關(guān)鍵詞甾體激素；液相色譜-四極桿-飛行時間質(zhì)譜；同分異構(gòu)體；相對離子豐度

甾體激素具有調(diào)節(jié)生物體生長、發(fā)育及生殖等生物學功能，并能維持人體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)，被作為多囊卵巢綜合征、原發(fā)性醛固酮增多癥和庫欣綜合征等疾病的診斷指標[1-4]。甾體激素的羥基化反應(yīng)通常在肝臟中由CYP450酶介導(dǎo)，主要用于增強其水溶性，促進甾體激素通過尿液或膽汁的排泄。生物體內(nèi)甾體激素水平異常會引起相關(guān)疾病的發(fā)生與發(fā)展，甾體激素結(jié)構(gòu)的差異導(dǎo)致其與特定受體的親和力不同，進而影響藥理活性[5]。此外，羥基化反應(yīng)的區(qū)域選擇性強，并且不同位點的羥基化產(chǎn)物的藥理活性有顯著差異[6]。

甾體激素由膽固醇衍生而來，常具有環(huán)戊烷駢多氫菲結(jié)構(gòu)，根據(jù)結(jié)構(gòu)母核碳數(shù)可分為C18甾體（雌激素類）、C19甾體（雄激素類）和C21甾體（孕激素、糖皮質(zhì)激素和鹽皮質(zhì)激素類）[7]。甾體激素結(jié)構(gòu)母核A環(huán)大多具有C3位羥基或3-酮-4-烯型結(jié)構(gòu)，如孕酮、睪酮和雄烯二酮等，該類激素均為性腺甾體激素。甾體激素在體內(nèi)常發(fā)生羥基化反應(yīng)，包括單羥基化、雙羥基化以及部分三羥基化反應(yīng)[5，8-9]。羥基化的位點不同，會產(chǎn)生多種同分異構(gòu)體，因此甾體激素結(jié)構(gòu)的準確鑒定難度較大。Song等[10]采用三甲基硅烷衍生化并通過氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（GC-MS）鑒定了3-酮-4-烯型甾體激素的羥基化產(chǎn)物，該方法樣品處理步驟繁瑣，并且衍生化溫度過高或反應(yīng)時間過長均可能導(dǎo)致出現(xiàn)多峰，影響化合物結(jié)構(gòu)的準確鑒定。因此，亟需開發(fā)對3-酮-4-烯型甾體激素同分異構(gòu)體準確鑒定的分析方法，這不僅有助于擴大甾體激素對照品庫的規(guī)模，也為深入研究甾體激素水平異常與疾病發(fā)生的關(guān)系提供依據(jù)。

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（Liquidchromatography-tandemmassspectrometry，LC-MS/MS）廣泛應(yīng)用于甾體激素檢測[11]，已成為甾體激素水平檢測的金標準。液相色譜-串聯(lián)三重四極桿飛行時間質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（Liquidchromatography-hybridtriplequadrupole-tandemtimeofflight-massspectrometry，LC-QTOF-MS）具有更高的靈敏度與特異性[12-13]，能夠快速分析復(fù)雜生物基質(zhì)中的甾體激素，并且可以同時檢測多種甾體激素[14-15]，提高了檢測效率[16]。碎片離子相對豐度（Relativeionintensity，RII）可在一定程度上反映離子結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，已用于輔助化合物結(jié)構(gòu)的準確鑒定[17-18]。3-酮-4-烯型甾體激素是甾體激素組的重要組成部分，其多樣化的羥基化產(chǎn)物結(jié)構(gòu)鑒定對甾體激素組的全面表征至關(guān)重要。此類激素通常產(chǎn)生m/z97.06、109.06、121.06和123.08的特征碎片，并呈現(xiàn)不同的豐度分布，因此，基于RII進行結(jié)構(gòu)鑒定具有可行性。本研究通過LC-QTOF-MS技術(shù)結(jié)合RII對體外孵育的3-酮-4-烯型甾體激素的單羥基化產(chǎn)物進行結(jié)構(gòu)鑒定，為甾體激素組的全面表征提供了研究依據(jù)。

