史程程,陳 鵬,焦清正,劉藝平,劉紅利

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 風(fēng)景園林與藝術(shù)學(xué)院,鄭州 450000)

花色是觀賞植物的重要性狀之一,影響著園林植物的觀賞價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值,而類黃酮物質(zhì)中花青素苷(anthocyanin)是影響大多數(shù)觀賞植物呈色的主要原因之一[1]。近年來社會(huì)各界采用各種方法改變花色達(dá)到創(chuàng)造新奇色彩、擴(kuò)充稀缺花色資源的目的,其中最有效的是基于花青素苷呈色機(jī)理分子育種手段[2-4]?；ㄇ嗨厥且环N多酚類水溶性色素,廣泛存在于不同植物的各個(gè)植物組織中,從而使其呈現(xiàn)出紅、藍(lán)、紫等不同顏色[5-7]。植物形成豐富色彩表型的原因是多樣的,植物體內(nèi)花青素代謝途徑不同、花青素的含量不同以及環(huán)境影響等因素共同作用使植物展現(xiàn)不同的顏色[8-9]。

目前花青素生物合成途徑已清晰明了,其合成過程主要受兩類基因的調(diào)控:一類是編碼花青素生物合成各種酶的結(jié)構(gòu)基因,一類是起轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用的調(diào)節(jié)基因,其主要通過MYB-bHLH-WD40(MBW)三元復(fù)合物的形式發(fā)揮作用[10-12]。

MYB轉(zhuǎn)錄因子在植物生長(zhǎng)發(fā)育過程中廣泛參與植物色素合成、細(xì)胞分化與發(fā)育、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)以及抗病抗逆等次生代謝過程[13-17]。MYB 轉(zhuǎn)錄因子在N端含有高度保守的DNA 結(jié)合域,即MYB 結(jié)構(gòu)域,每個(gè)結(jié)構(gòu)域含有50～53 個(gè)氨基酸殘基,根據(jù)含有MYB結(jié)構(gòu)域的數(shù)量可將其分為4個(gè)亞家族,分別是1R(R1/2/3-MYB)、2R(R2R3-MYB)、3R(R1R2R3-MYB)和4R(含有4個(gè)R1/R2重復(fù)基序)[18-19]。其中R2R3-MYB在植物中的研究最為廣泛,發(fā)揮著各種各樣的功能,尤其是在調(diào)控花青素生物合成方面表現(xiàn)出較高的特異性,其活性通常決定了特定細(xì)胞花青素的含量、花色強(qiáng)度和模式[20-21]。它們能夠與結(jié)構(gòu)基因啟動(dòng)子結(jié)合,從而促進(jìn)或抑制結(jié)構(gòu)基因表達(dá),發(fā)揮調(diào)控花青素生物合成的功能。如蘋果(Malus×domestica)中MdMYB306-like直接抑制結(jié)構(gòu)基因MdDFR的表達(dá),負(fù)調(diào)控蘋果表皮花青素的合成[22];菊花(Chrysanthemummorifolium)CmMYB21在植物褪色過程中表達(dá)水平增高,抑制CmDFR啟動(dòng)子活性,是調(diào)控花青苷代謝的轉(zhuǎn)錄抑制因子[23];水仙(Narcissustazetta)中NtMYB12直接與NtFLS、Nt-LAR、NtDFR啟動(dòng)子結(jié)合,激活NtFLS和NtLAR表達(dá),抑制NtDFR表達(dá),導(dǎo)致中國水仙(原)花青素含量低,類黃酮含量高[24];牡丹(Paeoniasuffruticosa)PsMYB30激活PsANS的表達(dá)[25],PsMYB12通過調(diào)節(jié)PsCHS表達(dá)[26],都能促進(jìn)花瓣色斑形成。因此,研究觀賞植物花青素生物合成相關(guān)的R2R3-MYB基因?qū)?shí)現(xiàn)花色定向改良十分重要。

