李全輝,馬玉杰,邵登魁,王亞藝,文軍琴,鐘啟文

(青海大學(xué) 農(nóng)林科學(xué)院/青藏高原種質(zhì)資源研究與利用實(shí)驗(yàn)室,西寧 810016)

辣椒(CapsicumannuumL.)是茄科辣椒屬一年或多年生草本作物,是中國(guó)栽培面積最大的蔬菜作物之一,也是重要的食品加工調(diào)味品;辣椒果實(shí)中含有豐富的維生素、類胡蘿卜素、辣椒素等物質(zhì),具有良好的營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)和保健功能[1];辣椒果實(shí)顏色是重要的商品性狀之一,目前已經(jīng)選育出各種不同果色的辣椒新品種。辣椒果實(shí)顏色的形成與果肉細(xì)胞中花色素、類胡蘿卜素和葉綠素等的種類及含量密切相關(guān)。成熟辣椒果實(shí)中的主要色素類胡蘿卜素[2-3],是一種脂溶性色素,植物花、葉、果等組織的著色與積累類胡蘿卜素的類型及含量密切相關(guān)[4],隨著辣椒果實(shí)的成熟,類胡蘿卜素不斷累積,葉綠素和花青素逐漸降解而呈現(xiàn)出不同的果實(shí)顏色。在成熟果色為紅色的辣椒中主要含有辣椒紅素、β-隱黃素、β-胡蘿卜素、辣椒玉紅素、玉米黃素、花藥黃質(zhì)和α-胡蘿卜素等色素;黃色果實(shí)中,主要含有紫黃質(zhì)、葉黃素、α-胡蘿卜素、β-胡蘿卜素、玉米黃素、花藥黃質(zhì)和β-隱黃素等色素;橙色辣椒含有辣椒紅素、β-隱黃素、玉米黃質(zhì)、紫黃質(zhì)、α-胡蘿卜素、β-胡蘿卜素和玉米黃素等[5-9]。在辣椒作物中,CCS基因在辣椒紅素合成的最后階段催化5,6-環(huán)氧玉米黃質(zhì)和紫黃質(zhì)分別轉(zhuǎn)化為辣椒紅素和辣椒玉紅素,是辣椒紅素/玉紅素合成的限速酶之一[8-9],在辣椒果實(shí)顏色形成過(guò)程中具有重要的作用。

辣椒成熟果實(shí)顏色主要受y、cl、c1和c2位點(diǎn)所控制,它們之間的相互作用導(dǎo)致辣椒果實(shí)產(chǎn)生不同的成熟果實(shí)顏色[10]。Huh等[11]利用不同果色辣椒進(jìn)行遺傳定位分析,將控制辣椒果實(shí)顏色的c2位點(diǎn)定位于第4條染色體,并最終確定c2位點(diǎn)與八氫番茄紅素合成酶基因(PSY)共分。cl位點(diǎn)與CaSGR基因密切相關(guān),通常在辣椒果實(shí)成熟過(guò)程中,由于葉綠素分解為無(wú)色產(chǎn)物,綠色被降解,而CaSGR基因的突變,使果實(shí)成熟過(guò)程中葉綠素降解能力受到抑制,辣椒果實(shí)因同時(shí)含葉綠素和不同成分的類胡蘿卜素而呈棕色(或綠色)[12-13]?，F(xiàn)有研究結(jié)果表明,y位點(diǎn)為CCS基因。

