丁清龍 楊丹婷 謝愛華 韋云 陳秀芬 周露

基金項(xiàng)目：國家市場(chǎng)監(jiān)督管理總局科技計(jì)劃項(xiàng)目（2019MK057）；廣東省市場(chǎng)監(jiān)督管理局科技計(jì)劃項(xiàng)目（2021ZS03）。

作者簡介：丁清龍（1990—），男，河北滄州人，碩士，工程師。研究方向：食品安全檢測(cè)。

通信作者：周露（1982—），女，河南洛陽人，博士，正高級(jí)工程師。研究方向：食品安全檢測(cè)。E-mail：zhoulu1982@sohu.com。

摘 要：目的：建立肉類食品中動(dòng)物源性成分非靶向篩查方法。方法：基于宏基因組測(cè)序技術(shù)建立肉類食品中動(dòng)物源性成分非靶向篩查方法，將該方法用于模擬樣品和實(shí)際樣品檢測(cè)，并用現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法對(duì)實(shí)際樣品檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行確認(rèn)。結(jié)果：模擬樣品檢測(cè)結(jié)果與模擬情況一致；在實(shí)際樣品中檢出與樣品名稱不一致或樣品標(biāo)簽未標(biāo)識(shí)的動(dòng)物源性成分，且非靶向篩查方法檢測(cè)結(jié)果與現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)方法檢測(cè)結(jié)果一致。結(jié)論：該方法可以快速鎖定樣品中未知的動(dòng)物源性成分，檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確可靠，可為政府打擊肉類食品摻假提供更為有力的技術(shù)支撐。

關(guān)鍵詞：宏基因組測(cè)序；動(dòng)物源性成分；非靶向；摻假

Determination of Animal-Derived Ingredients in Meat Products by Non-Targeted Screening Method Based on Metagenomic Sequencing Technology

DING Qinglong， YANG Danting， XIE Aihua， WEI Yun， CHEN Xiufen， ZHOU Lu*

（Guangdong Institute of Food Inspection， Guangzhou 510435， China）

Abstract： Objective： To establish the non-targeted screening method for animal-derived ingredients in meat products. Method： The non-targeted screening method for animal-derived ingredients in meat products was established based on metagenomic sequencing technology. The method was applied to the determination of simulated samples and actual samples， and the results of actual samples were confirmed by existing standard determination methods. Result： The determination results of simulated samples were consistent with design of simulated samples. The animal-derived ingredients inconsistent with sample name or label identification were detected in actual samples， and the results of non-targeted screening method and existing standard methods were consistent. Conclusion： This method could quickly test the unknown animal-derived ingredients of samples， and the determination results were accurate and reliable. It could provide more powerful technical support to combat meat adulteration for the government.

Keywords： metagenomic sequencing technology; animal-derived ingredients; non-targeted; adulteration

肉類食品是人們餐桌必備的主要食品之一，常見的高經(jīng)濟(jì)價(jià)值的肉類食品有牛肉、羊肉及其制品等。但受經(jīng)濟(jì)利益驅(qū)動(dòng)，肉類食品中摻雜使假、以次充好事件頻繁發(fā)生。例如，歐洲市場(chǎng)的“馬肉風(fēng)波”，以鴨肉代替牛羊肉的“假羊肉串”“假牛肉干”“假肥牛片”等[1]。這種摻假行為不僅侵害了消費(fèi)者的權(quán)益，擾亂市場(chǎng)，更降低了消費(fèi)者對(duì)相關(guān)部門肉類食品監(jiān)管的信任度。

我國現(xiàn)行有效的肉類食品動(dòng)物源性成分檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)僅能進(jìn)行單一成分的定向檢測(cè)。但隨著監(jiān)管力度的加大，肉類食品摻假物種的種類向多元化方向發(fā)展，樣品摻假的物種及物種數(shù)目存在很大的不確定性。單一成分的定性檢測(cè)極易造成漏檢導(dǎo)致假陰性，給肉類食品市場(chǎng)監(jiān)管帶來巨大挑戰(zhàn)。因此，急需建立肉類食品中動(dòng)物源性成分非靶向篩查方法。

