施遠(yuǎn)國(guó) 蔣永青 梁彤 陳昌毅 李穎鑫 李繁 柯艷坤 吳寒光 劉國(guó)華 何雪玉

作者簡(jiǎn)介：施遠(yuǎn)國(guó)（1974－），男，學(xué)士，高級(jí)獸醫(yī)師，主要從事動(dòng)物疫病檢疫、監(jiān)測(cè)及實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)工作；E-mail：120956892@qq.com

*通信作者：蔣永青（1981－），男，碩士，獸醫(yī)師，主要從事動(dòng)物疫病及農(nóng)產(chǎn)品獸藥殘留檢測(cè)工作；E-mail：sales@lsybt.com

摘? 要：本試驗(yàn)應(yīng)用膠體金免疫層析技術(shù)，建立了一種快速檢測(cè)分娩動(dòng)物羊水中布魯菌的方法，并應(yīng)用于臨床檢測(cè)。用膠體金標(biāo)記提純的布魯菌M5-90疫苗株光滑型脂多糖（smooth lipopolysaccharides，S-LPS）C表位的單克隆抗體16C5，摸索與優(yōu)化標(biāo)記條件并制備成金墊；將抗布魯菌的單克隆抗體16C5和羊抗鼠IgG單克隆抗體噴在硝酸纖維素膜上，優(yōu)化并確定最佳包被濃度，組裝成試紙卡，最后制作成帶有樣本采集部件的檢測(cè)卡。結(jié)果表明，布魯菌抗原快速檢測(cè)卡可檢測(cè)最低細(xì)菌含量為105 CFU/mL；臨床檢測(cè)分娩母羊的羊水樣本，與qPCR試劑盒結(jié)果對(duì)比，本檢測(cè)卡靈敏度為83.3％，特異性為100％。表明該方法能快速、便捷地查出牛群、羊群中布魯菌抗原陽(yáng)性的牛羊，適合普通實(shí)驗(yàn)室及飼養(yǎng)場(chǎng)現(xiàn)場(chǎng)臨床應(yīng)用。

關(guān)鍵詞：布魯菌；抗原檢測(cè)；快速檢測(cè)卡；單克隆抗體；膠體金

中圖分類號(hào)：S852.56 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A ? ? ? ?文章編號(hào)：1001-0769（2023）06-0071-05

布魯菌?。˙rucellosis）簡(jiǎn)稱布病，是一種重要的人畜共患傳染病，在全國(guó)各地廣為流行，會(huì)嚴(yán)重影響畜牧生產(chǎn)與人民群眾的身體健康。妊娠母畜感染該病后，臨床上典型的癥狀是流產(chǎn)，主要發(fā)生在懷孕后期，且主要發(fā)生于頭胎母畜。公畜感染該病后會(huì)發(fā)生睪丸炎和附睪炎。布魯菌病一年四季均可發(fā)生，其傳染源主要為發(fā)病畜和帶菌畜。該病主要在家畜間傳播，以牛和羊?yàn)橹?。?dāng)發(fā)病或帶菌母畜流產(chǎn)、分娩時(shí)，布魯菌會(huì)隨著流產(chǎn)胎兒、胎衣、羊水和子宮分泌物一起大量排出，成為致病性最強(qiáng)的傳染源[1]。一頭流產(chǎn)或正在分娩的發(fā)病母牛能夠向環(huán)境排放109～1013個(gè)布魯菌，這些細(xì)菌可感染60 000～600 000頭懷孕動(dòng)物。此外，發(fā)病畜或帶菌畜還會(huì)通過(guò)乳汁、糞便和尿液排出布魯菌，污染草場(chǎng)、畜舍、飲水、飼料、排水溝等，導(dǎo)致病原菌擴(kuò)散[2]。這些傳染源長(zhǎng)期存在于環(huán)境中，導(dǎo)致布魯菌病防控難度加大，長(zhǎng)期無(wú)法消滅，而且有愈演愈烈之勢(shì)。因此，對(duì)布魯菌病進(jìn)行準(zhǔn)確診斷，及時(shí)切斷傳染源，具有重要的公共衛(wèi)生意義。