辣椒紅素和辣椒玉紅素是辣椒果實(shí)呈現(xiàn)紅色的主要色素,前期研究認(rèn)為辣椒成熟果紅色對(duì)黃色為顯性,是由單基因y調(diào)控,黃色果實(shí)可能是由于CCS基因的缺失形成[14-17];Popovsky 等[18]、Ha等[5]、Rodriguez-Uribe等[19]通過(guò)研究也進(jìn)一步證實(shí)CCS基因的移碼突變、單堿基突變等導(dǎo)致翻譯提前終止,進(jìn)而導(dǎo)致不同果色形成。Deruere等[20]研究表明CCS基因只在成熟紅色果實(shí)中表達(dá),辣椒植株葉片、青熟期和黃色辣椒果實(shí)各發(fā)育時(shí)期均未表達(dá);Tian等[21]研究表明,CCS等基因參與辣椒果實(shí)類胡蘿卜素的生物合成,其表達(dá)水平影響辣椒成熟果實(shí)的顏色,通過(guò)VIGS基因沉默技術(shù)也證實(shí)這一點(diǎn)。而張芳芳等[22]發(fā)現(xiàn)在一些黃色果實(shí)也有微量辣椒紅素的存在;Popovsky等[18]研究認(rèn)為黃色辣椒果實(shí)中是由于CCS基因5′部分序列缺失導(dǎo)致的,由此可見(jiàn),不同果色辣椒果實(shí)中CCS基因變異及表達(dá)水平并不一致。

本研究以不同果色辣椒為材料,克隆CCS基因并進(jìn)行序列分析,同時(shí)研究其在不同組織以及果色不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)情況,初步闡述不同果色形成和辣椒類胡蘿卜素代謝密切相關(guān)的CCS基因序列及表達(dá)差異,以期為后續(xù)相關(guān)基因功能和調(diào)控機(jī)理研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為觀賞椒GS6和Z1,甜椒SP01以及黃色突變體SP02,由西北農(nóng)林科技大學(xué)園藝學(xué)院蔬菜生物技術(shù)與種質(zhì)資源創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)室和青海省農(nóng)林科學(xué)院園藝研究所提供。2019年12月初將供試種播種于72孔穴盤中,2020年3月將辣椒幼苗移栽入基地大棚。根據(jù)花后不同時(shí)間將果實(shí)發(fā)育分為5個(gè)時(shí)期:Ⅰ期(10DAF)、Ⅱ期(20DAF)、Ⅲ期(30DAF)、Ⅳ期(40DAF)、Ⅴ期(50DAF),見(jiàn)圖1。采集成熟期(50DAF)根、莖、葉、花及果實(shí)不同發(fā)育時(shí)期的樣品,液氮速凍后-80 ℃貯藏備用。

圖1 試驗(yàn)材料Ⅰ_Ⅴ(10 DAF-50 DAF) represent fruits at 10 d,20 d,30 d,40 d and 50 d after flowering,respectively.Fig.1 Experimental materials

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1類胡蘿卜素關(guān)鍵基因全長(zhǎng)克隆

在NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中下載辣椒已有CCS基因序列,利用primer5.0軟件根據(jù)不同用途設(shè)計(jì)引物(表1),以GS6和Z1 材料的gDNA 為模板進(jìn)行基因全長(zhǎng)擴(kuò)增[23]。PCR 反應(yīng)體系為:2×Es Taq Master Mix(Dye) 25 μL,10 mmol/L上下游引物各2 μL,DNA 1 μL(200 ng/uL),加水至50 μL 體系。PCR 反 應(yīng)程序:98 ℃預(yù)變性5 min,98 ℃變性30 s,62 ℃退火30 s,72 ℃延伸2 min,共35 個(gè)循環(huán),72 ℃延伸5 min。

擴(kuò)增后的PCR 產(chǎn)物使用膠回收試劑盒(TaKa-Ra,大連)得到目的基因片段,連接到PMD19-T 載體(TaKaRa,大連),然后轉(zhuǎn)入DH5α 感受態(tài)細(xì)胞中,最后將菌液檢測(cè)呈陽(yáng)性的單克隆送至華大基因股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.2.2生物信息學(xué)分析

