王文婷 許耀威 白 倩 李治松

1）鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院，河南 鄭州450003 2）鄭州大學(xué)醫(yī)學(xué)科學(xué)院神經(jīng)科學(xué)研究所，河南 鄭州450000 3）鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院，河南 鄭州450052

神經(jīng)性疼痛（neuropathic pain，NP）由軀體感覺(jué)神經(jīng)系統(tǒng)的損傷或紊亂引起［1-3］。由于NP 伴隨持久而強(qiáng)烈的疼痛感，約47%的患者在病程中會(huì)出現(xiàn)情緒障礙［4-5］。NP的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，本課題組之前的研究表明前扣帶回皮質(zhì)（anterior cingulate cortex，ACC）結(jié)構(gòu)和功能的可塑性改變參與神經(jīng)病理性疼痛和情緒反應(yīng)［6］。

在大腦皮質(zhì)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)中，鈣離子/鈣調(diào)蛋白激酶Ⅱ（Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase Ⅱ，CaMKⅡ）的亞基CaMKⅡα對(duì)許多N-甲基-D-天冬氨酸受體依賴性興奮性突觸至關(guān)重要［7］，被廣泛用于標(biāo)記興奮性神經(jīng)元［8］。由合成抑制性神經(jīng)遞質(zhì)γ-氨基丁酸（gamma aminobutyric acid, GABA）的谷氨酸脫羧酶67（glutamic acid decarboxylase 67，GAD67）存在于神經(jīng)細(xì)胞中的各個(gè)部分［9-11］，對(duì)維持正常神經(jīng)功能具有重要貢獻(xiàn)，缺乏GAD67 的小鼠大腦GABA 水平降低約93%［12-13］，因此，GAD67 被廣泛用作GABA能神經(jīng)元的標(biāo)志物［14-15］。表達(dá)GAD67和CaMKⅡα的神經(jīng)元作為基本上獨(dú)立的群體存在［16-18］。有證據(jù)表明，在可卡因反復(fù)暴露模型中，前額葉皮質(zhì)中神經(jīng)元出現(xiàn)可塑性改變［19］。ACC中錐體神經(jīng)元與GABA能神經(jīng)元在NP 與情緒障礙中的作用尚未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。本研究旨在通過(guò)化學(xué)遺傳的方法對(duì)ACC 中CaMKⅡα+錐體神經(jīng)元和GAD67+GABA能神經(jīng)元進(jìn)行時(shí)空調(diào)控，探討NP與情緒障礙共病中不同類型神經(jīng)元發(fā)揮的重要作用，為NP 與焦慮、抑郁共病的治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物72 只健康清潔級(jí)SD 大鼠（220～250 g）由鄭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)：SCXK（豫）2017-0001。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組按隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組（Sham）、神經(jīng)病理性疼痛模型組（CCI）、神經(jīng)病理性疼痛模型+CaMKⅡα化學(xué)遺傳抑制病毒非激活組（CCI+hM4Di-）、神經(jīng)病理性疼痛模型+CaMKⅡα化學(xué)遺傳病毒激活組（CCI+hM4Di+）、神經(jīng)病理性疼痛模型+GAD67 化學(xué)遺傳抑制病毒非激活組（CCI+hM3Dq-）、神經(jīng)病理性疼痛模型+GAD67化學(xué)遺傳抑制病毒激活組（CCI+hM3Dq+），每組12只。

1.3 主要藥品與試劑CaMKⅡα鼠單克隆抗體（CST 公司，美國(guó)）、GAD67 兔單克隆抗體（Abcam 公司，美國(guó)）、c-Fos 鼠單克隆抗體（Abcam 公司，美國(guó)）、c-Fos兔單克隆抗體（Abcam公司，美國(guó)）、重組腺相關(guān)病毒（rAAV）-CaMKⅡα-hM4D（Gi）-EGFP-WPRE-pA（樞密公司，中國(guó)）、rAAV-GAD67（m）-DIO-hM3D（Gq）- EGFP-WPREs（樞密公司，中國(guó)）、rAAV-hSyn-CRE-WPRE-hGH pA（樞密公司，中國(guó)）。

