劉芳　劉乃更　楊占全　梁芳　邢冬飛　李讓　耿丹　孫娜

摘 要：近幾年遼寧盤錦地區(qū)河蟹“牛奶病”暴發(fā)，給養(yǎng)殖戶造成較大的經(jīng)濟(jì)損失。為了調(diào)查“牛奶病”的發(fā)病特點(diǎn)及規(guī)律，2022年7～9月份對盤錦地區(qū)的中華絨螯蟹（Eriocheir sinensis）稻田養(yǎng)殖過程進(jìn)行了“牛奶病”的監(jiān)測與調(diào)查。2022年12月及2023年2月對不同扣蟹越冬暫養(yǎng)密度、不同越冬模式的扣蟹“牛奶病”發(fā)病情況進(jìn)行了調(diào)查。結(jié)果顯示，在稻田養(yǎng)殖階段9月份為主要的發(fā)病時(shí)間，且成蟹養(yǎng)殖階段的發(fā)病率高于扣蟹養(yǎng)殖階段，扣蟹越冬暫養(yǎng)期間暫養(yǎng)密度越大，“牛奶病”患病率越高。越冬前挑選雌雄的過程會(huì)增加“牛奶病”患病率。該研究為中華絨螯蟹養(yǎng)殖及越冬暫養(yǎng)期間的“牛奶病”預(yù)防和控制提供數(shù)據(jù)支持。

關(guān)鍵詞：中華絨螯蟹（Eriocheir sinensis）；扣蟹養(yǎng)殖；成蟹養(yǎng)殖；扣蟹越冬；二尖梅奇酵母（Metschnikowia bicuspidata）

中圖分類號：S945.6文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

中華絨螯蟹（Eriocheir sinensis）又稱河蟹，是中國重要的淡水養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)品種之一[1]，廣泛分布于湖泊、水庫，深受廣大消費(fèi)者喜愛。2020年的《中國漁業(yè)統(tǒng)計(jì)年鑒》顯示，中華絨螯蟹在國內(nèi)養(yǎng)殖產(chǎn)量達(dá)77.5萬t[2]。目前，遼寧省盤錦市已成為中華絨螯蟹重要的養(yǎng)殖中心，養(yǎng)殖面積11.3萬hm2，產(chǎn)品產(chǎn)值40億元。 2019年，其成蟹和幼蟹產(chǎn)量分別為5.2萬t和2.55萬t，分別占中國總產(chǎn)量的6.7%和37.5%。中華絨螯蟹牛奶病是近幾年在中國北方地區(qū)河蟹養(yǎng)殖時(shí)暴發(fā)的病害，患病蟹檢查發(fā)現(xiàn)肝胰腺和血淋巴已病變成乳白色，逐漸活力減弱不能攝食，最終死亡，給蟹苗養(yǎng)殖戶造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[3]。馬紅麗、孫娜等對病蟹進(jìn)行了組織病理學(xué)檢查、病原分離、鑒定，以及人工回感試驗(yàn)，證實(shí)遼寧地區(qū)中華絨螯蟹的“牛奶病”是由二尖梅奇酵母（Metschnikowia bicuspidata）感染所致[4]， 2021年Bao等的研究也證明了河蟹“牛奶病”是由二尖梅奇酵母感染引起的[5]。目前盤錦地區(qū)的“牛奶病”感染率逐年上升，嚴(yán)重威脅著河蟹產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[6-7]。孫娜等[3]研究表明，冬季越冬期是河蟹牛奶病的高發(fā)期，為了找到越冬期間河蟹的發(fā)病特點(diǎn)以及與其相關(guān)的因素，2022年對盤錦地區(qū)的扣蟹及成蟹養(yǎng)殖過程進(jìn)行了牛奶病的監(jiān)測與調(diào)查，特別是對不同暫養(yǎng)密度、不同越冬模式的扣蟹發(fā)病情況進(jìn)行了調(diào)查，旨在為扣蟹稻田養(yǎng)殖及越冬期間的牛奶病預(yù)防和控制提供依據(jù)。