采用DNAman8.0軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行氨基酸序列、親疏水性分析及同源序列比,利用ExPaSy-ProtParam(https://web.expasy.org/protparam)、SignaIP6.0(https://services.healthtech.dtu.dk/services/SignalP-6.0)、Euk-mPLoc2.0(http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/euk-multi-2)、TMHMM2.0(https://services.healthtech.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)、SOPMA(https://npsapbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl? page=npsa_sopma.html)、SWISS-MODEL(https://swissmodel.expasy.org/)等在線工具分析蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)及理化性質(zhì),利用NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)保守域,最后用MEGA7.1軟件進(jìn)行同源蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析[24-25]。

1.2.3 CCS 基因表達(dá)分析

根據(jù)表1 所設(shè)計(jì)引物,以GS6、Z1、SP01 和SP02在果實(shí)不同時(shí)期和Ⅴ期不同組織的cDNA 為模板,辣椒UBI3基因?yàn)閮?nèi)參基因[26],使用Light Cycler480 Ⅱ進(jìn)行qRT-PCR,反應(yīng)體系(20 μL):2×SYBR Premix Ex Taq 10 μL、10 mmol/L上下游引物各0.6 μmol/L、cDNA 1 μL(100 ng/μL)模板、ddH2O 6.8 μL。反應(yīng)程序:95 ℃ 3 min;95 ℃ 30 s;60 ℃ 30 s,72 ℃ 45 s,循環(huán)45次;72 ℃ 2 min。參照呂文遠(yuǎn)等[27]定量方法對(duì)基因進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量分析,3次生物學(xué)重復(fù)。采用2-ΔΔCT 方法進(jìn)行數(shù)據(jù)計(jì)算處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 類胡蘿卜素CCS 基因的克隆

采用同源克隆策略,辣椒CM334 為參考基因組序列,以辣椒GS6、Z1、SP01、SP02葉片DNA 為模板,擴(kuò)增CCS基因全長(zhǎng)。電泳結(jié)果表明,在紅色辣椒材料GS6、Z1、SP01中均能擴(kuò)增到1 500 bp左右的基因片段,與預(yù)期大小相符,而在黃色突變體SP02中未能擴(kuò)增出CCS基因(圖2);將目的基因純化、克隆測(cè)序后進(jìn)行序列比對(duì),結(jié)果顯示CCS基因在GS6、Z1、SP01及參考基因組CM334中的序列均完全一致。

圖2 辣椒CCS 基因PCR 擴(kuò)增Fig.2 PCR amplification of CCS gene in pepper

基因結(jié)構(gòu)分析結(jié)果表明,CCS基因只包含1個(gè)開(kāi)放閱讀框序列,沒(méi)有內(nèi)含子序列,全長(zhǎng)為1 497 bp,編碼498個(gè)氨基酸(圖3)。

圖3 CCS cDNA 序列及預(yù)測(cè)氨基酸序列Fig.3 CCS nucleotide sequence and predicted amino acid sequence

2.2 辣椒CCS蛋白的理化性質(zhì)分析

利用ExPaSy-ProtParam 對(duì)CCS蛋白進(jìn)行預(yù)測(cè)分析,結(jié)果表明:CCS蛋白分子式為C1780H2889N485O536S16,分子量為56 658.66 D,理論等電點(diǎn)為8.77,親水性平均系數(shù)為-0.216,不穩(wěn)定系數(shù)為44.5,預(yù)測(cè)該蛋白是一個(gè)不穩(wěn)定蛋白(不穩(wěn)定系數(shù)＞40);SignaIP 6.0預(yù)測(cè)結(jié)果顯示該蛋白無(wú)信號(hào)肽,不屬于分泌型蛋白;TMHMM2.0 預(yù)測(cè)該蛋白無(wú)跨膜螺旋區(qū);Euk-mPLoc2.0 亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)結(jié)果顯示CCS 蛋白于葉綠體的可能性較大。

2.3 氨基酸親水性和疏水性預(yù)測(cè)

通過(guò)DNAMAN8.0 對(duì)辣椒CCS基因推導(dǎo)的氨基酸序列進(jìn)行親水性/疏水性分析。結(jié)果(圖4)表明,該蛋白的第447位組氨酸(His)親水性最強(qiáng);疏水性最強(qiáng)的位點(diǎn)為第84位的纈氨酸(Val)。

