成分檢測(cè)參照

SN/T 3730.5—2013；羊源性成分檢測(cè)試劑和方法參照標(biāo)準(zhǔn)SN/T 2051—2008；豬源性成分檢測(cè)參照

SN/T 3730.8—2013；樣品前處理參照組織方提供的試樣說(shuō)明書(shū)。全程采用人員比對(duì)（檢驗(yàn)員A和檢驗(yàn)員B），部分源性成分采用方法比對(duì)的方式。根據(jù)各標(biāo)準(zhǔn)要求，對(duì)各對(duì)照結(jié)果進(jìn)行判定。

1.3.1 NDA提取和檢驗(yàn)過(guò)程質(zhì)量控制

按照組織方提供的試樣說(shuō)明書(shū)處理試樣后，均勻稱取約200 mg的試樣于1.5 mL離心管中，制備3份平行樣，并取2份牛源性標(biāo)準(zhǔn)品作為提取陰性對(duì)照，另取200 mL無(wú)菌水作為提取過(guò)程控制的空白對(duì)照，這兩種對(duì)照全程參與試樣提取，參照德國(guó)QIAGEN DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行提取并測(cè)定DNA濃度。試劑空白對(duì)照即用水代替模板；參與比對(duì)人員分別在不同的實(shí)驗(yàn)室取樣提取，以防止交叉污染。

1.3.2 提取DNA質(zhì)量測(cè)定

采用核酸蛋白儀測(cè)定所提取DNA的濃度和純度（OD260/OD280），將DNA濃度統(tǒng)一用無(wú)菌水稀釋至50 ng·μL-1進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，并于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 雞源性成分PCR擴(kuò)增

按標(biāo)準(zhǔn)方法GB/T 38164—2019，用Quant Studio 6 Flex實(shí)時(shí)熒光PCR儀進(jìn)行雞源性內(nèi)參照成分檢測(cè)。25 μL總反應(yīng)體系包括12.5 μL的2×premix、上下引物（10 μmoL·L-1）各0.5 μL、探針（10 μmoL·L-1）

0.5 μL、提取的模板DNA 5 μL及ddH2O 6 μL。反應(yīng)條件為95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40個(gè)循環(huán)，在每次循環(huán)的退火時(shí)收集熒光。

按標(biāo)準(zhǔn)方法SN/T 2978—2011，用T100-PCR儀進(jìn)行雞源性成分方法比對(duì)檢測(cè)。25 μL總反應(yīng)體系包括2×PCR緩沖液12.5 μL、dNTPs（2 mmol·L-1）

5 μL、上下引物對(duì)（10 nmol·L-1）各0.5 μL、DNA聚合酶（1 U·μL-1）1 μL、提取的模板DNA 5 μL及ddH2O

0.5 μL。反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性1 min，94 ℃變性45 s，63 ℃退火40 s，72 ℃延伸45 s，35個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳檢測(cè)：稱取1.5 g瓊脂糖于100 mL電泳級(jí)沖液中，加熱，充分溶化后，加入染色劑至終濃度為0.5 μg·mL-1制膠，在電泳槽中加入電泳級(jí)沖液，使液面剛剛沒(méi)過(guò)凝膠。將8 μL各PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分別和3 μL加樣緩沖液混合，點(diǎn)樣。

9 V·cm-1恒壓，電泳至染色指示劑遷移至凝膠中部。凝膠成像儀下觀察電泳結(jié)果并記錄。

1.3.4 馬源性成分實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增

按標(biāo)準(zhǔn)方法SN/T 3730.5—2013，用CFX-96實(shí)時(shí)熒光PCR儀進(jìn)行馬源性成分檢測(cè)。25 μL總反應(yīng)體系包括12.5 μL的2×premix、上下引物（10 μmoL·L-1）各1 μL、10 μmoL·L-1探針1 μL、提取的模板DNA

2 μL及ddH2O 7.5 μL。反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性1 min，

1個(gè)循環(huán)；94 ℃變性34 s，60 ℃退火延伸45 s，40個(gè)循環(huán)，60 ℃收集熒光。

1.3.5 羊源性成分實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增

按標(biāo)準(zhǔn)方法SN/T 2051—2008，用CFX-96實(shí)時(shí)熒光PCR儀進(jìn)行羊源性成分檢測(cè)，25 μL總反應(yīng)體系包括2×羊源性檢測(cè)預(yù)混液12.5 μL、羊源性檢測(cè)引物混合液（10 μmoL·L-1）1 μL、羊源性檢測(cè)探針混合液（10 μmoL·L-1）1 μL、提取的模板DNA 2 μL及ddH2O 8.5 μL。反應(yīng)條件為95 ℃/10 s，1個(gè)循環(huán)；95 ℃/5 s，60 ℃/30 s，40個(gè)循環(huán)，在每次循環(huán)的退火時(shí)收集熒光。

1.3.6 豬源性成分實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增

按標(biāo)準(zhǔn)方法SN/T 3730.8—2013，用Quant Studio 6 Flex實(shí)時(shí)熒光PCR儀進(jìn)行豬源性成分檢測(cè)。

25 μL總反應(yīng)體系包括12.5 μL的2×premix、上下引物

（10 μmoL·L-1）各1 μL、10 μmoL·L-1探針1 μL、提取的模板DNA 2 μL及ddH2O 7.5 μL。反應(yīng)條件為

50 ℃/2 min，95 ℃/10 min；45個(gè)循環(huán)為95 ℃/15 s，58 ℃/1 min，在每次循環(huán)的退火時(shí)收集熒光。