目前，可能實(shí)現(xiàn)動(dòng)物源性成分非靶向篩查的技術(shù)分為兩類：一類是基于質(zhì)譜、光譜等產(chǎn)生的“指紋”圖譜進(jìn)行鑒別[2-3]；一類是基于分子生物學(xué)的方法。“指紋”圖譜方法對(duì)基質(zhì)要求高，僅適用于未加工的肉類，同時(shí)該方法需要復(fù)雜的數(shù)學(xué)計(jì)算。在分子生物學(xué)方法中，多重PCR法和微流控芯片法可以實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品多個(gè)靶標(biāo)的同時(shí)檢測(cè)，但若樣品中含有實(shí)驗(yàn)用引物探針檢測(cè)靶標(biāo)之外的成分，仍會(huì)存在漏檢的情況[4-7]。將DNA條形碼技術(shù)與Sanger測(cè)序技術(shù)相結(jié)合，挑取多個(gè)細(xì)菌克隆的方式具有很強(qiáng)的隨機(jī)性，該方法漏檢的可能性仍然很大[8]。而基于二代測(cè)序的宏基因組技術(shù)在鑒定土壤、糞便等含有混合微生物的樣品中菌種方面已得到廣泛應(yīng)用，該技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物中多種擴(kuò)增條帶的同時(shí)檢測(cè)，為基于宏基因組測(cè)序技術(shù)建立肉類食品中動(dòng)物源性成分非靶向篩查方法奠定基礎(chǔ)[9]。

本研究基于宏基因組測(cè)序技術(shù)建立肉類食品中動(dòng)物源性成分非靶向篩查方法，并將該方法用于模擬樣品和實(shí)際樣品檢測(cè)，以期為相關(guān)部門打擊肉類食品摻假提供可靠的技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

1.1.1 實(shí)驗(yàn)樣品

實(shí)驗(yàn)中用到的豬、水牛、黃牛、山羊、綿羊、雞、鴨、鵝、馬和驢等肉樣于農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)購買；牦牛、鼠、雀、鴕鳥、貂、駱駝、乳鴿、貓、雉雞、鴿子和貉肉源從中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院獲得；香辣味牛肉粒、豬血豆腐、牛排等樣品于超市購買；餐館牛肉和羊肉串在餐飲店獲得。

1.1.2 儀器與試劑

T100 PCR儀（美國Bio-Rad公司），Biospec-nano核酸蛋白測(cè)定儀（日本島津公司），1300系列A2級(jí)別生物安全柜（美國Thermofisher公司），Sorvall? ST 8離心機(jī)（美國Thermofisher公司），Sub-cell GT核酸電泳儀（美國Bio-Rad公司），PowerPac Basic電泳儀電泳（美國Bio-Rad公司），GelDoc XR+凝膠成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司），QuantStudio 6 Flex熒光定量PCR儀（美國Thermofisher公司），Qubit 4.0熒光計(jì)（美國Thermofisher公司），MiSeq高通量測(cè)序儀（美國illumina公司）。

DNA提取試劑，DNeasy mericon Food Kit（QIAGEN，貨號(hào)69514）；DNA濃度檢測(cè)試劑盒，QubitTM 1×dsDNA HS Assay Kit（Invitrogen，貨號(hào)Q33231）；PCR擴(kuò)增試劑，PrimeSTAR? HS DNA Polymerase（Takara，貨號(hào)R010A）；基因文庫構(gòu)建試劑，NexteraR XT Index Kit 24 Indexes-96 samples（illumina，貨號(hào)15055293）；高通量測(cè)序試劑，PhiX Control Kit v3（illumina，貨號(hào)FC-110-3001）和MiSeq Reagent Micro Kit v2（300-cycles）（illumina，貨號(hào)FC-103-1002）；熒光PCR試劑，Takara Premix Ex Taq （Probe qPCR）（Takara，貨號(hào)RR390A）。