圖4 辣椒CCS氨基酸序列的親水性和疏水性分析Fig.4 Hydrophilicity and hydrophobicity analysis of CCS amino acid sequence in C.annuum

2.4 辣椒CCS蛋白結(jié)構(gòu)分析

利用SOPMA 預(yù)測(cè)CCS蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu),結(jié)果如圖所示(圖5,A),CCS蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)主要由α-螺旋(33.54%)、延伸結(jié)構(gòu)(16.47%)、β-折疊(3.21%)和無(wú)規(guī)則卷曲(44.78%)構(gòu)。利用SWISS-MOEL在線軟件進(jìn)行蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)同源建模和分析(圖5,B),其結(jié)果顯示CCS蛋白模型構(gòu)建基于模板4opg.1.A(保守古菌蛋白),GMQE(global model quality estimate)得分0.33,覆蓋率為64%,且辣椒CCS蛋白的三維結(jié)構(gòu)由8個(gè)α-螺旋和15個(gè)β-折疊所構(gòu)成。

圖5 CCS蛋白二級(jí)(A)、三級(jí)(B)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Blue parts represent alpha helix,red parts represent beta-pleated sheet,green parts represent beta turn,purple parts represent random coil.Fig.5 Prediction of secondary (A) and tertiary (B) structure of CCS protein

2.5 保守域分析與同源性序列比對(duì)

在NCBI保守域數(shù)據(jù)庫(kù)中將辣椒CCS 氨基酸序列進(jìn)行保守域預(yù)測(cè)可知,CCS包含番茄紅素β-環(huán)化酶(PLN02463)結(jié)構(gòu)域和番茄紅素環(huán)化酶(Lycopene_cycl)結(jié)構(gòu)域的特異位點(diǎn),編碼氨基酸起止分別為53-497位和83-478位,屬于NADB_Rossmann、Lycopene_cycl超家族,表明CCS 蛋白具有番茄紅素環(huán)化酶家族蛋白(結(jié)構(gòu)域ID 10010798)典型的保守區(qū)域(圖6)。

圖6 辣椒CCS蛋白氨基酸序列保守域預(yù)測(cè)Fig.6 Prediction of conserved domain of amino acid sequence of CCS protein in Capsicum annuum

將辣椒(C.annuum)CCS 氨基酸序列XP_016577952.1 分別與中華辣椒(C.chinense)PHU16032.1、燈籠辣椒(C.baccatum)PHT30120.1、潘那利番茄(Solanumpennellii)NP_001310372.1、絨毛煙草(Nicotianatomentosiformis)XP_009609006.1、棉花(Gossypiumlaxum)MBA0713011.1、寧夏枸杞(Lyciumbarbarum)AIX87499.1、黑果枸杞(L.ruthenicum)AIX87523.1、茶 (Camelliasinensis)KAF5937613.1、番茄(S.lycopersicum)CAB93342.1、杏(Prunusarmeniaca)CAB4283368.1、麻風(fēng)樹(shù)(Jatrophacurcas)XP_012070159.1 和三裂葉薯(Ipomoeatriloba)XP_031113926.1等植物的CCS氨基酸序列進(jìn)行多重比較分析(圖7),發(fā)現(xiàn)序列比對(duì)的一致性依次達(dá)到99.4%、99%、86.75%、85.37%、69.88%、85.14%、85.34%、71.89%、85.54%、69.08%、71.08%、72.55%,共同一致性達(dá)到84.98%,表明辣椒CCS氨基酸序列與這12個(gè)物種都具有較高的同源性,且不同物種的CCS氨基酸序列的保守性均較高。

圖7 辣椒與其他植物CCS蛋白氨基酸序列的多重比對(duì)Fig.7 Multiple alignment of amino acid sequences of CCS protein between C.annuum and other plants

