吳 艷

（福建省產(chǎn)品質(zhì)量檢驗研究院，福建福州 350002）

茶樹適宜的生長環(huán)境一般比較溫暖潮濕，加上種植單一化、缺乏生物多樣性的特點，較易發(fā)生病蟲草害[1]。國家允許在茶樹種植過程中使用一些低毒高效的農(nóng)藥，以保證產(chǎn)品質(zhì)量和產(chǎn)量。有些茶農(nóng)盲目追求茶葉產(chǎn)量，濫用或誤用農(nóng)藥，導(dǎo)致茶葉中農(nóng)藥殘留遠遠超過國家規(guī)定的限量[2-3]，隨著殘留農(nóng)藥對人體健康和環(huán)境所造成的影響越來越受到各國政府和公眾的關(guān)注，許多國家都開展了相關(guān)研究[4-6]，相繼制定了更嚴(yán)格的農(nóng)藥殘留限定標(biāo)準(zhǔn)和更低的最高殘留限量（MRL）[7-9]，并研究開發(fā)出新技術(shù)方法加強對茶葉中農(nóng)藥殘留的檢測工作[10]，確保茶葉的產(chǎn)品質(zhì)量安全。

農(nóng)藥種類繁多，茶葉種植過程中經(jīng)常存在多種農(nóng)藥同時使用的問題，使檢測工作更具難度和挑戰(zhàn)[11]，傳統(tǒng)農(nóng)藥殘留檢測樣品前處理步驟復(fù)雜和儀器分析時間較長[12]。因此，有必要建立一種集簡單、快速、自動化水平高的前處理技術(shù)和分析時間短、定性定量準(zhǔn)確的儀器分析技術(shù)于一體的檢測方法。

以茶葉中吡唑醚菌酯、噻蟲胺、噻嗪酮、唑蟲酰胺等68 種常用的農(nóng)藥為測試目標(biāo)化合物，采用全自動QuEChERS 樣品前處理設(shè)備結(jié)合超高效液相色譜- 串聯(lián)質(zhì)譜儀（UPLC-MS/MS），建立一種更快、更準(zhǔn)確、更靈敏的方法，為茶葉質(zhì)量安全監(jiān)測提供方法參考與支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

茶葉樣品：76 份茶葉樣品，均購自福建省福州市、泉州市、寧德市和南平市的超市和茶葉店。

68 種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥95%），天津阿爾塔公司提供；十八烷基硅烷鍵合硅膠（C18）、乙二胺- N- 丙基硅烷化硅膠（PSA）、石墨化炭黑（GCB），日本島津公司提供；多壁碳納米管（MWCNTS）、氨基化多壁碳納米管（MWCNTS-NH2），天津Bonna-Agela 公司提供；醋酸鈉、乙酸、無水MgSO4（分析純），國藥集團提供；丙酮、乙酸乙酯、乙腈（色譜純），Meker 公司提供。

1.2 儀器與設(shè)備

METTLER AL204101 型電子天平，梅特勒- 托利多儀器公司產(chǎn)品；Milli-Q 型超純水系統(tǒng)，美國Millipore 公司產(chǎn)品；AB SCIEX Triple Quad 5500 型液相色譜- 串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜儀（配ESI 源）；全自動QuEChERS 樣品前處理系統(tǒng)，北京慧榮和科技有限公司產(chǎn)品；K600 型粉碎機，德國Braun 公司產(chǎn)品。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

混合標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液：稱取適量的各農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品于50 mL 容量瓶中，用乙腈溶解并定容，配制乙酰甲胺磷、涕滅威、甲拌磷砜、特丁硫磷、氯菊酯、甲基異柳磷、殺螟丹、聯(lián)苯菊酯、依維菌素質(zhì)量濃度均為50 mg/L；殺蟲脒、特丁硫磷亞砜、特丁硫磷砜、甲拌磷、水胺硫磷、毒死蜱、氟蟲脲、西瑪津質(zhì)量濃度均為20 mg/L；其他各農(nóng)藥質(zhì)量濃度均為10 mg/L 的混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液，于避光-18 ℃及以下條件保存。