1實驗部分

1.1儀器與試劑

LC-20ADXR型分析型高效液相色譜儀（日本Shimadzu公司），配有LC-20ADXR二元高壓泵、DGU-20A真空脫氣機、SIL-20AD自動進樣器、CTO-20AC柱溫箱和二極管陣列（PDA）檢測器；TripleTOF6600+高分辨質(zhì)譜儀（美國SCIEX公司），配有電噴霧離子源（ESI）及PeakviewTM1.2數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)；MTH-100恒溫混勻儀（杭州米歐儀器有限公司）；Eppendorf5424R超速離心機（德國艾本德公司）；XW-80A渦旋混合器（江蘇海門其林貝爾儀器制造有限公司）；XS105型電子分析天平（瑞士Mettler-Toledo公司）；Milli-Q超純水系統(tǒng)（美國Millipore公司）。

對照品：孕酮（Progesterone，P，批號：122322230411）購自上海碧云天生物技術(shù)股份有限公司；睪酮（Testosterone，T，批號：DSTDGQ012502）購自成都樂美天醫(yī)藥科技有限公司；雄烯二酮（Androstenedione，A4，批號：13314）、17α-羥基孕酮（17α-hydroxyprogesterone，17α-OHP，批號：14943）、脫氧皮質(zhì)酮（Deoxycorticosterone，DOC，批號：18447）購自上海詩丹徳生物技術(shù)有限公司。各對照品經(jīng)高效液相色譜（HPLC）檢測，純度均大于98%。氟化銨（批號：J2122068）購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH，批號：D09IS234694）、葡萄糖-6-磷酸（G-6-P，批號：J26IS221070）、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（G-6-PD，批號：M19GS148951）、MgCl2，（批號：RH302910）和三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽緩沖液（Tris-HCl，批號：JR21001A）購自上海源葉生物科技有限公司；商品人源肝微粒體（20mg/mL，批號：TBL）和C57BL/6J小鼠肝微粒體（20mg/mL，批號：WJJW）購自上海瑞德肝臟疾病研究所；質(zhì)譜級乙腈、甲醇購自美國Thermo-Fisher公司；二甲基亞砜（DMSO）購自美國Sigma公司。實驗用水為超純水（18.2MΩ·cm），由Milli-Q純水系統(tǒng)制備。

1.2實驗方法

1.2.1肝微粒體孵育體系

參照文獻[19]的方法進行肝微粒體孵育。反應(yīng)體系緩沖系統(tǒng)為50mmol/LTris-HCl緩沖液（pH7.4），其中包含3.3mmol/LMgCl2、1.0mmol/LNADPH、5.0mmol/LG-6-P、1.0U/mLG-6-PD和1mg/mL肝微粒體，各甾體激素底物濃度為10mmol/L，終體積為100μL，DMSO終濃度小于1%。孵育體系于37℃恒溫振蕩，300r/min預(yù)孵育5min后，加入NADPH啟動反應(yīng)，繼續(xù)孵育2h。反應(yīng)結(jié)束后加入100μL冰乙腈終止反應(yīng)，渦旋1min；在4℃以12000r/min離心10min；取上清液，于–20℃儲存，待LC-MS進樣分析。同時，設(shè)立對照組和空白組，對照組以等量滅活肝微粒體代替有活性肝微粒體，空白組以等量二甲基亞砜（DMSO）溶液代替對照品溶液，平行孵育。

1.2.2液相色譜條件

采用OSAKASODACAPCELLCOREC18型色譜柱（150mm×2.1mm，2.7μm）；流動相：A為0.5mmol/L氟化銨水溶液，B為甲醇溶液；梯度洗脫（0～5min，40%～52%B；5～14min，52%～65%B；14～20min，65%～95%B；20.1～25min，40%B）；流速為0.3mL/min；進樣量為2μL；柱溫為40℃。

1.2.3質(zhì)譜條件

TripleTOF6600+質(zhì)譜儀配備ESI離子源，正離子模式采集，源參數(shù)設(shè)置如下：氣簾氣壓（CUR）為35psi（1psi=6.895kPa），霧化氣壓（GS1）為50psi，輔助氣壓（GS2）為50psi，噴霧電壓（IS）為5500V；離子化溫度（TEM）為500℃。采用實時動態(tài)背景扣除（DBS）和數(shù)據(jù)依賴型采集模式（IDA），MS1及MS2采集范圍均為m/z50～800，分辨率為35000FWHM，碰撞氣為氮氣（N2），碰撞能量（CE）為35eV。使用Peak-ViewTM1.2軟件（美國SCIEX公司）進行色譜峰提取和識別等數(shù)據(jù)處理。