2.6 進(jìn)化樹(shù)分析

利用MEGA7.1將辣椒與其他12種不同植物構(gòu)建同源進(jìn)化樹(shù)。結(jié)果(圖8)顯示,辣椒與同屬茄科的寧夏枸杞(L.barbarum)、黑果枸杞(L.ruthenicum)、絨毛煙草(N.tomentosiformis)、中華辣椒(C.chinense)和燈籠辣椒(C.baccatum)在進(jìn)化上屬于同1個(gè)分支,且與同科同屬的中華辣椒(C.chinense)在進(jìn)化關(guān)系上最為接近。

圖8 辣椒與其他物種CCS蛋白氨基酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.8 Phylogenetic tree of amino acid sequences of C.annuum and other plant CCS proteins

2.7 辣椒CCS 基因在不同組織的表達(dá)分析

研究采用qRT-PCR 技術(shù)對(duì)CCS基因在GS6、Z1、SP01和SP02不同組織中表達(dá)模式進(jìn)行分析,以辣椒CCS基因在根中的相對(duì)表達(dá)量作為參考。

結(jié)果顯示,CCS基因在GS6和Z1的根、莖、葉、花、果等不同組織中均有表達(dá),而在SP01的莖和葉以及SP02 的所有組織中均未表達(dá);其中,在GS6中,CCS基因在花中的表達(dá)量最高,顯著高于其他組織;在Z1和SP01中,CCS基因在果實(shí)中的表達(dá)量顯著高于其他組織,在根中表達(dá)量最低(圖9,A)。

圖9 辣椒不同組織及果實(shí)不同時(shí)期CCS 基因的相對(duì)表達(dá)水平Different normal letters mean significant difference at 0.05 level.Fig.9 Relative expression levels of CCS gene in different tissues of pepper and different periods of pepper fruit

2.8 CCS 基因在辣椒果實(shí)不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)分析

對(duì)CCS基因在GS6、Z1、SP01和SP02果實(shí)發(fā)育時(shí)期中的表達(dá)模式進(jìn)行分析。結(jié)果(圖9,B)顯示,CCS基因在黃色突變體SP02各組織均未表達(dá);在GS6與SP01中隨果實(shí)發(fā)育表達(dá)量逐步上升,分別在Ⅳ期(40DAF)和Ⅲ期(30DAF)達(dá)到最大值,而后表達(dá)量逐漸下降;在Z1中,CCS基因隨著果實(shí)發(fā)育,表達(dá)量逐步升高,在前3個(gè)時(shí)期(Ⅰ-Ⅲ期)表達(dá)量較低,Ⅳ期表達(dá)量大幅上升,Ⅴ期達(dá)到最大值,且顯著高于其他幾個(gè)時(shí)期。表明CCS基因?qū)苯芳t、黃果色的形成具有重要作用且主要在果實(shí)成熟階段表達(dá)。

3 討論

辣椒果色豐富多彩,已經(jīng)成為研究果色遺傳的一種模式植物[28]。類胡蘿卜素作為辣椒花和果實(shí)的主要色素,在辣椒果實(shí)發(fā)育過(guò)程中,類胡蘿卜素的組成及含量不同影響辣椒果實(shí)的色澤[29]。前人研究結(jié)果表明,CCS基因在類胡蘿卜素的合成及辣椒果色形成中發(fā)揮著重要作用,Lang等[30]以紅果與黃果辣椒雜交分離后代作為研究材料,利用薄層色譜對(duì)類胡蘿卜素組成成分進(jìn)行分析,結(jié)果表明成熟紅果的類胡蘿卜素中辣椒紅素占比最高,而在成熟色為黃色辣椒的類胡蘿卜素中則不含辣椒紅素,同時(shí)在對(duì)紅色與黃色果實(shí)CCS基因驗(yàn)證中發(fā)現(xiàn),紅果中含有完整CCS基因,而黃果CCS基因的PCR 帶型呈現(xiàn)多態(tài)性且在上游區(qū)域,CCS基因有缺失。田士林[17]通過(guò)對(duì)紅色辣椒果實(shí)類胡蘿卜素生物合成通路上關(guān)鍵基因CCS等進(jìn)行基因沉默時(shí),發(fā)現(xiàn)組成類胡蘿卜素的各相關(guān)色素含量在不同程度上都有所降低,其中辣椒紅素含量降低更加明顯,這也進(jìn)一步證實(shí)了CCS基因與辣椒果色密切相關(guān)。本試驗(yàn)從3個(gè)成熟果色為紅色的不同品種辣椒中均能克隆到完整的CCS基因,條帶大小為1 497 bp,與參考基因組CM344序列100%相匹配,而在成熟果色為黃色的SP02中未能擴(kuò)增出CCS基因,表明在成熟色為紅色的GS6、Z1和SP01辣椒中,CCS基因具有完整的序列,而SP02(黃色)果色的形成可能與CCS基因的缺失或變異密切相關(guān),這對(duì)于了解CCS基因功能,為進(jìn)一步深入解析辣椒果色形成機(jī)理,以及不同果色辣椒新品種選育具有重要意義。

