王 言,何 雷,劉濤濤,王 璽,韓 佳,楊宏羽

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院,蘭州 730070)

己糖(hexose)是含有6個(gè)碳原子的單糖,又稱為六碳糖。己糖是呼吸代謝的主要底物,能夠作為信號(hào)分子調(diào)節(jié)多種基因的表達(dá)[1],植物體內(nèi)最常見(jiàn)的己糖是葡萄糖,其次是果糖和半乳糖。植物己糖激酶是雙功能酶,具有磷酸化己糖和介導(dǎo)糖信號(hào)的關(guān)鍵性作用[2]。己糖激酶具有催化己糖磷酸化和感知糖信號(hào)的功能[3-5]。在糖代謝過(guò)程中,HXK 在糖酵解第一階段[6]發(fā)揮關(guān)鍵作用,在輔助因子鎂離子(Mg2+)或錳離子(Mn2+)的協(xié)同下,催化ATP并將磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移至各種六碳糖上去,從而生成磷酸化六碳糖并繼續(xù)下一步反應(yīng),因此,HXK 能夠調(diào)控糖酵解的發(fā)生;在信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程中,HXK 作為機(jī)體內(nèi)重要的糖傳感蛋白[7],對(duì)糖信號(hào)的感知和傳遞有關(guān)鍵作用。HXK1介導(dǎo)的控制幼苗發(fā)育的葡萄糖信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)涉及ABA 的增加,并誘導(dǎo)ABA 合成和ABA 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)基因的表達(dá)[8]。已有研究表明,HXK 參與植物保衛(wèi)細(xì)胞的糖感知,介導(dǎo)氣孔關(guān)閉,從而協(xié)調(diào)光合作用與蒸騰作用[9],這與Dai等[10]研究發(fā)現(xiàn)HXK具有調(diào)節(jié)光合作用以及調(diào)控植株生長(zhǎng)發(fā)育和衰老的結(jié)論一致。此外,HXK 在淀粉的合成過(guò)程中起著關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用[11],磷酸化的己糖能在AGPase的催化下與ATP 進(jìn)一步反應(yīng)生成ADPG[12],而ADPG 則作為前體物質(zhì)參與淀粉的合成[13],可能對(duì)水稻、玉米、馬鈴薯等淀粉類(lèi)農(nóng)作物的產(chǎn)量形成起關(guān)鍵作用。由此可見(jiàn),己糖激酶與植物體內(nèi)糖代謝和貯存密切相關(guān),影響逆境脅迫過(guò)程中植物的生理和生長(zhǎng)。

目前,已從擬南芥(Arabidopsisthaliana)[14]、水稻(Oryzasativa)[15]、玉米(Zeamays)[16-17]、茶樹(shù)(Camelliasinensis)[18]、蘋(píng)果(MalusdomesticaBorkh)[19]、木薯(Manihotesculenta)[20]、番茄(Solanumlycopersicum)[21]、葡萄(Vitisvinifera)[22]、油菜(Brassicanapus)[23]等多種植物中鑒定和克隆出了HXK基因,這些研究均表明HXK基因能夠被不同脅迫誘導(dǎo)表達(dá),從而影響和調(diào)控植株在逆境下的糖代謝水平。研究者從擬南芥中分離鑒定出了6個(gè)HXK基因[14],其中AtHXK1～AtHXK3具有己糖催化活性,能夠使己糖磷酸化。此外,有研究發(fā)現(xiàn)AtHXK1的擬南芥幼苗對(duì)外源葡萄糖表現(xiàn)出高度的敏感性[24]。水稻中共鑒定出10個(gè)HXK基因,這些基因分別位于水稻的1號(hào)、5號(hào)和7號(hào)染色體上,大多具有9個(gè)內(nèi)含子和8個(gè)外顯子,其中Os-HXK2、OsHXK5和OsHXK6能夠被外源糖誘導(dǎo)表達(dá),OsHXK3在花中特異性表達(dá)[15]。Zhang等[16]從玉米中鑒定出了9 個(gè)HXK基因,研究表明,低溫、NaCl和PEG 誘導(dǎo)能上調(diào)玉米幼苗中Zm-HXK5和ZmHXK6的相對(duì)表達(dá)含量。木薯中的7個(gè)HXK基因中,僅MeHXK1、MeHXK2和Me-HXK5具有磷酸化己糖的功能,研究表明,木薯HXK在其塊根形成初期以及淀粉快速積累時(shí)表達(dá),對(duì)木薯塊根組織中淀粉的合成起正調(diào)控作用[20]。