混合標(biāo)準(zhǔn)溶液：吸取一定量混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液，用乙腈稀釋，配制乙酰甲胺磷、涕滅威、甲拌磷砜、特丁硫磷、氯菊酯、甲基異柳磷、殺螟丹、聯(lián)苯菊酯、依維菌素質(zhì)量濃度均為0.005，0.010，0.050，0.250，1.000，2.500 mg/L；殺蟲脒、特丁硫磷亞砜、特丁硫磷砜、甲拌磷、水胺硫磷、毒死蜱、氟蟲脲、西瑪津質(zhì)量濃度均為0.002，0.004，0.020，0.100，0.400，1.000 mg/L；其他各農(nóng)藥質(zhì)量濃度均為0.001，0.002，0.010，0.050，0.200，0.500 mg/L，現(xiàn)用現(xiàn)配。

基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：選擇未檢出目標(biāo)物的茶葉樣品按照1.4.1 方法進行前處理作為空白基質(zhì)溶液。吸取一定量混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液，用空白基質(zhì)溶液稀釋，濃度與混合標(biāo)準(zhǔn)溶液一致，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.4 試驗方法

1.4.1 樣品前處理

取500 g 茶葉于粉碎機中，調(diào)節(jié)10 檔轉(zhuǎn)速粉碎3 min 備用。稱取制備茶粉2 g（精確至0.01 g） 于50 mL 塑料離心管中，放入自動QuEChERS 樣品前處理設(shè)備中，設(shè)置試驗方案（在樣品中加10 mL 超純水渦旋混勻，靜置30 min，加入10 mL 乙腈，劇烈震蕩3 min，再加入醋酸鈉1.5 g、無水MgSO46 g，再次劇烈振蕩1 min 后離心。取4 mL 樣液至內(nèi)含無水硫酸鎂600 mg，PSA 200 mg，C18200 mg，MWCNTS-NH250 mg的QuEChERS 凈化管中，渦旋混勻1 min 后離心，準(zhǔn)確吸取2 mL 上清液于15 mL 試管中），運行試驗方案，待儀器停止后，取出15 mL 試管，吸取凈化液過0.22 μm 聚四氟乙烯濾膜，待測。

1.4.2 色譜條件

色譜柱：Waters HSST3，2.1 mm×50 mm，1.8 μm；流動相A 為0.002 mol/L 乙酸銨（含0.02%甲酸），流動相B 為甲醇；柱溫40 ℃，進樣量1 μL，流速0.4 mL/min，流動相采用梯度洗脫程序。

梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序

1.4.3 質(zhì)譜條件

離子源類型：電噴霧離子化（ESI），掃描方式：正、負離子同時掃描，電噴霧電壓5 500 V（ESI+）、-4 500 V（ESI-），離子源溫度550 ℃，霧化氣0.345 MPa，輔助加熱氣0.345 MPa。數(shù)據(jù)采集模式為多反應(yīng)監(jiān)測模式（MRM）。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品前處理條件的優(yōu)化

2.1.1 提取劑的選擇

市售茶葉一般比較干燥，含水量較少，前處理過程中可先加入水浸泡一段時間以提高茶葉細胞的通透性，再加入有機溶劑提取，從而提高農(nóng)殘的析出。茶葉用水浸泡后，水溶性雜質(zhì)也隨之溶出并轉(zhuǎn)移到提取液中，增加凈化難度[13]，常用的提取溶劑中，甲醇、丙酮與水不易分離，研究發(fā)現(xiàn)[14]，乙腈對不同極性農(nóng)藥均有較高的提取率，且乙腈能與水互溶，在鹽作用下又能與水兩相分離。同時，采用乙腈提取比其他常用溶劑（如甲醇、丙酮） 提取帶入的雜質(zhì)要少。采用乙酸酸化乙腈，可改善部分農(nóng)藥殘留項目（如丁硫克百威） 在純乙腈中不穩(wěn)定的現(xiàn)象。因此，試驗采用了1.0%乙酸乙腈作為提取溶劑。