在有關(guān)辣椒紅、黃色果實(shí)顏色形成的研究中,諸多研究表明CCS基因的結(jié)構(gòu)變異是導(dǎo)致辣椒果實(shí)顏色發(fā)生改變的重要影響因素之一,其中CCS基因編碼區(qū)中堿基缺失、堿基突變以及移碼突變等,提前產(chǎn)生終止密碼子,導(dǎo)致CCS基因功能受損,進(jìn)而影響辣椒果實(shí)顏色的形成。啟動(dòng)子是位于基因5′端上游的一段DNA 序列,主要參與基因的表達(dá)調(diào)控[31],Ha等[5]通過(guò)研究不同果色CCS基因的編碼區(qū)和啟動(dòng)子區(qū),發(fā)現(xiàn)在不同辣椒中CCS基因啟動(dòng)子區(qū)可分為920/922 bp、998/999 bp、1 175 bp 3種模式,且在成熟果實(shí)顏色為黃色辣椒的PCR 帶型中也存在CCS基因的編碼區(qū)和啟動(dòng)子區(qū),將其與完整CCS編碼區(qū)的核苷酸序列進(jìn)行多次比對(duì),結(jié)果表明:黃色果實(shí)‘Y2’的CCS基因在1 431 bp處插入8 bp,造成移碼突變,轉(zhuǎn)錄提前終止;‘Y3’的CCS基因在599 bp處發(fā)生單堿基(C/A)突變,形成提前終止密碼子,使辣椒紅素合成無(wú)法進(jìn)行,致使果實(shí)呈現(xiàn)黃色。陳奕聰?shù)萚32]利用2種不同成熟色(紅果和紫果)的辣椒,對(duì)其不同發(fā)育時(shí)期果實(shí)進(jìn)行表達(dá)分析,結(jié)果顯示,成熟色為紅色的辣椒果實(shí)中CCS基因有較高的表達(dá)量,而在紫色辣椒中,果實(shí)發(fā)育各時(shí)期均不表達(dá)或者表達(dá)量極低。由此可見(jiàn),辣椒不同果實(shí)顏色的形成與CCS基因的序列變異和表達(dá)量密切相關(guān)。本研究所選用的GS6、Z1、SP01和SP02中,紅果材料中CCS基因的序列均不存在變異,而黃果材料中未能克隆出CCS基因,同時(shí)CCS基因在不同組織和果實(shí)不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)量存在顯著差異,說(shuō)明在CCS基因的差異調(diào)控模式在GS6、Z1、SP01和SP02 果色形成過(guò)程中具有重要的作用。本研究結(jié)果對(duì)深入開(kāi)展相關(guān)基因功能,進(jìn)一步闡述辣椒不同果實(shí)顏色形成的分子機(jī)制,實(shí)現(xiàn)辣椒分子輔助育種具有重要意義。