用于宏基因組測(cè)序的擴(kuò)增子上游引物COI-F序列（5-3）為TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGCTCAACYAATCAYAAAGATATYGGCAC，下游引物COF-R序列（5-3）為GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGGGYATNACTATRAAGAAAATTATTAC。該對(duì)引物由Illumina宏基因組測(cè)序引物和推薦性國家標(biāo)準(zhǔn)《動(dòng)物制品中動(dòng)物源性檢測(cè)基因條碼技術(shù) Sanger測(cè)序法》（GB/T 35918—2018）中的微型基因條碼引物合并而成。相關(guān)引物、探針合成及Sanger測(cè)序服務(wù)均委托生工生物（上海）股份有限公司完成。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物源性成分非靶向篩查方法的技術(shù)路線

動(dòng)物線粒體DNA上編碼細(xì)胞色素酶亞基I（COI）基因序列相對(duì)保守，不同種動(dòng)物的COI基因序列存在差異。本方法使用的擴(kuò)增子引物為通用引物，可以擴(kuò)增出不同種動(dòng)物的COI基因序列，技術(shù)路線如圖1所示。使用該擴(kuò)增子引物對(duì)樣品中的所有動(dòng)物源性成分進(jìn)行擴(kuò)增，利用宏基因組測(cè)序技術(shù)對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物中不同種動(dòng)物的COI基因序列進(jìn)行分析檢測(cè)，再將獲得的序列在基因數(shù)據(jù)庫（美國國家生物信息中心）中比對(duì)，從而實(shí)現(xiàn)樣品中動(dòng)物源性成分的非靶向檢測(cè)。

1.2.2 樣品DNA提取

按照商業(yè)化DNA提取試劑盒說明書的要求提取DNA。提取過程中設(shè)置提取對(duì)照，以滅菌去離子水代替樣品進(jìn)行DNA提取。

1.2.3 DNA濃度測(cè)定

取3.5 μL已提取的DNA樣品，采用核酸蛋白分析儀測(cè)定DNA濃度。

1.2.4 PCR擴(kuò)增及擴(kuò)增產(chǎn)物電泳檢測(cè)

采用25 μL PCR反應(yīng)體系，其中10×PCR反應(yīng)Buffer 2.5 μL、dNTP 2 μL、上下游引物各1 μL（引物濃度為10 μmol·L-1）及DNA模板25～100 ng，補(bǔ)充無菌雙蒸水至總體積為25 μL。

PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，51 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，40個(gè)循環(huán)；

72 ℃，10 min。

將5 μL擴(kuò)增產(chǎn)物與適量上樣緩沖液混合，用2%的瓊脂糖膠進(jìn)行電泳檢測(cè)。

1.2.5 基因文庫構(gòu)建

采用COI-F和COI-R為引物，以樣品DNA為模板，進(jìn)行第1輪PCR。25 μL反應(yīng)體系：模板

5 μL，5×Buffer 5 μL，dNTP 2 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，DNA聚合酶（高保真）0.2 μL，超純水10.8 μL。反應(yīng)程序：95 ℃，3 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃，5 min；4 ℃保存。采用磁珠法對(duì)第1輪擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化，以滅菌超純水重懸純化后的DNA。

再以純化后的DNA為模板，以Nextera○R XT Index Kit 24 Indexes-96 samples中的Index primer為引物，進(jìn)行第2輪PCR（接頭Index PCR）。25 μL反應(yīng)體系：模板2 μL，5×Buffer 5 μL，dNTP 2 μL，Index 1引物2.5 μL，Index 2引物2.5 μL，DNA聚合酶（高保真）0.2 μL，超純水12.8 μL。反應(yīng)程序：95 ℃，3 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，7個(gè)循環(huán)；72 ℃，5 min；4 ℃保存。采用磁珠法對(duì)第2輪擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化，以滅菌超純水重懸純化后的DNA，即為構(gòu)建好的基因文庫。