馬鈴薯(Solanumtuberosum)是中國(guó)第四大主糧作物[25],不僅口感良好、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高、耐儲(chǔ)運(yùn),還具有巨大的增產(chǎn)潛能,同時(shí)也是中國(guó)重要的農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)作物。干旱、鹽堿、冷害以及澇漬等逆境因子不僅影響馬鈴薯的品質(zhì),還嚴(yán)重制約著馬鈴薯的生長(zhǎng)發(fā)育和產(chǎn)量。然而截至目前,有關(guān)HXK基因參與馬鈴薯生長(zhǎng)發(fā)育以及逆境適應(yīng)性方面的研究鮮有報(bào)道。因此本研究擬馬鈴薯HXK 基因家族成員在非生物處理脅迫下的表達(dá)特性進(jìn)行研究,明確該成員在馬鈴薯逆境條件下的響應(yīng)功能,為深入研究HXK 家族基因的功能奠定了基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料及處理

試驗(yàn)材料選用“大西洋”馬鈴薯組培苗,采用培養(yǎng)基(4.43 g/L MS+1.0 mg/L NAA(萘乙酸)+0.2 mg/L 6-BA(6-芐基氨基嘌呤)+30 g/L蔗糖+6.5 g/L 瓊脂)作為基本培養(yǎng)基。在23 ℃、16 h光照/16 ℃、8 h黑暗條件的人工氣候箱中進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)35 d,選擇長(zhǎng)勢(shì)良好相似且無(wú)污染的馬鈴薯組培苗,將其分別置于高溫(40 ℃)、低溫(4 ℃)、0.2 mol/L NaCl、50 μmol/L ABA、100 μmol/L ABA以及10% PEG(聚乙二醇)進(jìn)行2 h、6 h、12 h和24 h處理,以正常生長(zhǎng)植株作為對(duì)照組,每個(gè)處理設(shè)置3次生物學(xué)重復(fù)。取經(jīng)過(guò)處理的馬鈴薯組培苗葉片,剪碎并用錫箔紙包好,置于液氮速凍,-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 馬鈴薯RNA提取

RNA 提取采用植物提取試劑盒RNAplant-RTR2303(中科瑞泰生物技術(shù)有限公司,北京),并按操作說(shuō)明書(shū)對(duì)馬鈴薯RNA 進(jìn)行提取。通過(guò)Nanodrop和Agilent 2100(安捷倫有限責(zé)任公司,美國(guó))檢測(cè)所提取馬鈴薯RNA 的純度(OD260/280)、濃度、完整性,并通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè),確認(rèn)合格后在-80 ℃下儲(chǔ)存。

1.3 馬鈴薯HXK 家族基因成員鑒定

從擬南芥數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.arabidopsis.org/)中下載已登錄注冊(cè)的擬南芥HXK 氨基酸序列,將其作為靶序列在馬鈴薯數(shù)據(jù)庫(kù)(http://solgenomics.net/)中進(jìn)行BLASTP同源比對(duì),可獲得馬鈴薯HXK基因的候選序列。利用DNAMAN6.0.40 對(duì)HXK候選基因進(jìn)行篩選,利用SMART(http://smart.embl.de/)和Pfam(http://pfam.sanger.ac.uk/)進(jìn)行保守域預(yù)測(cè),篩選出含有HXK特定結(jié)構(gòu)域(PF03727)的基因,最終獲得6個(gè)StHXK家族基因,根據(jù)染色體位置命名為StHXK1～StHXK6。從馬鈴薯數(shù)據(jù)庫(kù)中分別下載該家族成員所對(duì)應(yīng)的編碼基因序列(coding sequence,CDS)和基因組序列(genome sequence),作為該家族基因生物信息學(xué)分析的基礎(chǔ)。