葡萄風(fēng)信子(Muscariarmeniacum)是從歐洲引進(jìn)的多年生單子葉球根花卉,花序似成串的葡萄,花姿秀麗,具有較高的觀賞價(jià)值。因其罕有的藍(lán)色花色及簡(jiǎn)單的花色遺傳背景深受大眾和科研工作者的青睞,是研究藍(lán)色花形成機(jī)制的理想植物材料[27-29]。本研究以葡萄風(fēng)信子亞美尼亞(M.armeniacum)為試驗(yàn)材料,基于課題組前期獲得的葡萄風(fēng)信子M.armeniacum轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫,利用RT-PCR 法克隆獲得1條R2R3-MYB 序列,命名為MaMYB114。對(duì)基因序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析、亞細(xì)胞定位、轉(zhuǎn)錄自激活活性分析、時(shí)空表達(dá)模式分析及異源過表達(dá)煙草,以明確該基因的功能,為分子育種定向改良花色提供基因資源,進(jìn)一步為探究葡萄風(fēng)信子藍(lán)色花色形成機(jī)理提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

葡萄風(fēng)信子‘亞美尼亞’(M.armeniacum)植株栽植于河南農(nóng)業(yè)大學(xué)第三試驗(yàn)田?；òl(fā)育階段定義如下:S1(Stage1),未著色的花蕾;S2(Stage2),開始著色的花蕾;S3(Stage3),完全著色但未開放的花蕾;S4(Stage4),花完全著色且完全開放;S5(Stage5),衰敗但未萎蔫的花。根據(jù)葡萄風(fēng)信子生長(zhǎng)時(shí)期采集植株的根、鱗莖、葉片及5個(gè)發(fā)育時(shí)期的花(圖1),樣品用液氮冷凍后存放于-80 ℃冰箱用于后續(xù)的試驗(yàn)分析。

圖1 葡萄風(fēng)信子全株、花序及5個(gè)花發(fā)育時(shí)期的花S1-S5,Stage1-5;Bar,1 cm.Fig.1 Total plant,inflorescence and tepals at five developmental stages of M.armeniacum

本氏煙草(Nicotianabenthamiana)種子保存于實(shí)驗(yàn)室。種子播種在基質(zhì)中,在光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng),光周期為14 h/10 h 晝/夜,待植株長(zhǎng)至4～6片真葉后用于下一步試驗(yàn)。煙草(N.tabacum‘SR’)種子經(jīng)消毒后播種于MS培養(yǎng)基上,放置在培養(yǎng)室,光照周期為晝夜14 h/10 h,溫度25 ℃。植株生長(zhǎng)至4～6片葉時(shí)用于遺傳轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)。

1.2 總RNA提取和cDNA合成

將葡萄風(fēng)信子(M.armeniacum)的根、鱗莖和葉片及5 個(gè)時(shí)期的花經(jīng)液氮研磨后,根據(jù)Omega Plant RNA kit(美國Omega公司)試劑盒說明書方法提取各組織樣品中的總RNA,RNA 質(zhì)量經(jīng)過1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。根據(jù)Primer Script Rt reagent Kit with gDNA Eraser(南京諾維贊生物科技有限公司)說明書方法獲得相應(yīng)組織的cDNA,-20 ℃保存。

1.3 MaMYB114 基因克隆

以葡萄風(fēng)信子(M.armeniacum)花5 個(gè)時(shí)期的cDNA 等量混合物為模板,利用 Premier 5.0設(shè)計(jì)基因克隆引物(表1),引物及測(cè)序都由上海生物工程有限公司完成。按照KOD-Plus高保真酶(東洋紡生物科技有限公司,上海)說明書方法擴(kuò)增,獲得PCR 產(chǎn)物膠回收后連接pMD-18T 載體,轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)(Top10),挑取單克隆菌斑在LB(Luria-Bertani)液體培養(yǎng)基、37 ℃搖床培養(yǎng)8 h,經(jīng)菌液PCR 檢測(cè)送陽性克隆測(cè)序。