目前，我國(guó)對(duì)布魯菌病防控使用的檢疫方法主要是抗體檢測(cè)[3]，但該方法的局限性在于難以判斷單頭畜體是否帶菌、排泄物是否含布魯菌。而布魯菌抗原檢測(cè)能方便、快速、準(zhǔn)確地判定流產(chǎn)胎兒、分娩羊水、胎衣與母畜陰道分泌物是否存在布魯菌，對(duì)布魯菌病的防控具有巨大的促進(jìn)作用。

因此，本研究利用抗布魯菌脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）的O鏈C抗原的單抗16C5，建立并開(kāi)發(fā)膠體金免疫層析法，研制出針對(duì)布魯菌病的檢測(cè)卡，以期用于布魯菌的快速檢測(cè)。該方法對(duì)被檢樣本量需求少、操作方便、反應(yīng)時(shí)間短，適合于廣大基層單位、養(yǎng)殖場(chǎng)及大量檢測(cè)樣本的快速初篩，對(duì)布魯菌病的防控和凈化具有巨大的促進(jìn)作用。

1? 材料與方法

1.1 菌株

小腸結(jié)腸炎耶爾森菌O：9全菌體，沙門菌O45-2（D群）、C500（C1群）和AE616（B群），大腸桿菌O157，均由深圳市綠詩(shī)源生物技術(shù)有限公司制備并提供。

1.2 主要試劑

布魯菌單克隆抗體16C5由深圳市綠詩(shī)源生物技術(shù)有限公司制備并保存，氯金酸購(gòu)自Sigma公司，硝酸纖維素（nitrocellulose，NC）膜購(gòu)自Sartrious科學(xué)儀器（北京）公司，玻璃纖維購(gòu)自懷遠(yuǎn)縣通成紙制品有限公司，聚氯乙烯（polyvinyl chloride，PVC）板購(gòu)自南通浩杰特貿(mào)易有限公司，樣本滴管購(gòu)自滄州盛豐塑膠制品有限公司，牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）購(gòu)自Roche公司，吸水紙購(gòu)自懷遠(yuǎn)縣通成紙制品有限公司，稀釋液購(gòu)自深圳市金燦華實(shí)業(yè)有限公司，布魯菌核酸實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)試劑盒、布魯菌M5-90疫苗株購(gòu)自哈爾濱國(guó)生生物科技股份有限公司。

1.3 膠體金溶液的制備

取1 mL 1％氯金酸溶液，加入裝有99 mL超純水的錐形瓶中，制成0.01％氯金酸溶液，搖勻后放入智能加熱套內(nèi)加熱至沸騰，迅速加入1.6 mL的1％檸檬酸三鈉溶液，搖勻，繼續(xù)加熱10 min左右，直至溶液呈透亮的酒紅色。停止加熱，冷卻至室溫，用超純水恢復(fù)至原體積，分裝到棕色試劑瓶中，置于2～8 ℃下避光保存。

1.4 膠體金標(biāo)記抗體16C5最佳pH的測(cè)定

取1.5 mL的透明離心管，采用pH梯度法，分別加入1 mL金溶液，再緩慢加入0.2 mol/L的碳酸鉀溶液，將膠體金溶液的pH依次調(diào)為2.0、3.0、3.5、4.0、4.5和5.0。隨后，每管分別加入等量的10 μg布魯菌單抗16C5，調(diào)節(jié)每管單克隆抗體終濃度為10 μg/mL，振蕩混勻，室溫下靜置標(biāo)記20 min；當(dāng)膠體金顏色未出現(xiàn)變化，且碳酸鉀劑量最少時(shí)，即為膠體金和抗體16C5結(jié)合的最佳pH。

1.5 金墊的制備

用金墊處理液浸泡玻璃纖維30 min，取出晾干，隨后置于相對(duì)濕度為10％～30％的室溫干燥房中烘干12～16 h。

1.6 噴金

將制備的金標(biāo)布魯菌抗體16C5注入噴金儀中，調(diào)節(jié)噴金儀的參數(shù)為2.0 μL/cm，將膠體金溶液噴于處理好的玻璃纖維上。