1.4 馬鈴薯HXK 家族基因相關(guān)生物信息學(xué)分析

使用MEGA11.0 軟件對(duì)馬鈴薯、擬南芥、水稻、玉米、葡萄和木薯的HXK 蛋白序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化分析,采用鄰接法(neighbor-joining NJ),執(zhí)行參數(shù)Bootstra設(shè)為1 000次重復(fù),其余參數(shù)設(shè)置為默認(rèn)值。使用ExPASy 數(shù)據(jù)庫(kù)(https://web.expasy.org/protparam/)中ProtParam 工具對(duì)馬鈴薯HXK編碼蛋白的理論等電點(diǎn)、氨基酸大小、不穩(wěn)定系數(shù)、親水性等基本信息進(jìn)行分析[26];使用GSDS 2.0(http://gsds.cbi.pku.edu.cn/)對(duì)該家族成員進(jìn)行基因結(jié)構(gòu)分析;利用WoLF PSORT(http://www.genscript.com/wolf-psort.html)進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析預(yù)測(cè);使用PRABI(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl? page=npsa_sopma.html)和WISS-MODEL(https://swissmodel.expasy.org/interactive)進(jìn)行蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)分析;使用DNAMAN 6.0對(duì)馬鈴薯HXK 氨基酸進(jìn)行多序列比對(duì)分析;使用plantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)進(jìn)行順式作用元件分析。

利用在線網(wǎng)站MEME(http://meme-suite.org/tools/meme)對(duì)StHXK基因保守基序進(jìn)行分析,預(yù)測(cè)基序數(shù)設(shè)為5 個(gè);利用TBtools v1.09876軟件進(jìn)行染色體位置和共線性分析。

1.5 馬鈴薯HXK 家族基因qRT-PCR分析

由生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行qRT-PCR 引物(表1)設(shè)計(jì)與合成。馬鈴薯cDNA序列由試驗(yàn)提取的RNA 反轉(zhuǎn)錄得到,試劑盒選用Primer ScriptTMRT regent Kit with gDNA Eeaser(TaKaRa)。qRT-PCR 試劑盒選用SYBR Primer Ex TaqTMⅡ(TaKaRa),設(shè)置3 組重復(fù),以馬鈴 薯Actin基因作為內(nèi)參基因[27],反應(yīng)體系為20 μL:上、下游引物各1 μL,SYBR 10 μL,2 μL cDNA,6 μL ddH2O,95 ℃預(yù)變性30 s,95 ℃變性5 s,60 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,循環(huán)40次。基因的相對(duì)表達(dá)量采用2-ΔΔCT 法[28]計(jì)算。

表1 馬鈴薯HXK 家族基因的qPCR 分析所用引物Table 1 Primers used for qPCR analysis of potato HXK family genes

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

使用Excel 2016 進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與整理;使用SPSS 25進(jìn)行顯著性分析;使用Origin 9.0進(jìn)行圖片繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 馬鈴薯HXK 家族基因鑒定及其編碼蛋白的理化性質(zhì)分析

通過(guò)相似性搜索以及保守結(jié)構(gòu)域鑒定,在馬鈴薯(S.tuberosum)中鑒定出6個(gè)HXK基因。根據(jù)馬鈴薯的拉丁名縮寫(xiě),將其命名為StHXK1～StHXK6。對(duì)其編碼蛋白理化性質(zhì)及亞細(xì)胞定位進(jìn)行分析(表2)表明,該家族成員蛋白的氨基酸數(shù)目為496(StHXK4)～533 aa(StHXK3);分子量集中在53 736.38～58 184.71 D 之間;StHXK 全長(zhǎng)介于4 084(StHXK3)～6 678 bp(StHXK6)之間;理論等電點(diǎn)(pI)介于5.36～6.11之間,其中StHXK2等電點(diǎn)最高,為6.11,StHXK6最低,為5.36,均小于7,偏酸性;不穩(wěn)定系數(shù)集中在28.29～53.5 之間,其中StHXK5 的不穩(wěn)定系數(shù)最高,StHXK6 的不穩(wěn)定系數(shù)最低;該家族成員均為親水性蛋白。亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)表明,StHXK基因主要在葉綠體中表達(dá),除此,StHXK1、StHXK6在細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)、StHXK3在線粒體中也存在明顯定位信號(hào)。