1.4 動(dòng)物模型建立制備慢性坐骨神經(jīng)壓迫損傷（chronic constriction injury，CCI）模型［20］，模擬神經(jīng)病理性疼痛。4%的異氟烷/氧氣被用于麻醉誘導(dǎo)，2%用于麻醉維持。麻醉后常規(guī)消毒備皮，逐層切開(kāi)皮膚及皮下組織，鈍性分離肌肉，暴露坐骨神經(jīng)干，利用四根5-0可吸收縫線間隔1 mm松散結(jié)扎。假手術(shù)組僅暴露神經(jīng)，不結(jié)扎。

1.5 病毒注射與激活采用異氟烷麻醉后，大鼠的頭部被固定于立體定位儀。ACC 的位置相對(duì)于前囟：前-后1.35 mm，內(nèi)-外0.55 mm，背-腹2.25 mm。使用5 μL 的漢密爾頓注射器向?qū)?cè)ACC 注射500 nL的重組腺病毒（50 nL/min），勻速注射10 min，停針10 min。自CCI術(shù)后28 d開(kāi)始，每次行為學(xué)測(cè)定開(kāi)始前1 h，以每公斤體質(zhì)量3.3 mg 給予N-氧化氯氮平（clozapine N-oxide, CNO）調(diào)控特定類型神經(jīng)元的活性。

1.6 疼痛相關(guān)行為學(xué)測(cè)定按之前報(bào)道的方法［6］在造模前1 d及造模后3 d、7 d、14 d、21 d、28 d測(cè)定大鼠機(jī)械縮足閾值（paw withdrawal threshold，PWT）以及熱縮足潛伏期（paw withdrawal latency，PWL）。PWT的測(cè)定使用von Frey絲垂直于足底表面施加壓力5 s，連續(xù)刺激的間隔時(shí)間至少5 min。用Dixon的公式［21］計(jì)算50%縮足閾值。使用足底痛覺(jué)測(cè)量?jī)x測(cè)定PWL時(shí)，將大鼠放置于獨(dú)立且透明的測(cè)試箱中，設(shè)置儀器切斷時(shí)間為15 s，觀察并記錄大鼠受到熱刺激時(shí)快速抬足或舔足的時(shí)間，結(jié)果取3次均值。

1.7 焦慮、抑郁行為學(xué)測(cè)定

1.7.1 曠場(chǎng)試驗(yàn)（open field test，OFT）：OFT 是評(píng)估動(dòng)物焦慮情況最常用的實(shí)驗(yàn)方法之一［22］。提前將大鼠放入測(cè)試間內(nèi)適應(yīng)24 h，實(shí)驗(yàn)開(kāi)始時(shí)將將大鼠放在100 cm×100 cm×40 cm 盒子的一個(gè)空角落里，通過(guò)Smart v.3.0 記錄進(jìn)入中心區(qū)域的次數(shù)和在中心區(qū)域停留的時(shí)間，以及總運(yùn)動(dòng)距離。

1.7.2 新環(huán)境進(jìn)食抑制試驗(yàn)（novelty-suppressed feeding test, NSFT）：NSFT 被用來(lái)評(píng)估焦慮樣行為［23］。測(cè)試前大鼠禁食24 h，100 cm×100 cm×40 cm的盒子用作測(cè)試室，大鼠每次都被放置在同一個(gè)角落。在一張白色的正方形紙上，食物被放置在中心位置。測(cè)試時(shí)間持續(xù)10 min，記錄終點(diǎn)是在大鼠第一次咬到食物。如果10 min 內(nèi)未進(jìn)食，則不納入數(shù)據(jù)。