表1 本研究中所用引物序列Table 1 Primer sequences in this study

1.4 生物信息學(xué)分析

利用ExPASy在線軟件(https://web.expasy.org/protparam/)對(duì)目的基因編碼蛋白的理化性質(zhì)進(jìn)行預(yù)測(cè)和分析;分別用SOPMA(https://npsaprabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl? page=npsa_sopma.html)和SWISS-MODEL(https://swiss-model.expasy.org/)進(jìn)行蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè);通過Expasy Protscale(https://web.expasy.org/protscale/)進(jìn)行親疏水性分析;利用DANMAN9.0軟件進(jìn)行多重序列比對(duì)并分析其中的保守結(jié)構(gòu)域。采用MEGA7.0 軟件中鄰近法(neighbor joining,NJ)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。利用PSORT (https://www.genscript.com/tools/psort),Plant-mPLoc(http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Cell-PLoc-2/)和TargetP 2.0(https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?TargetP-2.0)在線工具進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)

實(shí)時(shí)定量PCR 以葡萄風(fēng)信子‘亞美尼亞’(M.armeniacum)的根、鱗莖和葉片及5個(gè)時(shí)期花的cDNA為模板,反應(yīng)體系和反應(yīng)程序按AceQ? Universal SYBR qPCR Master Mix(南京諾維贊生物科技有限公司)說明書設(shè)置,使用2-ΔΔCT 法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量[30]。每個(gè)樣本3 個(gè)生物學(xué)重復(fù),MaActin作為葡萄風(fēng)信子的內(nèi)參基因[29],基因定量引物及內(nèi)參基因引物見表1。

1.6 亞細(xì)胞定位

采用同源重組的方式將MaMYB114基因開封閱讀框(open reading frame,ORF)(去除終止密碼子)連接到植物表達(dá)載體pC2300 的2 個(gè)酶切位點(diǎn)KpnⅠ和SalⅠ之間,獲得融合GFP的植物表達(dá)載體pC2300-MaMYB114-GFP(MaMYB114:GFP),所用引物見表1。參照盧瑤等的方法進(jìn)行亞細(xì)胞定位觀察[31]。

1.7 轉(zhuǎn)錄激活活性試驗(yàn)

采用同源重組的方法將MaMYB114基因的ORF序列構(gòu)建到酵母表達(dá)載體pGBKT7的2個(gè)酶切位點(diǎn)NdeⅠ和BamHⅠ之間,獲得酵母表達(dá)載體pGBKT7/MaMYB114,所用引物見表1。參照Li等的方法[32]進(jìn)行酵母轉(zhuǎn)化和陽性菌株的篩選。轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒分別為目的質(zhì)粒(pGBKT7/MaMYB114)、陽性對(duì)照(pGBKT7-53+pGBKT7-T)以及陰性對(duì)照(pGBKT7-blam+pGBKT7-T)。觀察轉(zhuǎn)化菌斑在SD/-Trp/-Leu、含40 mg/mL X-a-gal的SD/-Trp/-Leu 培養(yǎng)基以及含40 mg/mL X-a-gal 的SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)情況。

1.8 煙草遺傳轉(zhuǎn)化

將植物過表達(dá)載體pC2300-MaMYB114-GFP和pC2300-GFP 利用葉盤法[27]轉(zhuǎn)化煙草(Nicotianatabacum‘SR’)。將篩選得到的不定芽切下放置于生根培養(yǎng)基上生長(zhǎng),待根生長(zhǎng)至2 cm 左右時(shí),對(duì)組培苗進(jìn)行煉苗,然后移至無菌基質(zhì)中,在溫室中進(jìn)行培養(yǎng)。收集陽性苗種子,使用T1代株系進(jìn)行基因功能分析。