1 材料方法

1.1 牛奶病調(diào)查與樣品采集

2022年7月至2023年2月，在遼寧盤錦稻田河蟹養(yǎng)殖及越冬期間進(jìn)行調(diào)查，采樣地點(diǎn)分布在盤錦的王家、壩墻子、新興、新開、甜水、胡家、唐家、東風(fēng)、西安、清水10個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)（見圖1），主要調(diào)查內(nèi)容為不同養(yǎng)殖階段、不同冬儲(chǔ)模式中華絨螯蟹的“牛奶病”發(fā)病特征、發(fā)病時(shí)間和發(fā)病率等情況。

1.2? 中華絨螯蟹牛奶病調(diào)查內(nèi)容

1.2.1 扣蟹養(yǎng)殖階段牛奶病調(diào)查

于2022年7月至2023年2月進(jìn)行扣蟹的稻田養(yǎng)殖及越冬期間暫養(yǎng)扣蟹的牛奶病取樣調(diào)查。取樣地點(diǎn)為盤錦市王家鎮(zhèn)等10個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)的稻田養(yǎng)蟹區(qū)與越冬池，取樣地點(diǎn)見圖1。通過對采集的扣蟹進(jìn)行“二尖梅奇酵母”涂板檢測，統(tǒng)計(jì)不同月份各取樣地點(diǎn)扣蟹牛奶病患病情況。

1.2.2 成蟹養(yǎng)殖階段牛奶病調(diào)查

于2022年7月至9月進(jìn)行成蟹稻田養(yǎng)殖期間牛奶病取樣調(diào)查。取樣地點(diǎn)為盤錦市王家鎮(zhèn)等10個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)的成蟹稻田養(yǎng)殖區(qū)。通過對采集成蟹進(jìn)行二尖梅奇酵母的培養(yǎng)檢測，統(tǒng)計(jì)出不同月份各取樣地點(diǎn)成蟹牛奶病患病情況。

1.2.3 扣蟹冬季不同暫養(yǎng)密度及不同越冬模式調(diào)查

為了調(diào)查越冬暫養(yǎng)密度對扣蟹牛奶病的影響，于2023年2月份對5個(gè)不同暫養(yǎng)密度的15戶養(yǎng)殖戶扣蟹越冬暫養(yǎng)情況進(jìn)行了采樣調(diào)查。通過對不同暫養(yǎng)密度的扣蟹采集進(jìn)行牛奶病檢測，統(tǒng)計(jì)出不同密度暫養(yǎng)的扣蟹牛奶病患病情況。由于雌蟹價(jià)格高于雄蟹，為了提高冬季暫養(yǎng)的效益，盤錦地區(qū)大部分扣蟹越冬農(nóng)戶在越冬前會(huì)進(jìn)行雌雄挑選，選擇雌蟹越冬暫養(yǎng)。為了調(diào)查挑選操作是否會(huì)對“牛奶病”發(fā)病產(chǎn)生影響，于2023年2月份對盤錦6個(gè)地區(qū)進(jìn)行了挑選與未挑選兩種方式的越冬扣蟹患牛奶病情況的調(diào)查。通過對越冬前挑選與未挑選的暫養(yǎng)扣蟹取樣進(jìn)行“牛奶病”檢測，統(tǒng)計(jì)出暫養(yǎng)前挑選對扣蟹越冬牛奶病患病的影響。

1.3 病原檢測及鑒定方法

1.3.1 檢測方法

將取回的蟹樣本在無菌條件下解剖，無菌操作下取肝胰腺接種于孟加拉紅培養(yǎng)基 27℃培養(yǎng) 48hrs后，平板上生長出均一菌落，顯微鏡下表現(xiàn)為酵母形態(tài)。

1.3.2 鑒定方法

二尖梅奇酵母鑒定所用特異性引物F： 5’-AGCCTGGTCTTTGTAATG-3’；R： 5’-ACTCCCTTGTTGGTGATA-3’。試劑盒的 PCR反應(yīng)條件為：預(yù)變性94℃，10mins；變性94℃，1min；退火50℃，45s；延伸72℃，1min；終延伸72℃，10mins；其中，變性、退火和延伸為35個(gè)循環(huán)。待PCR反應(yīng)結(jié)束后，取5μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.5％的瓊脂糖凝膠電泳分析。目的片段大小460bp。