1.7.3 強(qiáng)迫游泳試驗(yàn)（forced swimming test, FST）：FST被用來(lái)評(píng)估抑郁程度［24］。將大鼠放在一個(gè)塑料圓筒中裝滿25 cm 高的清潔水，并保持在（22±3）℃。動(dòng)物漂浮在水中進(jìn)行測(cè)試并錄像。每只大鼠游泳總計(jì)6 min，觀察后5 min總不動(dòng)時(shí)間。

1.8 蛋白免疫印跡試驗(yàn)（Western Blot）在冰上采集大鼠手術(shù)對(duì)側(cè)ACC腦區(qū)，用含有PMSF和蛋白酶磷酸酶抑制劑的RIPA 緩沖液進(jìn)行裂解，4 ℃下離心15 min（3 000 r/min）后，在上清液中獲得細(xì)胞蛋白。用BCA法測(cè)定蛋白濃度后，使用10% SDS-PAGE電泳，200 mA 轉(zhuǎn)PVDF 膜90 min。用5%的FBS 封閉1 h后，一抗4 ℃孵育過(guò)夜。PVDF膜用TBST清洗3遍后與辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的山羊抗兔/小鼠多克隆抗體室溫孵育2 h，用ECL 試劑盒檢測(cè)蛋白表達(dá)，ImageJ對(duì)蛋白相對(duì)水平進(jìn)行量化。

1.9 免疫熒光染色大鼠腦組織使用4%多聚甲醛固定后進(jìn)行脫水包埋并切成厚度20 μm 的切片，用PBS 清洗，并在室溫下用5%的山羊血清孵育1 h，加入熒光一抗室溫過(guò)夜。PBS 清洗，加入山羊抗小鼠Cy3 標(biāo)記或山羊抗兔FITC 標(biāo)記的熒光二抗，室溫孵育2 h。PBS清洗，封片劑封片，在熒光顯微鏡下觀察染色圖像。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS 27.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。正態(tài)分布的計(jì)量資料以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，不同時(shí)間點(diǎn)的組間比較采用重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)的方差分析，組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)至少重復(fù)3次，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠疼痛及焦慮、抑郁行為的測(cè)定如圖1A所示，CCI 組大鼠較Sham 組在術(shù)后3 d 出現(xiàn)PWT、PWL下降，且持續(xù)到術(shù)后28 d，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。在OFT 中（圖1B），CCI 組大鼠進(jìn)入中央?yún)^(qū)次數(shù)和在中央?yún)^(qū)停留時(shí)間較Sham組顯著減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。在NSFT 和FST 中（圖1C），CCI組大鼠進(jìn)食潛伏期和強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間均延長(zhǎng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。大鼠神經(jīng)病理性疼痛模型建立成功且在術(shù)后28 d 出現(xiàn)焦慮、抑郁等情緒改變。

圖1 2組大鼠在不同時(shí)間點(diǎn)PWT、PWL以及術(shù)后28 d的OFT、NSFT、FST中行為比較Figure 1 Comparison of PWT and PWL between the two groups of rats at different time points, and the behavior in OFT,NSFT and FST at 28-day postoperatively

2.2 ACC 中CaMKⅡα與GAD67 蛋白含量的測(cè)定如圖2所示，與Sham組相比，術(shù)后第28天CCI組大鼠ACC 內(nèi)興奮性神經(jīng)元標(biāo)志物CaMKⅡα蛋白表達(dá)升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），抑制性神經(jīng)元標(biāo)志物GAD67 蛋白表達(dá)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖2 2組大鼠術(shù)后28 d對(duì)側(cè)ACC中CaMKⅡα、GAD67蛋白表達(dá)Figure 2 CAMKⅡα and GAD67 protein expressions in the contralateral ACC of rats in both groups at 28-day postoperatively

2.3 CaMKⅡα+神經(jīng)元與GAD67+神經(jīng)元的激活情況測(cè)定如圖3所示，與Sham組相比，CCI后c-Fos共標(biāo)的CaMKⅡα+神經(jīng)元增多（圖3A），GAD67+神經(jīng)元減少（圖3B），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖3 CCI術(shù)后28 d大鼠ACC中CaMKⅡα+神經(jīng)元、GAD67+神經(jīng)元激活情況Figure 3 Activation of CaMKⅡα+ neurons and GAD67+ neurons in the ACC of rats 28-day after CCI