1.2.6 宏基因組測(cè)序

采用Qubit 4.0熒光計(jì)對(duì)構(gòu)建好的樣本基因文庫進(jìn)行定量，并將其稀釋至4 nmol·L-1。從每個(gè)稀釋好的文庫中取出5 μL DNA，混勻成為最終上機(jī)文庫。取5 μL混合好的文庫和5 μL 0.2 mol·L-1的NaOH，二者混合進(jìn)行文庫變性后，再向其中加入990 μL預(yù)冷的HT1溶液，得到20 pmol·L-1的變性文庫。取

20 pmol·L-1變性文庫210 μL，加入390 μL預(yù)冷的HT1溶液，得到終濃度為7 pmol·L-1的樣本變性文庫。制備終濃度為7 pmol·L-1的測(cè)序標(biāo)準(zhǔn)品PhiX的過程與上述操作一致。

將樣本變性文庫中摻入30%的PhiX，即420 μL終濃度為7 pmol·L-1的樣本變性文庫與180 μL終濃度為7 pmol·L-1的PhiX標(biāo)準(zhǔn)品變性文庫混合，得到最終上機(jī)樣本。將上機(jī)樣本加入測(cè)序試劑盒的樣本孔中，采用illumina Miseq測(cè)序儀上機(jī)測(cè)序。

1.2.7 測(cè)序數(shù)據(jù)分析

將下機(jī)數(shù)據(jù)中的FASTQ文件導(dǎo)入軟件中，使用CLC Genomics Workbench 21.0.5軟件Toolbox中的Trim工具包對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行剪切。然后使用Toolbox中的OTU clustering工具包，對(duì)剪切后的數(shù)據(jù)進(jìn)行拼接和OTU聚類，最后將OTU聚類得到的序列在美國國家生物信息中心數(shù)據(jù)庫（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast）中進(jìn)行比對(duì)。將比對(duì)結(jié)果為Cytochrome oxidase I基因且序列相似度≥95%的序列作為結(jié)果序列。

1.2.8 測(cè)序結(jié)果確認(rèn)

采用現(xiàn)有動(dòng)物源性成分檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)方法對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行確認(rèn)，其中牛源性成分和羊源性成分檢測(cè)采用《常見畜禽動(dòng)物源性成分檢測(cè)方法 實(shí)時(shí)熒光PCR法》（GB/T 38164—2019）；豬源性成分檢測(cè)采用《食品及飼料中常見畜類品種的鑒定方法 第8部分：豬成分檢測(cè) 實(shí)時(shí)熒光PCR法》（SN/T 3730.8—2013）；馬源性成分檢測(cè)采用《食品及飼料中常見畜類品種的鑒定方法 第5部分：馬成分檢測(cè) 實(shí)時(shí)熒光PCR法》（SN/T 3730.5—2013），雞源性成分檢測(cè)采用《動(dòng)物源性產(chǎn)品中雞源性成分PCR檢測(cè)方法》（SN/T 2978—2011）。

2 結(jié)果與分析

2.1 擴(kuò)增子引物通用性評(píng)價(jià)

提取豬、水牛、黃牛、山羊、綿羊、牦牛、雞、鴨、鵝、馬、驢、鼠、雀、鴕鳥、貂、駱駝、乳鴿、貓、雉雞、鴿子和貉等21個(gè)物種的DNA，分別以其為模板采用1.1.2中所述引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳，電泳結(jié)果見圖2。由圖2可以看出，21種動(dòng)物DNA的擴(kuò)增產(chǎn)物均為單一的條帶，條帶長度為227 bp，包括COI序列192 bp和M13測(cè)序引物35 bp。

將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行Sanger測(cè)序，利用NCBI數(shù)據(jù)庫對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果見表1。由表1可以看出，本方法所用引物（1.1.2中所述）對(duì)于測(cè)試的21種動(dòng)物DNA均可以擴(kuò)增出相應(yīng)物種的COI基因序列，且序列的相似度均在95%以上，說明該引物通用性良好。