1.7 樣本墊的制備

用樣本墊溶液浸泡玻璃纖維30 min，取出晾干，隨后置于相對(duì)濕度為10％～30％的室溫干燥房中烘干12～16 h。

1.8 膠體金試紙卡的制備

將反應(yīng)膜、金墊、樣本墊和吸水墊依次按順序粘貼在PVC底板上；樣本墊的末端與金墊的始端相連，金墊的末端與反應(yīng)膜的始端相連，反應(yīng)膜的末端與吸水墊的始端相連，且金墊和吸水墊與反應(yīng)膜都有2 mm的重疊，樣本墊與金墊有2 mm的重疊。樣本墊的始端與用作底板的PVC板的始端對(duì)齊，吸水墊的末端與用作底板的PVC板的末端對(duì)齊；其中，反應(yīng)膜上有檢測(cè)線（T線）和質(zhì)控線（C線），T線和C線的劃線方向均為與長(zhǎng)條狀試紙卡的長(zhǎng)端相垂直的條狀帶；T線位于靠近樣本墊末端的一側(cè)；C線位于靠近吸水墊首端的一側(cè)；組裝好的試紙卡如圖1所示，將試紙卡用機(jī)器切成2.8 mm寬的小條，裝在特制的密封袋中，4～30 ℃環(huán)境中保存。

1.9 判定標(biāo)準(zhǔn)

陽(yáng)性（+）：C、T線均顯色，表示樣本含有布魯菌（圖2A）；陰性（-）：T線不顯色，僅C線顯色，表示樣本不含有布魯菌，或其含量低于檢測(cè)閾值（圖2B）；無(wú)效：C線不顯色，表明操作不正確，或檢測(cè)卡已失效（圖2C、2D）。

1.10 敏感性檢驗(yàn)

將布魯菌M5-90疫苗株用稀釋液進(jìn)行10倍系列稀釋，布魯菌含量為105、106、107、108、109 CFU/mL，用制備好的布魯菌抗原檢測(cè)試紙卡進(jìn)行檢測(cè)，以肉眼能觀察到T線處有紅色沉淀線的最低布魯菌含量作為布魯菌抗原檢測(cè)試紙卡的敏感性。

1.11 特異性試驗(yàn)

用布魯菌抗原檢測(cè)試紙卡分別檢測(cè)小腸結(jié)腸炎耶爾森菌O：9全菌體，沙門菌O45-2（D群）、C500（C1群）、AE616（B群），大腸桿菌O157和布魯菌M5-90疫苗株，來(lái)評(píng)價(jià)布魯菌抗原檢測(cè)試紙卡的特異性。

1.12 重復(fù)性試驗(yàn)

用布魯菌抗原檢測(cè)試紙卡對(duì)布魯菌陽(yáng)性樣本及陰性樣本分別進(jìn)行批內(nèi)和批間重復(fù)性試驗(yàn)，每份樣本重復(fù)8次，比較不同批次間及批次內(nèi)的重復(fù)性結(jié)果。

1.13 符合率試驗(yàn)

用布魯菌抗原檢測(cè)試紙卡檢測(cè)臨床采集的18份樣本，同時(shí)用布魯菌核酸實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)試劑盒對(duì)樣本進(jìn)行復(fù)檢，并比較檢測(cè)結(jié)果，評(píng)價(jià)兩種方法的符合率。

1.14 臨床樣本的檢測(cè)

用布魯菌抗原檢測(cè)試紙卡檢測(cè)某地區(qū)送檢的72份臨床樣本，確診送檢樣本是否含有布魯菌，分析布魯菌的陽(yáng)性檢出率。

2? 結(jié)果與分析

2.1 膠體金標(biāo)記抗體16C5最佳pH的測(cè)定

經(jīng)測(cè)定，膠體金標(biāo)記抗體16C5最佳的pH為4.5（圖3）。

2.2 敏感性試驗(yàn)

當(dāng)布魯菌M5-90疫苗株稀釋為105 CFU/mL時(shí)，檢測(cè)線處仍呈現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的清晰的紅色沉淀線（圖4），說(shuō)明本研究制備的試紙卡對(duì)布魯菌抗原有較高的敏感性。

2.3 特異性試驗(yàn)