2.1.2 吸附劑種類選擇

QuEChRS 通常采用PSA、C18和GCB 混合后作為凈化材料，該凈化材料提高凈化效果同時減少基質(zhì)干擾[15-16]。PSA 能夠顯著除去茶葉中的糖類、脂肪酸等干擾物質(zhì)；C18主要用于吸附脂質(zhì)等非極性物質(zhì)；GCB 對茶葉提取液中含有的色素的去除能力較強，但是很多平面結(jié)構(gòu)的農(nóng)藥，也會被其吸附，從而導(dǎo)致部分農(nóng)藥殘留檢測的準(zhǔn)確性下降[17-18]。因此，在參考國標(biāo)方法[19]使用PSA 200 mg和C18200 mg吸附劑的基礎(chǔ)上，采用正交試驗法考查了再加入GCB，MWCNTS-NH2和MWCNTS 的凈化效果，結(jié)果表明使用MWCNTS-NH250 mg 效果最佳。

2.1.3 全自動QuEChERS 系統(tǒng)參數(shù)優(yōu)化

全自動QuEChERS 樣品前處理設(shè)備集成了自動開合蓋、自動加液、自動加鹽、自動加陶瓷勻質(zhì)子、震蕩、渦旋、離心、冰浴和精密移液等功能，儀器集成的上述各獨立模塊，由多功能機械臂為調(diào)度中心，通過算法軟件串聯(lián)各功能模塊，可進行多組樣品并行試驗，一次可同時處理60 個樣品，操作簡單、全程無需人員值守，避免人工操作誤差，保證檢測準(zhǔn)確性，實現(xiàn)全流程自動化檢測，大幅提高了試驗效率。相較于人工QuEChERS，能夠獲得高回收率，同時其結(jié)果穩(wěn)定性也更好。

除上述吸附劑種類外，對試驗結(jié)果準(zhǔn)確度影響較大的參數(shù)還有：純水浸泡時間、浸泡時間、凈化劑使用量。選取上述4 個因素，按照1.4.1 的方法處理空白茶葉樣品，測試0.05 mg/kg 加標(biāo)水平下儀器的前處理效果，以68 種目標(biāo)化合物的平均回收率為測試指標(biāo)，進行四因素三水平的正交試驗。對結(jié)果影響程度依次為吸附劑種類＞吸附劑用量＞浸泡時間＞提取時間，綜合考慮效率、成本等方面，最終選定的前處理條件為浸泡時間30 min，提取時間3 min，凈化吸附劑選用PSA 200 mg，C18200 mg和MWCNTS-NH250 mg。

2.2 儀器條件的優(yōu)化

2.2.1 色譜柱的選擇

主要對比了Waters BEH C18（2.1 mm× 100 mm，1.7 μm） （文獻[19]報道多采用C18色譜柱） 和Waters HSS T3（2.1 mm× 100 mm，1.8 μm） 色譜柱的效果。結(jié)果表明，HSS T3 色譜柱對68 種化合物的保留能力、峰型、化合物響應(yīng)上都優(yōu)于C18色譜柱，因此選擇HSS T3 柱作為分析柱。

2.2.2 流動相的選擇

采用乙腈為有機相；在水相中加入一定比例的乙酸銨可以促進化合物的電離，對比了流動相A 相乙酸銨不同含量和不同流速對目標(biāo)化合物的分離效果的影響。乙酸銨含量主要影響目標(biāo)化合物的保留時間和響應(yīng)強度，流速主要影響目標(biāo)化合物的保留時間和峰形。綜合考慮不同條件下的分離效果，最終選擇濃度為0.002 mol/L 乙酸銨水溶液（含0.02%甲酸） 作為流動相A 相，設(shè)置流速為0.4 mL/min，使目標(biāo)化合物達到一個更好的分離檢測效果。為了實現(xiàn)提高分離效率同時縮短檢測時間，對色譜流動相洗脫程序進行優(yōu)化，使68 種農(nóng)藥的出峰時間介于0.50～6.88 min。