1.9 花青苷的提取和含量測(cè)定

植物材料稱量后經(jīng)液氮充分研磨,用花青苷提取液浸提?；ㄇ嘬仗崛∫簽?%的鹽酸甲醇溶液[33]。在4 ℃冰箱中避光靜置,每6 h振蕩混勻1次,24 h后取上清液,使用酶標(biāo)儀測(cè)量在530 nm 和657 nm 處的吸光度?；ㄇ嘬蘸坑?jì)算公式:QAnthocyanins=(A530-0.25×A657)×mDW。葡萄風(fēng)信子所有樣品總花青苷的相對(duì)含量分別采用單位干重表示。每個(gè)試驗(yàn)3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因克隆及生物學(xué)信息學(xué)分析

2.1.1 MaMYB114 基因克隆

通過PCR擴(kuò)增,從葡萄風(fēng)信子花瓣中克隆獲得到1條714 bp左右的的基因序列(圖2),ORF編碼237個(gè)氨基酸(圖3),命名為MaMYB114,將得到的MaMYB114序列提交到GenBank,登錄號(hào)為OQ615377。

圖2 葡萄風(fēng)信子MaMYB114 基因PCR擴(kuò)增瓊脂糖凝膠電泳M.DL2000 DNA marker;A.The amplification of full-length cDNA of MaMYB114.Fig.2 Agarose gel electrophoresis of PCR amplified products of MaMYB114 from M.armeniacum

圖3 葡萄風(fēng)信子MaMYB114 基因序列全長(zhǎng)及其推導(dǎo)氨基酸序列The amino acid sequences marked by black underlinei ndicated the conserved MYB domain (i.e.R2R3 repeats).Fig.3 The full length of cDNA and deduced amino acid sequences of MaMYB114 from M.armeniacum

2.1.2理化性質(zhì)分析與結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

葡萄風(fēng)信子MaMYB114由237個(gè)氨基酸殘基組成,在組成該蛋白的氨基酸中,甘氨酸(Leu)所占比例最高,為9.7%,而半胱氨酸(Cys)、甲硫氨酸(Met)、蘇氨酸(Thr)所占比例最低,為1.3%。負(fù)電荷殘基(Asp+Glu)33 個(gè),正電荷殘基(Arg+Lys)37個(gè)。

MaMYB114的分子式為C1192H1869N353O349S6,理論等電點(diǎn)(pI)為8.87,不穩(wěn)定指數(shù)為41.86,這表明該蛋白為不穩(wěn)定蛋白。Expasy Protscale顯示蛋白總親水性平均系數(shù)(GRAVY)為-0.775,這說明該蛋白是親水性蛋白(圖4)。通過在線軟件對(duì)MaMYB114蛋白的二、三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè),結(jié)果(圖5)表 明,MaMYB114 蛋白由38.40%的α-螺旋、11.39%的延伸鏈和50.21%的無規(guī)卷曲構(gòu)成,而三級(jí)結(jié)構(gòu)較為簡(jiǎn)單。

圖4 MaMYB114蛋白親水/疏水性預(yù)測(cè)分析Fig.4 Prediction of hydrophilic/hydrophobicity for MaMYB114 protein

圖5 MaMYB114蛋白二、三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)A.Secondary structure,Blue.Alpha helix,Purple.Random coil.Red.Extended strand;B.Tertiary structure.Fig.5 Secondary and tertiary structure prediction of the MaMYB114 protein

2.1.3MaMYB114序列比對(duì)及聚類分析

從NCBI數(shù)據(jù)庫下載擬南芥、矮牽牛和金魚草等花青素生物合成相關(guān)的R2R3-MYB氨基酸序列,使用DANMAN9.0 軟件將MaMYB114 與其進(jìn)行多重序列比對(duì)。