特異性試驗(yàn)顯示，布魯菌抗原檢測(cè)試紙卡對(duì)布魯菌M5-90疫苗株檢測(cè)為陽(yáng)性（T線顯色），而對(duì)沙門菌O45-2（D群）、C500（C1群）、AE616（B群）、大腸桿菌O157、小腸結(jié)腸炎耶爾森菌檢測(cè)均為陰性（T線不顯色），結(jié)果表明該試紙卡特異性較好（圖5）。

2.4 重復(fù)性試驗(yàn)

用布魯菌抗原檢測(cè)試紙卡對(duì)布魯菌陽(yáng)性樣本和陰性樣本分別進(jìn)行批內(nèi)和批間重復(fù)性試驗(yàn)，結(jié)果顯示，針對(duì)同一份樣本，無(wú)論批間還是批內(nèi)，檢測(cè)結(jié)果均一致，重復(fù)性為100％，圖6為批內(nèi)重復(fù)性檢測(cè)結(jié)果。因此，本研究建立的布魯菌抗原檢測(cè)試紙卡具有良好的重復(fù)性。

2.5 符合率試驗(yàn)

用布魯菌抗原檢測(cè)試紙卡臨床檢測(cè)18份樣本，同時(shí)用布魯菌核酸實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)試劑盒對(duì)樣本進(jìn)行復(fù)檢，比較檢測(cè)結(jié)果（表1）。結(jié)果顯示，兩種檢測(cè)方法的符合率為94.4％[（12+5）/18]，敏感性為83.3％（5/6），特異性為100％[（0+12）/12]，表明兩種方法有很高的符合率。

2.6 臨床樣本的檢測(cè)

用布魯菌抗原檢測(cè)試紙卡檢測(cè)某地區(qū)送檢的72份臨床樣本。結(jié)果顯示，布魯菌陽(yáng)性樣本2份，陰性樣本70份；布魯菌的陽(yáng)性檢出率為2.8％，表明養(yǎng)殖戶對(duì)布魯菌的防控具有很高的認(rèn)知。

3? 討論

布魯菌病是一種由布魯菌引起的人畜共患傳染病，遍布全球各地，對(duì)畜牧業(yè)和人類公共衛(wèi)生造成了巨大的威脅[4]。目前，在布魯菌病的一般檢測(cè)診斷方法中，細(xì)菌分離等方法是檢測(cè)布魯菌病的金標(biāo)準(zhǔn)，但是耗時(shí)長(zhǎng)；酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)和一些分子生物學(xué)方法要求有專業(yè)實(shí)驗(yàn)室作為進(jìn)行病原診斷的保障[5-7]。隨著社會(huì)的不斷進(jìn)步，人民物質(zhì)生活的不斷豐富，高速的發(fā)展導(dǎo)致進(jìn)出口檢驗(yàn)檢疫額度不斷增加。這要求研究人員開(kāi)發(fā)一些新技術(shù)去解決敏感性低、易發(fā)生交叉反應(yīng)、耗時(shí)長(zhǎng)、不易操作等問(wèn)題。

本研究利用抗布魯菌LPS的O鏈C抗原的單抗16C5，建立開(kāi)發(fā)膠體金免疫層析法，研制出針對(duì)布魯菌病的檢測(cè)試紙卡。該試紙卡與布魯菌核酸實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)試劑盒的符合率為94.4％，敏感性為83.3％，特異性為100％，表明該試紙卡特異性強(qiáng)、敏感性高，能快速檢測(cè)出未表現(xiàn)明顯臨床癥狀的感染牛，以切斷布魯菌病的流行和蔓延。布魯菌抗原檢測(cè)試紙卡的研制成功為我國(guó)布魯菌的控制與根除提供了很好的技術(shù)支持。用制備好的試紙條對(duì)某地區(qū)送檢的72份臨床樣本進(jìn)行布魯菌檢測(cè)，結(jié)果顯示布魯菌的陽(yáng)性檢出率為2.8％，表明養(yǎng)殖戶對(duì)布魯菌的防控具有很高的認(rèn)知。

綜上所述，本研究制備的布魯菌抗原檢測(cè)試紙卡能夠快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)感染布魯菌的家畜。建議相關(guān)部門盡快將該方法納入布魯菌病診斷的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)中，以提高我國(guó)獸醫(yī)的檢測(cè)能力，促進(jìn)家畜布魯菌病的防控。

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