2結(jié)果與討論

2.13-酮-4-烯型甾體激素特征碎片可能的形成機制（以睪酮為例）

睪酮的準分子的離子峰為m/z289.2176[M+H]+，預(yù)測分子式為C19H28O2（誤差為4.9×10–6），在睪酮的二級質(zhì)譜圖（圖1）中，主要碎片離子m/z79.05、97.06、109.06和123.08均由A、B環(huán)開裂生成。特征碎片離子m/z97.06是由C9–C10、C5–C10以及C4–C5鍵斷裂形成，中性丟失一分子H2O（18.00Da）生成碎片離子m/z79.05。碎片離子m/z109.06是由C9–C10鍵和C5–C6鍵斷裂產(chǎn)生；C9–C10鍵和C6–C7鍵斷裂形成碎片離子m/z123.08。睪酮作為3-酮-4-烯型甾體激素的代表化合物，其特征碎片離子及質(zhì)譜裂解規(guī)律有助于其它羥基化產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)鑒定。

2.1.1碎片離子m/z97.06可能的形成機制

Williams等[20]通過氫氘交換實驗證明，睪酮的質(zhì)子化優(yōu)先發(fā)生在C3位氧原子，再由此正電荷中心引發(fā)后續(xù)的裂解。碳氧雙鍵電子轉(zhuǎn)移形成羥基；正電荷轉(zhuǎn)移到C3位，導(dǎo)致C4=C5雙鍵的π鍵斷裂。1對電子轉(zhuǎn)移至3位碳正離子，正電荷轉(zhuǎn)移到C5，引發(fā)C4和C5之間的σ鍵斷裂，電子轉(zhuǎn)移至C5，形成C5=C6雙鍵；C5–C10鍵斷裂，電子移向C4原子，并從溶劑中捕獲1個質(zhì)子形成碳氫鍵，正電荷則轉(zhuǎn)移至C10。C9–C10斷裂，電子轉(zhuǎn)移至C10，形成C1=C10雙鍵，并使正電荷轉(zhuǎn)移到C9；C1=C10雙鍵的π鍵斷裂，電子轉(zhuǎn)移至9位碳正離子，4位碳氫鍵電子也轉(zhuǎn)移至C10，正電荷轉(zhuǎn)移至C4，A環(huán)由六元環(huán)變成五元環(huán)，形成碎片離子m/z97.06?？赡艿男纬蓹C制見圖2。

2.1.2碎片離子m/z109.06可能的形成機制

由C3位羰基氧原子的孤對電子獲得質(zhì)子，得到m/z289.21的準分子離子[M+H]+。碳氧雙鍵的π鍵斷裂，形成1個氫氧鍵及3位碳正離子。C4=C5雙鍵的π鍵斷裂，電子轉(zhuǎn)移至C3，形成C3=C4雙鍵及C5正離子。C5–C6的σ鍵斷裂，電子轉(zhuǎn)移至C5，正電荷轉(zhuǎn)移至C6，C9–C10電子轉(zhuǎn)移至C6，形成C4=C5，碳正離子位于C10。此碳正離子電子云分布不均勻，結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，C4=C5的π鍵斷裂，電子轉(zhuǎn)移至C10，最終形成碎片離子m/z109.06?？赡艿男纬蓹C制見圖3。

2.1.3碎片離子m/z121.06及m/z123.08可能的形成機制

與上述裂解途徑相同，優(yōu)先形成3-羥基-3-烯結(jié)構(gòu)，碳正離子位于C5。隨后分為兩種裂解方式：一種裂解方式為C9–C10鍵斷裂，電子轉(zhuǎn)移形成C5=C10雙鍵，隨后C7–C8鍵斷裂，電子轉(zhuǎn)移至C9形成C8=C9，C6–C7鍵斷裂，電子轉(zhuǎn)移至C7，正電荷轉(zhuǎn)移至C6；另一種裂解方式為C6–C7鍵斷裂，電子轉(zhuǎn)移至C5形成C5=C6雙鍵，C7為碳正離子，C8位碳氫鍵斷裂，電子轉(zhuǎn)移形成C8=C9雙鍵，C9–C10電子轉(zhuǎn)移至C8，正電荷位于C10。以上兩種裂解途徑均可產(chǎn)生m/z123.08的碎片離子，結(jié)構(gòu)差異在于一個雙鍵為C5=C10，另一個雙鍵位于C5=C6，均為烯醇正離子。在質(zhì)譜反應(yīng)中，脫去1個氫分子一般發(fā)生在α，β-位可能有共軛效應(yīng)的離子中，當離子失去氫分子時，會形成新的雙鍵或環(huán)結(jié)構(gòu)，增加離子結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性[21-23]。如圖4所示，兩種烯醇正離子m/z123.08的α-氫原子活性高，易脫去氫分子形成雙鍵，生成穩(wěn)定的共軛結(jié)構(gòu)碎片離子m/z121.06。