2 結(jié)果

2.1 患病癥狀

牛奶病患病情況分為兩種，嚴(yán)重有明顯病癥的扣蟹運(yùn)動(dòng)能力下降，對刺激的反應(yīng)較弱，殼色變?yōu)榈S色（如圖2a）。打開明顯病癥蟹頭胸甲，患病蟹體內(nèi)蓄積大量牛奶狀液體（如圖3c），無菌操作分別下取肝胰腺接種于孟加拉紅培養(yǎng)基 28℃培養(yǎng) 48hrs后，平板上生長出均一菌落（如圖4） ，進(jìn)一步進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定。提取肝胰腺 DNA，進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR） 鑒定，在 460bp處顯示為目標(biāo)條帶清晰可見（如圖5）。也定義為患病蟹。

2.2 扣蟹養(yǎng)殖階段牛奶病調(diào)查結(jié)果

夏季稻田養(yǎng)殖扣蟹的牛奶病情況如表1所示，整體感染率很低，7～9月份的三次取樣的扣蟹感染率分別是0%、0%、18%。7月份和8月份取樣扣蟹的10鄉(xiāng)鎮(zhèn)均未檢測到病原菌。9月份10個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)中，只有王家鎮(zhèn)1個(gè)稻田發(fā)現(xiàn)2只扣蟹感染。

越冬期間池塘扣蟹牛奶病情況如表2所示，整體感染率增加。10個(gè)越冬池均有受到感染的扣蟹，感染率最低為4%，最高為40%，12月份扣蟹平均總感染率為13.67%，2023年2月份扣蟹平均總感染率為18.33%，感染率隨著越冬時(shí)間的延長有升高的趨勢。

2.3 成蟹養(yǎng)殖階段牛奶病調(diào)查結(jié)果

夏季稻田養(yǎng)殖成蟹的牛奶病情況如表3所示，夏季7月、8月、9月的三次取樣的成蟹感染率分別為0.51%、0.68%、5.56%。7月份只有甜水鎮(zhèn)一個(gè)稻田發(fā)現(xiàn)3只成蟹患病，8月份新興鎮(zhèn)一個(gè)稻田發(fā)現(xiàn)2只成蟹患病，胡家一個(gè)稻田發(fā)現(xiàn)2只成蟹患病，9月份取樣時(shí)，王家鎮(zhèn)和壩墻子鎮(zhèn)的感染率最高，分別為16.13%和10.23%，9月份取樣患病戶數(shù)與患病率均高于7月份和8月份。

2.4 冬季不同暫養(yǎng)密度及不同越冬模式調(diào)查

對不同越冬暫養(yǎng)密度的扣蟹患牛奶病情況進(jìn)行了養(yǎng)殖回訪調(diào)查，結(jié)果如表4所示，發(fā)現(xiàn)養(yǎng)殖密度在240kg/畝～260kg/畝時(shí)牛奶病患病率最低，平均為7.81%，在養(yǎng)殖密度在1200kg/畝～1300kg/畝時(shí)，牛奶病患病率最高，平均患病67.20%，牛奶病患病率與越冬密度呈正相關(guān)。

對越冬前挑選與未挑選兩種方式的越冬扣蟹患牛奶病情況的調(diào)查結(jié)果如圖5所示，挑選過后的扣蟹患牛奶病率平均為37.21% 未經(jīng)過挑選扣蟹牛奶病患病率平均為14.71% 。