1—豬DNA；2—水牛DNA；3—黃牛DNA；4—山羊DNA；5—綿羊DNA；6—牦牛DNA；7—雞DNA；8—鴨DNA；9—鵝DNA；10—馬DNA；11—驢DNA；12—鼠DNA；13—雀DNA；14—鴕鳥DNA；15—貂DNA；16—駱駝DNA；17—乳鴿DNA；18—貓DNA；19—雉雞DNA；20—鴿子DNA；21—貉DNA。

圖2 引物通用性評(píng)價(jià)電泳圖

2.2 樣品宏基因組測(cè)序及結(jié)果確認(rèn)

采用本研究建立的動(dòng)物源性成分非靶向檢測(cè)方法對(duì)在市場(chǎng)上獲得的7份實(shí)際樣品和3份實(shí)驗(yàn)室模擬樣品進(jìn)行檢測(cè)，10份樣品的樣品信息見表2。

提取10份樣品的DNA（DNA濃度見表2），按照1.1.2中所述引物進(jìn)行PCR獲得擴(kuò)增產(chǎn)物。采用Miseq高通量測(cè)序儀對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行宏基因組測(cè)序，將測(cè)序得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行拼接、過濾、去嵌合和OTU聚類獲得最終的結(jié)果序列。將測(cè)序結(jié)果序列在NCBI數(shù)據(jù)中進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果見表3。由表3可知，模擬樣品8檢出豬源性成分和黃牛源性成分，模擬樣品9檢出黃牛源性成分、雞源性成分、鴨源性成分，模擬樣品10檢出綿羊源性成分、雞源性成分、豬源性成分，檢測(cè)結(jié)果與實(shí)際摻入物種一致；而實(shí)際樣品1、樣品4、樣品5和樣品6除檢出與其樣品名稱相符的牛源性成分外，還檢出了豬源性成分、馬源性成分、雞源性成分等與樣品名稱不符或標(biāo)簽未標(biāo)識(shí)的成分；實(shí)際樣品2和樣品3除檢出與其樣品名稱相符的豬源性成分外，還檢出了雞源性成分。

為了驗(yàn)證本研究建立方法檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，采用現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)方法對(duì)實(shí)際樣品（1～7）的宏基因組測(cè)序結(jié)果（表3）進(jìn)行確認(rèn)，結(jié)果見表4。從表4中可以看出，采用宏基因組對(duì)7份實(shí)際樣品進(jìn)行非靶向檢測(cè)的結(jié)果與采用現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)方法的檢測(cè)結(jié)果一致。綜合模擬樣品檢測(cè)結(jié)果，說明本研究建立的食品中動(dòng)物源性成分非靶向檢測(cè)方法的檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

3 結(jié)論

肉類食品是人們餐桌必備的主要食品之一，但受經(jīng)濟(jì)利益驅(qū)動(dòng)，肉類食品中摻雜使假、以次充好事件頻繁發(fā)生。針對(duì)目前肉類食品動(dòng)物源性成分檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)僅能進(jìn)行單一成分的定向檢測(cè)而極易造成漏檢的問題，本研究建立了一種食品中動(dòng)物源性成分非靶向篩查方法，可以實(shí)現(xiàn)樣品中常見動(dòng)物源性成分的非定向同時(shí)檢測(cè)。應(yīng)用該方法對(duì)模擬樣品和實(shí)際樣品進(jìn)行檢測(cè)，模擬樣品檢測(cè)結(jié)果與模擬情況一致，且該方法對(duì)實(shí)際樣品檢測(cè)結(jié)果與現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)方法檢測(cè)結(jié)果一致，說明該方法準(zhǔn)確可靠。該方法可以快速鎖定樣品中未知的動(dòng)物源性成分，可為政府打擊肉類食品摻假提供有力的技術(shù)支撐。

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