2.4 化學(xué)遺傳抑制ACC 中CaMKⅡα+神經(jīng)元對(duì)CCI 大鼠疼痛行為學(xué)和焦慮、抑郁行為的影響測(cè)定為確定抑制ACC 中CaMKⅡα+神經(jīng)元是否可以逆轉(zhuǎn)神經(jīng)損傷帶來(lái)的不良影響，將帶EGFP 標(biāo)記的CaMKⅡα驅(qū)動(dòng)Gi偶聯(lián)的DREADD rAAV，hM4D（Gi）注射到ACC 區(qū)，選擇性地抑制錐體神經(jīng)元的興奮性。如圖4A所示，根據(jù)計(jì)劃開(kāi)展實(shí)驗(yàn)。圖4B中雙重免疫熒光結(jié)果顯示ACC 內(nèi)注射病毒的EGFP 熒光與CaMKⅡα共標(biāo)。圖4C中疼痛行為學(xué)結(jié)果顯示，腹腔注射CNO 抑制ACC 錐體神經(jīng)元（CCI+hM4Di+）較腹腔注射鹽水組（CCI+hM4Di-）緩解了CCI大鼠機(jī)械痛覺(jué)過(guò)敏和熱痛覺(jué)超敏反應(yīng)（P＜0.05）。在OFT 中（圖4D），CCI+hM4Di-進(jìn)入中央?yún)^(qū)次數(shù)、在中央?yún)^(qū)停留時(shí)間明顯減少，而CCI+hM4Di+則逆轉(zhuǎn)了這種現(xiàn)象（P＜0.05）。在NSFT 和FST 中（圖4E），CCI+hM4Di+組進(jìn)食潛伏期、強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間較CCI+hM4Di-組縮短（P＜0.05）。圖4F 顯示2 組大鼠在OFT 中的運(yùn)動(dòng)軌跡。

圖4 CNO介導(dǎo)的CaMKⅡα+興奮性神經(jīng)元的DREADD抑制對(duì)大鼠焦慮、抑郁行為影響Figure 4 Effect of CNO-mediated DREADD inhibition of CaMKⅡα+ excitatory neurons on anxiety and depressive behavior in rats

2.5 化學(xué)遺傳激活A(yù)CC 中GAD67+神經(jīng)元對(duì)CCI大鼠疼痛行為學(xué)和焦慮、抑郁行為的影響測(cè)定如圖5A 所示，根據(jù)計(jì)劃開(kāi)展實(shí)驗(yàn)，將帶EGFP 標(biāo)記的GAD67 驅(qū)動(dòng)的rAAV-hM3D（Gq）注射到ACC 區(qū)，選擇性地激活GAD67+的GABA 神經(jīng)元。圖5B 中雙重免疫熒光結(jié)果顯示ACC 內(nèi)注射病毒準(zhǔn)確標(biāo)記GAD67+神經(jīng)元。圖5C 中疼痛行為學(xué)結(jié)果顯示，與CCI+hM3Dq-組相比，CCI+hM3Dq+組逆轉(zhuǎn)了NP（P＜0.05）。在OFT 中（圖4D），CCI+hM3Dq-組進(jìn)入中央?yún)^(qū)次數(shù)、在中央?yún)^(qū)停留時(shí)間明顯減少，而CCI+hM3Dq+組卻未減少（P＜0.05）。在NSFT 和FST 中（圖5E），CCI+hM3Dq+組進(jìn)食潛伏期、強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間較CCI+hM3Dq-組明顯縮短（P＜0.05）。

圖5 CNO介導(dǎo)的GAD67+抑制性神經(jīng)元的DREADD激活對(duì)大鼠焦慮、抑郁行為影響Figure 5 Effect of CNO-mediated DREADD activation of GAD67+ inhibitory neurons on anxiety and depressive behavior in rats