2.2碎片離子豐度規(guī)律總結(jié)

研究表明，3-酮-4-烯型甾體激素的羥基化產(chǎn)物中，碎片離子m/z97.06、109.06、121.06和123.08的RII與其羥基化位點密切相關(guān)，并呈現(xiàn)出特定規(guī)律[20，24-25]。在二級質(zhì)譜圖中，一些羥基化產(chǎn)物的MS2與底物相似，其中m/z97.06和109.06的豐度較高，其它碎片離子的RII較低。Kang等[25]通過羥基化孕酮對照品總結(jié)質(zhì)譜裂解規(guī)律，發(fā)現(xiàn)該類羥基化產(chǎn)物通常在D環(huán)結(jié)合，并且m/z109.06與m/z97.06的相對豐度比值越大，羥基在空間上離A環(huán)的位置越遠。從質(zhì)譜裂解機制分析，m/z97.06和109.06主要由A、B環(huán)裂解產(chǎn)生，若羥基化位點位于D環(huán)，對這兩個碎片生成過程的影響較小。此外，D環(huán)羥基可能通過誘導(dǎo)效應(yīng)影響A、B環(huán)的裂解，尤其是m/z109.06碎片離子的形成。因此，碎片離子m/z97.06和109.06的RII及二者的比值可用于推斷3-酮-4-烯型甾體激素的羥基結(jié)合位點。

此外，其它位點的羥基化產(chǎn)物也表現(xiàn)出獨特的碎片離子豐度特征。例如，C2位羥基化的甾體激素，碎片離子m/z121.06的RII最高；C6位羥基化的化合物則呈現(xiàn)出較為平均的碎片離子RII分布，m/z97.06略高于其它離子，而m/z121.06的RII最低。對于C7位羥基化的甾體激素，m/z97.06的RII遠高于其它碎片，這可能是由于C7位羥基化影響m/z109.06的生成，而對m/z97.06的影響較小。

2.3體外孵育3-酮-4-烯型甾體激素單羥基化產(chǎn)物的鑒定

利用LC-QTOF-MS技術(shù)檢測孕酮、睪酮、雄烯二酮、17α-羥基孕酮及脫氧皮質(zhì)酮的體外孵育產(chǎn)物，結(jié)合前期總結(jié)的RII規(guī)律，共檢測到37種單羥基化產(chǎn)物，其中鑒定了31種單羥基化產(chǎn)物，包括孕酮的8種羥基化產(chǎn)物、睪酮的6種羥基化產(chǎn)物、雄烯二酮的5種羥基化產(chǎn)物（A4-1～A4-6）、17α-羥基孕酮的8種羥基化產(chǎn)物（17α-OHP-1～17α-OHP-9）及脫氧皮質(zhì)酮的4種羥基化產(chǎn)物（DOC-1～DOC-4），具體鑒定結(jié)果見電子版文后支持信息表S1。

2.3.1孕酮單羥基化產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)鑒定

孕酮及其單羥基化產(chǎn)物的提取離子流圖見圖5A，共檢測到9種羥基化產(chǎn)物（P-1～P-9）。通過分析P-1～P-9的RII值（圖5B），結(jié)合前期總結(jié)的3-酮-4-烯型甾體激素RII規(guī)律，發(fā)現(xiàn)化合物P-2、P-3、P-4、P-6和P-9的m/z109.06和97.06的RII值顯著高于其它離子，推測其羥基化位點位于孕酮的D環(huán)。通過比較RII值確定具體的取代位點，依次為RIIP-6（1.06±0.01）（m/z109/97）gt;RIIP-9（1.05±0.11）（m/z109/97）gt;RIIP-3（0.96±0.01）（m/z109/97）gt;RIIP-2（0.82±0.01）（m/z109/97）gt;RIIP-4（0.76±0.04）（m/z109/97）。因此，將化合物P-2、P-3、P-4、P-6和P-9分別鑒定為15-羥基孕酮、16-羥基孕酮、14-羥基孕酮、21-羥基孕酮和17α-羥基孕酮。其中，通過對照品準確指認21-羥基孕酮與17α-羥基孕酮。此外，化合物P-1的碎片離子m/z97.06的RII值明顯高于其它碎片離子，符合7位羥基取代的特征，鑒定為7-羥基孕酮；化合物P-7和P-8的RII值與文獻中C2位羥基化的3-酮-4-烯型甾體激素相似，結(jié)合相對保留時間，分別鑒定為2β-羥基孕酮及2α-羥基孕酮[20，24-25]。