1.3.7 測(cè)序

當(dāng)PCR檢出可疑陽(yáng)性時(shí)，對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行DNA測(cè)序。

2 結(jié)果與分析

2.1 試樣DNA提取質(zhì)量

檢驗(yàn)人員A取試樣29106（牛肉）3份，分別標(biāo)記為1-1、1-2、1-3，另取一份陰性樣品（牛源性標(biāo)準(zhǔn)品）標(biāo)記為NC1；檢驗(yàn)人員B另取試樣29106（牛肉）3份，分別記為2-1、2-2、2-3，另取一份陰性樣品（牛源性標(biāo)準(zhǔn)品）標(biāo)記為NC2。每組實(shí)驗(yàn)過(guò)程中設(shè)置空白對(duì)照（KB）、提取對(duì)照（TK）、陽(yáng)性對(duì)照（PC）。每組試樣提取DNA后經(jīng)核酸蛋白分析儀檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)表1。經(jīng)測(cè)定試樣OD260/OD280值，比值均處于1.8～2.0，提取效果良好。

2.2 雞、馬、羊、豬源性成分檢測(cè)結(jié)果

試樣29106雞、馬、羊、豬源性成分檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表2。A、B兩位檢驗(yàn)員檢測(cè)雞源性成分的實(shí)時(shí)熒光PCR見(jiàn)圖1和圖2，可知兩人檢測(cè)結(jié)果一致，均為未檢出雞源性成分。在雞源性成分的檢測(cè)中同時(shí)用到SN/T 2978—2011進(jìn)行檢測(cè)，通過(guò)電泳結(jié)果（圖3）可知與實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)結(jié)果一致。

A、B兩位檢驗(yàn)員檢測(cè)馬源性成分的實(shí)時(shí)熒光PCR見(jiàn)圖4和圖5，可知兩人檢測(cè)結(jié)果一致，均檢出馬源性成分。A、B兩位檢驗(yàn)員檢測(cè)羊源性成分的實(shí)時(shí)熒光PCR見(jiàn)圖6和圖7，可知兩人檢測(cè)結(jié)果一致，均未檢出羊源性成分。A、B兩位檢驗(yàn)員檢測(cè)豬源性成分的實(shí)時(shí)熒光PCR見(jiàn)圖8和圖9，可知兩人檢測(cè)結(jié)果一致，均檢出豬源性成分。

2.3 檢出源性成分測(cè)序結(jié)果

將檢測(cè)出豬源性成分和馬源性成分的PCR產(chǎn)物送至生工生物工程上海股份有限公司廣州分公司進(jìn)行測(cè)序。將馬源性測(cè)序結(jié)果序列與SN/T 3730.5—2013附錄A中序列比對(duì)，同源性為100%，并將測(cè)序結(jié)果序列上傳到NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行比對(duì)，比對(duì)結(jié)果為馬源性成分；將豬源性測(cè)序結(jié)果序列與

B/T 38164—2019附錄A中序列比對(duì)，同源性為97%，并將測(cè)序結(jié)果序列上傳到NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行比對(duì)，比對(duì)結(jié)果為豬源性成分。

3 結(jié)論

根據(jù)FAPAS公布的能力驗(yàn)證結(jié)果，實(shí)驗(yàn)室此次能力驗(yàn)證結(jié)果為“滿意”。為保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，本次能力驗(yàn)證全程用人員比對(duì)的方式進(jìn)行，并在不同的實(shí)驗(yàn)室取樣和提取試樣核酸，有效防范了取樣和提取過(guò)程中的交叉污染，避免了檢測(cè)結(jié)果異常情況的出現(xiàn)[11]。同時(shí)，在雞源性成分的檢測(cè)中加入方法比對(duì)的方式，兩種方法結(jié)果一致，進(jìn)一步證明了檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。對(duì)檢出的豬源性、馬源性成分分別進(jìn)行了測(cè)序，比對(duì)結(jié)果良好，均與檢出的源性成分相一致。

本實(shí)驗(yàn)室在2022年5月參加了ACAS組織的食品中牛、羊、豬、馬源性成分檢測(cè)能力驗(yàn)證ACAS-PT1397（2022），與之相比，此次檢測(cè)中增加了人員比對(duì)、方法比對(duì)和測(cè)序比對(duì)的方式，兩次能力驗(yàn)證結(jié)果均為“滿意”，由此可見(jiàn)本實(shí)驗(yàn)室在分子技術(shù)方面有較高的成熟度。

隨著人們生活水平的不斷提高，肉類摻假問(wèn)題也越來(lái)越備受關(guān)注，分子檢測(cè)技術(shù)已成分第三方檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室不可或缺的一部分。此次能力驗(yàn)證采用多種方式進(jìn)行，不僅保證了結(jié)果的準(zhǔn)確性，也對(duì)實(shí)驗(yàn)室整體綜合能力進(jìn)行了驗(yàn)證，包括人員能力、技術(shù)方法等。隨著檢測(cè)技術(shù)的不斷發(fā)展，實(shí)驗(yàn)室在能力驗(yàn)證、盲樣考核等方面，可選擇不同的方式方法，采用新技術(shù)、新手段以不斷提升實(shí)驗(yàn)室的綜合能力。本次能力驗(yàn)證采用的各方面技術(shù)為第三方檢測(cè)機(jī)構(gòu)的能力考核提供了重要參考價(jià)值。

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