3 討論

調(diào)查研究表明，室外稻田夏季高溫情況下，牛奶病患病率低于越冬期間，這可能是由于夏季6-9月份是河蟹重要的生長期，水體中含有豐富的浮游植物和底棲動(dòng)物，河蟹通過攝食大量天然餌料，不斷吸收營養(yǎng)積累能量，此階段河蟹的免疫力增強(qiáng)，不易患病，而冬季越冬期河蟹不攝食，免疫力低下，且越冬暫養(yǎng)階段密度大，更加導(dǎo)致牛奶病傳播速度加快。根據(jù)朱必陸等[8]多年實(shí)踐檢驗(yàn)表明如果扣蟹在冬季得到較好的培育，來年蛻第一殼、第二殼成活率和增重率都較好，養(yǎng)殖大規(guī)格的河蟹比率大，增值效益也較明顯。所以怎樣降低越冬暫養(yǎng)扣蟹的患病率是對來年稻田養(yǎng)殖成蟹養(yǎng)殖效益非常關(guān)鍵的。

該研究中成蟹在夏季患病率高于扣蟹，同樣，LU C C等人[9]研究表明，二尖梅奇酵母在羅氏沼蝦中的流行率在成年對蝦中最高（73%），其次是幼蝦（25%）和后期幼體（2%），并且在幼體中沒有發(fā)現(xiàn)酵母感染。CHEN S C等[10]認(rèn)為，雖然成年個(gè)體的免疫系統(tǒng)比幼年個(gè)體強(qiáng)健，但體型大的個(gè)體由于活動(dòng)力強(qiáng)、生長期長，更容易接觸到水體和沉積物中的病原體，這可能是成蟹的牛奶病患病率高于扣蟹的原因。

養(yǎng)殖密度是影響水生動(dòng)物健康生長和養(yǎng)殖利潤的最直接因素，該研究中越冬暫養(yǎng)扣蟹密度越大牛奶病的患病率越高。JUAN P Apún-Molina等人[11]，WU J L等人 [12]也發(fā)現(xiàn)高密度的暫養(yǎng)可能是疾病快速傳播的原因。 LIU Gang等人表明[13]，高密度培養(yǎng)的南美白對蝦對哈維氏弧菌的抗性力顯著下降。 同樣LIN Yongchin等人（2015年）[14]結(jié)果表明，在高密度下養(yǎng)殖的蝦中溶藻弧菌的生化活性和清除效率顯著降低。閻儉等[15]針對扣蟹的越冬與管理進(jìn)行論述，扣蟹越冬的密度，應(yīng)根據(jù)越冬池的條件而定。如果池塘底質(zhì)較好，補(bǔ)水方便，可畝放 450kg～500kg，有經(jīng)驗(yàn)儲(chǔ)戶可增加到800kg。而該研究回訪了解到盤錦越冬池塘的扣蟹密度為250kg/畝～1250kg/畝，高密度的扣蟹越冬暫養(yǎng)也是導(dǎo)致牛奶病患病率高的重要原因。過高的密度會(huì)增加水產(chǎn)動(dòng)物的對空間和食物競爭，導(dǎo)致生長緩慢，存活率降低[16]，水質(zhì)惡化，細(xì)菌滋生[17]。此外，高密度養(yǎng)殖還會(huì)引起水產(chǎn)動(dòng)物擁擠脅迫，導(dǎo)致免疫應(yīng)激和氧化損傷[18]。我們之前未發(fā)表的研究發(fā)現(xiàn)，同類相食會(huì)導(dǎo)致健康螃蟹感染。因此，我們提出在高密度培養(yǎng)下，河蟹會(huì)通過自相殘殺，同類相食和其他接觸增加了感染風(fēng)險(xiǎn)造成交叉感染。因此，越冬期間避免扣蟹之間的感染傳播是至關(guān)重要的。