2.3 基質(zhì)效應(yīng)的評價

基質(zhì)效應(yīng)計算公式：

式中：A——目標(biāo)物在樣品基質(zhì)中的峰面積；

B——目標(biāo)物在純?nèi)軇┲械姆迕娣e。

當(dāng)ME 大于0 時表現(xiàn)為基質(zhì)增強；ME 絕對值小于25 %時，基質(zhì)效應(yīng)可忽略；ME 絕對值在25%～50%時，基質(zhì)效應(yīng)略顯著；ME 絕對值大于50%時，基質(zhì)效應(yīng)顯著。

各目標(biāo)農(nóng)藥的線性回歸參數(shù)、檢出限和基質(zhì)效應(yīng)見表2。

表2 各目標(biāo)農(nóng)藥的線性回歸參數(shù)、檢出限和基質(zhì)效應(yīng)

由表2 可知，除甲磺隆、氯磺隆和甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽表現(xiàn)為基質(zhì)增強外，其他65 種目標(biāo)物均表現(xiàn)為基質(zhì)抑制效應(yīng)，且噻蟲嗪、殺蟲脒等7 種農(nóng)藥基質(zhì)效應(yīng)顯著。因此，采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線進行定量，以消除基質(zhì)效應(yīng)。

2.4 線性范圍和檢出限

將茶葉空白樣品用1.4.1 的樣品前處理方法，得到基質(zhì)提取液，再用1.3 中方法制備基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，以每種農(nóng)藥的質(zhì)量濃度為X 軸，定量離子對的峰面積為Y 軸繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。68 種農(nóng)藥在各自線性范圍內(nèi)均呈良好的線性關(guān)系， 線性相關(guān)系數(shù)均高于0.99。68 種農(nóng)藥的LOD（3 S/N） 與LOQ（10 S/N）分別在0.03～1.02 μg/kg 與0.11～3.39 μg/kg。

0.05 mg/kg 基質(zhì)加標(biāo)樣品提取液的MRM 色譜圖見圖1。

圖1 0.05 mg/kg 基質(zhì)加標(biāo)樣品提取液的MRM 色譜圖

2.5 加標(biāo)回收及精密度

在空白茶葉試樣添加水平分別為各農(nóng)藥組分的1 倍定量限、2 倍定量限和10 倍定量限，每個水平做6 個平行。在3 個不同添加水平下，68 種農(nóng)藥的加標(biāo)回收率為73.1%～108.5%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為0.1%～9.3%，表明方法的準(zhǔn)確度和精密度均較好。

2.6 實際樣品檢測

利用所建立的方法對市售的76 份不同茶葉樣品進行68 種農(nóng)藥殘留的檢測。結(jié)果顯示，有16 份樣本均未檢出以上68 種農(nóng)藥；共有15 種農(nóng)藥被檢出，檢出率從高到低依次為聯(lián)苯菊酯、唑蟲酰胺、多菌靈、呋蟲胺、噻嗪酮、茚蟲威、噻蟲嗪、吡蟲啉、噠螨靈、毒死蜱、苯醚甲環(huán)唑、噻蟲啉、吡唑醚菌酯、噻蟲胺、水胺硫磷，分別在53，36，25，22，20，15，13，11，9，7，6，4，4，2，2 份樣本檢出，其中2 份檢出水胺硫磷的茶葉結(jié)果不合格，其他茶葉結(jié)果均合格。

3 結(jié)論

應(yīng)用氨基化多壁碳納米管改進全自動QuECh-ERS 法結(jié)合超高效液相色譜- 串聯(lián)質(zhì)譜，針對茶葉基質(zhì)中68 種農(nóng)藥殘留，建立了一種自動化程度高的樣品前處理與快速檢測技術(shù)。優(yōu)化樣品前處理各參數(shù)，使檢出限和定量限滿足檢測的需求。該方法簡化了復(fù)雜基質(zhì)前處理的流程， 能夠滿足茶葉農(nóng)藥殘留檢測需求，且準(zhǔn)確度高、靈敏度好、分析時間短、簡便快速，可用于大批量茶葉樣品中68 種農(nóng)藥殘留的快速檢測，能夠有效地節(jié)省人力資源和降低出錯率，以期實現(xiàn)實驗室降本增效。