2.3.2睪酮單羥基化產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)鑒定

睪酮及其單羥基化產(chǎn)物的提取離子流圖如圖6A所示，共檢測到9種羥基化產(chǎn)物（T-1～T-9）。根據(jù)化合物T1～T9的RII值，發(fā)現(xiàn)化合物T-2、T-3、T-5和T-6的m/z109.06與m/z97.06的RII值顯著高于其它離子（圖6B）。初步推斷羥基化位點發(fā)生在睪酮的D環(huán)。進一步比較m/z109.06和97.06的RII值，確定了具體的羥基化位點：RIIT-6（0.97±0.02）（m/z109/97）=RIIT-5（0.97±0.01）（m/z109/97）gt;RIIT-2（0.94±0.03）（m/z109/97）gt;RIIT-3（0.80±0.03）（m/z109/97）。因此，化合物T-2和T-3分別被鑒定為16-羥基睪酮和18-羥基睪酮。因T-5及T-6的RII值差異較小難以區(qū)分，將二者共同歸屬為15-羥基睪酮或14-羥基睪酮。此外，化合物T-4的RII（m/z97）顯著高于其它碎片離子，符合C7位取代特征，將其鑒定為7-羥基睪酮；化合物T-1的RII值與文獻報道的6-羥基睪酮高度相似，將其歸屬為6-羥基睪酮[20]；化合物T-8及T-9的RII值符合C2位羥基化的3-酮-4-烯型甾體激素，結(jié)合相對保留時間，分別鑒定為2β-羥基睪酮和2α-羥基睪酮[20，24-25]。

2.3.3雄烯二酮單羥基化產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)鑒定

圖7A為雄烯二酮及其單羥基化產(chǎn)物的提取離子流圖，共檢測到6種羥基化產(chǎn)物（A4-1～A4-6）。通過分析化合物A4-1和A4-3的m/z109.06和97.06碎片離子的RII值（圖7B），發(fā)現(xiàn)其RII值顯著高于其它離子，推測化合物A4-1和A4-3的D環(huán)發(fā)生了羥基化。進一步比較m/z109.06和97.06的RII比并結(jié)合羥基取代空間位阻，確定了具體的取代位點：RIIA4-1（0.99±0.02）（m/z109/97）gt;RIIA4-3（0.77±0.03）（m/z109/97），因此化合物A4-1和A4-3分別歸屬為16-羥基雄烯二酮和15-羥基雄烯二酮。此外，化合物A4-4的RII（m/z97）顯著高于其它離子，符合7位取代的3-酮-4-烯型甾體激素特征，鑒定為7-羥基雄烯二酮；化合物A4-5和A4-6的RII值與文獻中C11位羥基化甾體激素一致，結(jié)合相對保留時間，分別鑒定為11α-羥基雄烯二酮和11β-羥基雄烯二酮[20，24-25]。

2.3.417α-羥基孕酮的單羥基化產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)鑒定

17α-羥基孕酮及其單羥基化產(chǎn)物的提取離子流圖見圖8A，共檢測到9種羥基化產(chǎn)物（17α-OHP-1～17α-OHP-9），分析其碎片離子豐度圖（圖8B）發(fā)現(xiàn)，化合物17α-OHP-1、17α-OHP-6、17α-OHP-7和17α-OHP-9的m/z109.06和97.06的豐度較高，推測這些化合物的D環(huán)發(fā)生了羥基化反應(yīng)。通過比較m/z109.06與m/z97.06的豐度比及羥基取代的空間位阻進一步確定其取代位點，依次為：RII17α-OHP-7（1.17±0.03）（m/z109/97）gt;RII17α-OHP-9（1.12±0.02）（m/z109/97）gt;RII17α-OHP-1（0.50±0.05）（m/z109/97）gt;RII17α-OHP-6（0.25±0.03）（m/z109/97），基于以上比值，化合物17α-OHP-7、17α-OHP-9、17α-OHP-1和17α-OHP-6分別被歸屬為16，17α-雙羥基孕酮、15，17α-雙羥基孕酮、14，17α-雙羥基孕酮和17α，18-雙羥基孕酮。此外，化合物17α-OHP-2的RII（m/z97）較高，符合7位取代的3-酮-4-烯型甾體激素的碎片離子豐度特征，因此將其歸屬為7，17α-雙羥基孕酮；化合物17α-OHP-4和17α-OHP-5的碎片豐度比例與文獻報道的11位羥基化3-酮-4-烯型甾體激素特征高度相似，結(jié)合相對保留時間，分別歸屬為11α，17α-雙羥基孕酮和11β，17α-雙羥基孕酮[20，24-25]；化合物17α-OHP-8的RII值與文獻中2位羥基化的3-酮-4-烯型甾體激素一致，因此被歸屬為2，17α-雙羥基孕酮。