3 討論

由于神經(jīng)系統(tǒng)損傷或功能障礙引起的NP 機(jī)制不明且難以治療，正在社會(huì)范圍內(nèi)成為引人注目的公共衛(wèi)生問(wèn)題［25-26］。長(zhǎng)時(shí)間的NP 容易導(dǎo)致精神疾病，如焦慮和抑郁［27］。ACC 是邊緣系統(tǒng)中的重要信息處理區(qū)域，能夠接受參與感覺(jué)知覺(jué)和情緒反應(yīng)［28-29］。神經(jīng)損傷導(dǎo)致ACC 中神經(jīng)元激活，抑制ACC 神經(jīng)元的突觸可塑性產(chǎn)生鎮(zhèn)痛、抗焦慮和抗抑郁作用［30-31］。此外，ACC中GABA能中間神經(jīng)元的激活可抑制局部的谷氨酸能神經(jīng)元的電活動(dòng)［32］，但在神經(jīng)病理性疼痛模型中，ACC 錐體神經(jīng)元與GABA能中間神經(jīng)元的興奮性改變，以及調(diào)控特定類型神經(jīng)元活性能否緩解NP 以及相關(guān)情緒障礙目前尚不清楚。

CaMKⅡ是參與調(diào)節(jié)谷氨酸突觸傳遞以及學(xué)習(xí)和記憶的關(guān)鍵分子［33-34］。Vazquez等［35］報(bào)道了基底外側(cè)杏仁核中CaMKⅡα+谷氨酸能興奮性神經(jīng)元的活動(dòng)增強(qiáng)與負(fù)面情緒引發(fā)的沖動(dòng)有關(guān)。GABA 是神經(jīng)元末梢主要抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，而且突觸GABA 能抑制性神經(jīng)元張力的改變已被證明參與了神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)展和維持［19］。GAD67能夠標(biāo)記GABA能細(xì)胞，使其可視化［36-38］。在對(duì)健康人進(jìn)行的磁共振波譜研究表明，機(jī)械性疼痛閾值與GABA 和谷氨酸水平以及后島葉的谷氨酸/GABA 比值有關(guān)［39-40］。本研究顯示，CCI 術(shù)后28 d 大鼠ACC 區(qū)域CaMKⅡα表達(dá)增多，GAD67表達(dá)降低；免疫熒光染色顯示，與c-Fos共標(biāo)的CaMKⅡα+神經(jīng)元激活增多，GAD67+神經(jīng)元激活減少，證明興奮性與抑制性神經(jīng)元結(jié)構(gòu)和功能的改變?cè)贜P和焦慮、抑郁共病中起重要作用。

周圍神經(jīng)損傷導(dǎo)致ACC 區(qū)域CaMKⅡα+興奮性神經(jīng)元活性增強(qiáng)以及GAD67+抑制性神經(jīng)元功能減弱與NP和焦慮、抑郁樣行為有關(guān)。DREADD的策略能夠精確控制遠(yuǎn)程和局部神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，基于此策略本研究通過(guò)化學(xué)遺傳法靶向激活/抑制特定類型神經(jīng)元，探究其對(duì)NP 以及焦慮、抑郁樣表現(xiàn)的作用。本實(shí)驗(yàn)表明，腹腔注射CNO抑制CaMKⅡα+神經(jīng)元或激活GAD67+神經(jīng)元均能夠有效逆轉(zhuǎn)CCI大鼠的疼痛并改善相關(guān)情緒障礙，這可能與GABA 能神經(jīng)元增強(qiáng)輸出抑制CaMKⅡα+錐體神經(jīng)元功能有關(guān)。在未來(lái)的研究中，將進(jìn)一步探究引起ACC 神經(jīng)元結(jié)構(gòu)和功能變化與大腦中其他疼痛和情緒相關(guān)部位的可塑性變化的相關(guān)性。