結(jié)果(圖6)顯示,葡萄風(fēng)信子MaMYB114蛋白在N 端高度保守,與其他物種R2R3-MYB 同源蛋白一樣含有R2和R3 結(jié)構(gòu)域,而在C 端的同源性低,屬于R2R3-MYB家族的轉(zhuǎn)錄因子。MaMYB114的N 端保守結(jié)構(gòu)域內(nèi)存在3個(gè)雙子葉植物花青苷相關(guān)R2R3-MYB的保守氨基酸,在圖6中用黑色實(shí)心圓點(diǎn)標(biāo)注;在R3結(jié)構(gòu)域中含有與bHLH 蛋白互作的保守基序([D/E]LX2[R/K]X3LX6X3R),在圖中用黑色矩形標(biāo)注。系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖7)顯示,MaMYB114與洋蔥AcMYB1的同源性最高,與矮牽牛PhPAP1、擬南芥AtPAP1、PAP2 以及煙草NtAN2等參與花青苷合成調(diào)控的R2R3-MYB共同聚為AN2亞組。

圖6 葡萄風(fēng)信子MaMYB114與其他物種R2R3-MYB蛋白序列比對(duì)分析The black box,bHLH interacting motif;Black solid dot,conserved amino acids [arginine (R),valine (V),alanine (A)].Fig.6 Sequence alignment analysis of MaMYB114 (M.armeniacum) with R2R3-MYB proteins from other species

圖7 葡萄風(fēng)信子MaMYB114與其他參與花青苷合成相關(guān)R2R3-MYB的系統(tǒng)進(jìn)化分析Fig.7 Phylogenetic analysis of MaMYB114 from M.armeniacum with other R2R3-MYBs involved in the anthocyanin biosynthesis

2.1.4亞細(xì)胞定位

網(wǎng)頁預(yù)測(cè)MaMYB114蛋白在細(xì)胞中定位于細(xì)胞核,為驗(yàn)證預(yù)測(cè)結(jié)果,在本氏煙草中瞬時(shí)過表達(dá)pC2300-MaMYB114-GFP,以pC2300-GFP 為對(duì)照使用激光共聚焦顯微鏡觀察蛋白亞細(xì)胞定位情況。結(jié)果(圖8)表明,對(duì)照pC2300-GFP在整個(gè)細(xì)胞中表達(dá),而融合蛋白MaMYB114-GFP于本氏煙草葉片的細(xì)胞核中發(fā)出綠色熒光,與DAPI(標(biāo)示細(xì)胞核)的藍(lán)色熒光重合,表明MaMYB114蛋白定位于細(xì)胞核。

圖8 MaMYB114蛋白亞細(xì)胞定位Fig.8 Subcellular localization of MaMYB114

2.1.5MaMYB114轉(zhuǎn)錄激活活性試驗(yàn)

在酵母中檢驗(yàn)MaMYB114 的轉(zhuǎn)錄自激活活性。圖9顯示,pGBKT7/MaMYB114和pGBKT7-53/pGBKT7-53(陽性對(duì)照)能在添加40 mg/mL Xa-gal 的SD/-Trp/-Leu培養(yǎng)基以及含40mg/mL Xa-gal的SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade培養(yǎng)基上生長(zhǎng),菌斑呈現(xiàn)藍(lán)色,而pGBKT7-blam/pGBKT7-T(陰性對(duì)照)在SD/-Trp/-Leu/X-a-gal培養(yǎng)基上生長(zhǎng)但不變藍(lán),在SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade/X-a-gal上不生長(zhǎng),這些結(jié)果說明MaMYB114具有轉(zhuǎn)錄激活活性。

圖9 葡萄風(fēng)信子MaMYB114轉(zhuǎn)錄激活活性分析Positive control.pGBKT7-53 plus pGADT7-T;Negative control.pGBKT7-blam plus pGADT7-T.Fig.9 The transcription activation ability of MaMYB114 from M.armeniacum