2.3.5脫氧皮質(zhì)酮的單羥基化產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)鑒定

脫氧皮質(zhì)酮及其單羥基化產(chǎn)物的提取離子流圖見圖9A，共檢測到4種羥基化產(chǎn)物（DOC-1～DOC-4）。在化合物DOC-1～DOC-4的碎片離子相對豐度圖（圖9B）中，化合物DOC-2和DOC-3的m/z109.06和97.06的RII值顯著高于其它離子，推測其羥基化位點位于D環(huán)。通過比較其m/z109.06與m/z97.06的RII值比值以及羥基取代的空間位阻，進一步確定取代位點：RIIDOC-3（m/z109/97）（1.00±0.03）gt;RIIDOC-2（m/z109/97）（0.83±0.01），因此，化合物DOC-2和DOC-3分別被歸屬為16-羥基脫氧皮質(zhì)酮和15-羥基脫氧皮質(zhì)酮。此外，化合物DOC-1的RII（m/z97）顯著高于其它碎片離子，符合7位取代的3-酮-4-烯型甾體激素的碎片離子豐度特征，因此歸屬為7-羥基脫氧皮質(zhì)酮；化合物DOC-4的RII與文獻[20]報道的6位羥基化3-酮-4-烯型甾體激素特征高度相似，故歸屬為6-羥基脫氧皮質(zhì)酮。

化合物P-5、T-7、A4-2及17α-OHP-3的碎片離子豐度特征不符合前期總結(jié)的RII規(guī)律，因此尚不確定其羥基化位點。

3結(jié)論

通過肝微粒體體外孵育法獲得了3-酮-4-烯型甾體激素的單羥基化產(chǎn)物，采用LC-QTOF-MS技術(shù)結(jié)合碎片離子RII值規(guī)律，在5種3-酮-4-烯型甾體激素的羥基化產(chǎn)物中共鑒定了31種單羥基化產(chǎn)物，利用對照品準確指認了2種化合物。為提高檢測靈敏度和分離效果，選擇氟化銨水溶液為流動相，因氟化銨在水溶液中解離為NH4+與F?離子，NH4+會通過結(jié)合水中的OH?或生成NH3等方式釋放H+，提高目標分子形成[M+H]+離子的效率。由于化合物P-5、T-7、A4-2和17α-OHP-3的碎片離子豐度特征與總結(jié)的RII規(guī)律不符，無法確定其羥基化位點。3-酮-4-烯型甾體激素主要的羥基化位點包括C2位、C6位、C7位、C11位、C14位、C15位、C16位、C17位、C18位和C21位。D環(huán)羥基化甾體激素的碎片離子m/z97.06和109.06的RII顯著高于其它碎片離子，而其它位點的羥基化產(chǎn)物的RII各有特征。根據(jù)3-酮-4-烯型甾體激素共有的特征碎片離子m/z97.06、109.06、121.06及123.08可能的形成機制，進一步揭示了不同羥基化位點的碎片離子RII存在差異的可能原因。盡管部分化合物以及多羥基化甾體激素的羥基化位點仍未完全確定，后期可采用能量分辨質(zhì)譜結(jié)合量子化學計算等技術(shù)對其進行鑒定。本研究通過分析3-酮-4-烯型甾體激素及其羥基化產(chǎn)物的碎片離子RII特征，對其體外孵育產(chǎn)物進行了鑒定，為3-酮-4-烯型甾體激素羥基化產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)鑒定提供了新思路，也為甾體激素全面表征方法的建立奠定了研究基礎(chǔ)。