由于雌蟹價(jià)格高于雄蟹，為了提高冬季暫養(yǎng)的效益，大部分扣蟹越冬農(nóng)戶在越冬前會(huì)進(jìn)行雌雄挑選，選擇雌蟹越冬暫養(yǎng)。該研究表明，經(jīng)過挑選后的扣蟹患牛奶病率（37.2%）高于未挑選的扣蟹牛奶病率（14.7%），可能是由于挑選環(huán)節(jié)對扣蟹損傷危害，引起了應(yīng)激反應(yīng)，造成扣蟹免疫力降低與交叉感染。Vermeersch等[19] 研究表明，經(jīng)過捕獲、分揀和運(yùn)輸過程中對褐蝦的翻滾、堆疊會(huì)導(dǎo)致蝦的重要器官損傷或丟失，并出現(xiàn)很高的死亡率（32.8%～69.8%）。因此，在越冬存儲(chǔ)扣蟹前應(yīng)減少挑選雌雄環(huán)節(jié)，減輕河蟹的應(yīng)激反應(yīng)，降低因挑選導(dǎo)致的扣蟹應(yīng)激創(chuàng)傷增加的感染牛奶病情況。

4 改進(jìn)越冬模式的建議

選擇越冬暫養(yǎng)的扣蟹在秋季起捕前一個(gè)月開始強(qiáng)化營養(yǎng)，投喂玉米、高粱、雜魚等，以增加扣蟹體內(nèi)的脂肪積累，使扣蟹體內(nèi)存儲(chǔ)足夠的能量，提升免疫力。扣蟹在入越冬池前要徹底清塘，避免混有養(yǎng)殖生物的天敵和殘留的致病菌危害扣蟹安全越冬。選擇暫養(yǎng)扣蟹前應(yīng)該進(jìn)行牛奶病檢測抽檢，選擇病原較少的扣蟹進(jìn)行越冬，盡量不要對扣蟹進(jìn)行雌雄篩選，降低因挑選引起的扣蟹“牛奶病”的交叉感染。越冬暫養(yǎng)應(yīng)控制密度，越冬密度建議不超過750kg/畝。

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A survey on the characteristics of ‘milk disease’ in Eriocheir sinensis farming and overwintering in Panjin region

LIU Fang， LIU Naigeng， YANG Zhanquan， LIANG Fang， XING Dongfei， LI Rang， GENG Dan， SUN Na

（Panjin Photosynthetic Crab Industry Co.， Ltd.， Panjin 124200， Liaoning China）

Abstract：In recent years， the outbreak of? “milk disease”? in Eriocheir sinensis in Panjin， Liaoning Province， has caused large economic losses to farmers. In order to investigate the characteristics and pattern of “milk disease”， the monitoring and investigation of "milk disease" was carried out in July-September 2022 on the paddy culture process of Eriocheir sinensis in Panjin area， and the monitoring and investigation of "milk disease" was carried out in December 2022 and February 2023 on different snap crabs with different overwintering densities and different overwintering modes. In December 2022 and February 2023， we investigated the incidence of “milk disease” in snap crabs with different overwintering densities and different overwintering patterns. The results showed that September was the main time for the onset of the disease in the paddy field culture stage， and the incidence rate was higher in the adult crab culture stage than in the snap Eriocheir sinensis culture stage， and the higher the stocking density of snap crabs during the over-wintering period， the higher the prevalence of "milk disease". The prevalence of "milk sickness" increased with higher density during the over-wintering of button crabs. This study provides data support for the prevention and control of milk sickness during Eriocheir sinensis culture and overwintering.

Keywords：Eriocheir sinensis; juvenile crab culture; adult crab culture; juvenile crab overwintering; Metschnikowia bicuspidate

文章編號：1674-2419（2023）06-0409-07

基金項(xiàng)目：遼寧省科學(xué)技術(shù)基金項(xiàng)目（編號：2022-PJLH-01）；2021年遼寧省“揭榜掛帥”科技攻關(guān)項(xiàng)目（2021JH1/10400040）。

作者簡介：劉芳（1993.5-），女，遼寧盤錦人，盤錦光合蟹業(yè)有限公司研發(fā)中心工程師。主要從事水產(chǎn)養(yǎng)殖中水質(zhì)調(diào)控工作。E-mail：910288277@qq.com。

通訊作者：孫娜（1983.9-），女，山東濱州人，盤錦光合蟹業(yè)有限公司研發(fā)中心主任、高級工程師。主要從事水產(chǎn)苗種育苗中的水質(zhì)與藻類調(diào)控工作。E-mail：sunna0911@163.com。