2.1.6葡萄風(fēng)信子總花青苷相對(duì)含量測(cè)定和MaMYB114轉(zhuǎn)錄表達(dá)分析

為了探究MaMYB114轉(zhuǎn)錄表達(dá)與花青苷積累的關(guān)系,檢測(cè)了葡萄風(fēng)信子根、鱗莖、葉、花中的總花青苷含量(圖10,A)及MaMYB114的表達(dá)水平(圖10,B)。結(jié)果表明,花青苷主要在葡萄風(fēng)信子的花中積累,在5個(gè)花發(fā)育時(shí)期總花青苷含量呈現(xiàn)出先增高后降低的趨勢(shì),在未著色的S1時(shí)期花青苷的積累極少,隨著花發(fā)育進(jìn)程,花青素從開始著色的S2時(shí)期開始增加,在完全著色的S3和S4時(shí)期高表達(dá),在開始衰敗的 S5 時(shí)期降低(圖10,A)。MaMYB114在葡萄風(fēng)信子花的5個(gè)發(fā)育時(shí)期的基因表達(dá)水平顯著高于根、鱗莖和葉片,表達(dá)水平具有組織特異性。MaMYB114基因表達(dá)水平在花5個(gè)發(fā)育時(shí)期的表達(dá)量總體上呈現(xiàn)出先增高后降低的趨勢(shì),在S1時(shí)期低表達(dá),隨著花開始著色,花青苷含量增加,在S2時(shí)期快速升高,特別是在S3時(shí)期達(dá)到最大值,S4和S5時(shí)期降低(圖10,B),與花青苷積累的趨勢(shì)相似,呈現(xiàn)極顯著的正相關(guān)(Pearson相關(guān)系數(shù),r=0.793)。

圖10 葡萄風(fēng)信子不同組織器官中總花青素相對(duì)含量及MaMYB114 轉(zhuǎn)錄表達(dá)分析A.The total anthocyanins content of roots,bulbs,and flowers at the five flower developmental stages (S1-S5);B.The expression profiles of MaMYB114 in roots,bulbs,leaves,and five flowers developmental stages of M.armeniacum.MaActin was the reference gene.Each column represents the means±SD from three technical replicates.Fig.10 The total anthocyanins content in roots,bulbs,and flowers of M.armeniacum and the expression profiles of MaMYB114 in these tissues

2.2 MaMYB114在煙草中異源過表達(dá)

為了進(jìn)一步確定葡萄風(fēng)信子花色相關(guān)R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子基因MaMYB114在花青苷合成中的作用,我們將植物過表達(dá)載體pC2300-MaMYB114-GFP和空載體pC2300-GFP通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化煙草‘SR’葉盤,以轉(zhuǎn)化空載體(CT)為對(duì)照。過量表達(dá)MaMYB114(OE-MaMYB14)使煙草(圖11)的營養(yǎng)器官和生殖器官積累大量花青苷。過表達(dá)MaMYB114的煙草葉片相比轉(zhuǎn)化空載體煙草葉片顏色加深(圖11,D);對(duì)照組煙草(CT)花冠顏色為粉色,而OE-MaMYB14煙草花冠及花冠筒變?yōu)樯钭霞t色(圖11,C);此外,種皮、花萼、花藥和花絲也呈現(xiàn)出強(qiáng)烈的深紫紅色(圖11,A,B)。這些結(jié)果證明,MaMYB114具有正調(diào)控花青苷的功能。

圖11 過表達(dá)MaMYB114 和空載體基因的煙草表型分析OE-MaMYB114,MaMYB114 overexpress tobacco lines;CT.Transgenic tobacco lines transformed with the empty vector (control).A.Seed;B.Sepal,anther,filament,ovary;C.Petal;D.Whole plant.Fig.11 Tobacco phenotypic analysis of overexpressing MaMYB114 and empty vector genes

3 討論

MYB轉(zhuǎn)錄因子是植物中的轉(zhuǎn)錄因子家族之一,其中R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子廣泛參與多種植物響應(yīng)生物及非生物脅迫、生長(zhǎng)發(fā)育及花青苷合成調(diào)控等過程,它們通常在其N 端都具有1個(gè)高度保守的DNA 結(jié)合區(qū)域(即R2R3 repeats),而在其C 端具有1個(gè)可變區(qū)域[14]。本研究從單子葉植物葡萄風(fēng)信子的花中克隆獲得1個(gè)花色相關(guān)的R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子基因MaMYB114,它編碼的氨基酸序列中含有2個(gè)SANT 結(jié)構(gòu),屬于典型的R2R3-MYB。在馬鈴薯(Solanumtuberosum)中,MYB 轉(zhuǎn)錄因子StAN1含有bHLH 互作區(qū),在煙草葉片中瞬時(shí)共表達(dá)StbHLH1和StAN1時(shí),能夠使煙草葉片積累花青素[34];同理,蘋果(Malus×domestica)MdbHLH3和MdbHLH3與MdMYB10相互作用參與花青素生物合成的調(diào)節(jié)[35]。MaMYB114在R3結(jié)構(gòu)域中存在與bHLH 蛋白互作的結(jié)合位點(diǎn),推測(cè)其能通過與bHLH形成復(fù)合物參與花青苷合成調(diào)控。

根據(jù)序列同源性可將與花青素合成相關(guān)的R2R3-MYB分為AN2亞組和C1亞組,分別對(duì)應(yīng)擬南芥R2R3-MYB的25個(gè)亞組中的第6亞組和第5亞組[36]。參與單子葉植物花青苷調(diào)控的主要聚為C1亞組,而參與雙子葉植物花青苷調(diào)控的以AN2亞組為主。也存在屬于AN2亞組的調(diào)控單子葉植物花青苷的R2R3-MYB,如百合LhMYB6[37],小蒼蘭FhPAP1[38]以及葡萄風(fēng)信子MaAN2和MaMybA[27]?；谛蛄蟹治龊途垲惙治鼋Y(jié)果,初步推測(cè)MaMYB114具有調(diào)控花青苷合成的能力。

亞細(xì)胞定位(圖8)及轉(zhuǎn)錄激活活性(圖9)分析結(jié)果表明MaMYB114定位于細(xì)胞核且具有轉(zhuǎn)錄自激活活性,符合轉(zhuǎn)錄因子一般特征。MaMYB114在葡萄風(fēng)信子的花中優(yōu)勢(shì)表達(dá),具組織特異性,且隨著花發(fā)育進(jìn)程呈現(xiàn)出先增高后降低的趨勢(shì),在S3時(shí)期達(dá)到極值,在S4時(shí)期降低,與花青苷積累的趨勢(shì)相似,呈現(xiàn)極顯著的正相關(guān)(Pearson 關(guān)系數(shù)r=0.793)。這進(jìn)一步表明在葡萄風(fēng)信子花發(fā)育過程中,MaMYB114可能參與花青苷的合成調(diào)控,且在花發(fā)育的早期(S2-S3時(shí)期)起主要調(diào)控作用。

在模式植物中異源過表達(dá)目的基因能為基因功能鑒定提供依據(jù),荔枝LcMYB1[38]、楊梅MrMYB1[39]、小蒼蘭FhMYB5[40]以及百合LhMYB12-Lat[41]在煙草中過表達(dá)都能夠使花青苷在煙草花瓣、萼片、花絲等部位大量積累從而發(fā)生顏色變化。本研究中,在煙草‘SR’中過表達(dá)MaMYB114使煙草葉片、花冠、花冠筒、花藥、花絲、花萼和種皮均呈現(xiàn)出深紫紅色(圖11),進(jìn)一步證明MaMYB114促進(jìn)花青素的積累。

綜上所述,葡萄風(fēng)信子MaMYB114基因?qū)儆谡{(diào)控花青苷合成相關(guān)的R2R3-MYB 亞家族中的AN2亞組。在煙草中異源過表達(dá)MaMYB114的結(jié)果證實(shí)其確實(shí)具有促進(jìn)花青苷積累的功能,但具體調(diào)控機(jī)制需要進(jìn)一步驗(yàn)證。