表2 馬鈴薯HXK 家族基因信息及其編碼蛋白理化性質(zhì)分析Table 2 Analysis of gene information and their coding proteins physicochemical properties of potato HXK family genes

2.2 馬鈴薯HXK 家族基因編碼蛋白的結(jié)構(gòu)、保守基序分析

基因結(jié)構(gòu)分析(圖1,A)表明,StHXK長(zhǎng)度均位于7 kb以內(nèi),且基因結(jié)構(gòu)相似。除了StHXK1無(wú)上游結(jié)構(gòu),其他5個(gè)StHXK均具有外顯子、內(nèi)含子及5′和3′非編碼區(qū),其中StHXK3含有7個(gè)內(nèi)含子、8個(gè)外顯子,StHXK1和StHXK6含有9個(gè)內(nèi)含子、10個(gè)外顯子,其余3個(gè)StHXK含有8個(gè)內(nèi)含子、9個(gè)外顯子。

圖1 HXK 家族基因的基因結(jié)構(gòu)及蛋白保守基序分析A.Gene structure diagram;B.Conserved motif diagram;C.Conserved motif Logo diagram.Fig.1 Gene structure and protein conserved motif analysis of HXK family genes

利用MEME 在線軟件分析StHXK 家族成員的蛋白保守基序,選取15個(gè)motif(圖1,B 和圖1,C),結(jié)果表明,StHXK1缺失motif 3和motif 10,其余StHXK 均含有10個(gè)motif,且在結(jié)構(gòu)上的排列順序相似,推測(cè)這些基因功能高度相似。

2.3 馬鈴薯HXK 家族基因編碼蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)及三級(jí)結(jié)構(gòu)分析預(yù)測(cè)

為進(jìn)一步研究HXK 家族基因的結(jié)構(gòu)特點(diǎn),通過(guò)EXPASy在線軟件對(duì)馬鈴薯HXK 蛋白進(jìn)行二級(jí)及三級(jí)結(jié)構(gòu)分析。結(jié)果(圖2)顯示,6個(gè)StHXK均由α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角、不規(guī)則卷曲和延伸鏈構(gòu)成,其中以α-螺旋和不規(guī)則卷曲占比最大;α-螺旋所占比率為41.84%(StHXK3)～48.49%(StHXK2);不規(guī)則卷曲所占比率為33.2%～36.96%,StHXK3所占比例最大;β-轉(zhuǎn)角所占比率最小,為5.23%～6.75%。

圖2 馬鈴薯HXK 家族基因編碼蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)分析The horizontal coordinates in the figure represent the proportion of each secondary structure type.Fig.2 Secondary structure analysis of the HXK family genes coding proteins in potato

馬鈴薯HXK 家族基因編碼蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)(圖3)表明,E亞族中StHXK 家族基因蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)差異較大;C 亞族StHXK 家族基因蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)相似度極高。

圖3 馬鈴薯HXK 家族基因編碼蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)分析Fig.3 Analysis of the tertiary structure of HXK family genes coding protein in potato

2.4 馬鈴薯HXK 家族蛋白氨基酸序列比對(duì)與進(jìn)化分析

通過(guò)對(duì)6個(gè)StHXK基因編碼的氨基酸序列進(jìn)行多序列同源比對(duì)(圖4)發(fā)現(xiàn),StHXK1～StHXK6均含有3個(gè)保守的結(jié)構(gòu)域:2 個(gè)磷酸化位點(diǎn)(phosphorylation site)和1 個(gè)底物結(jié)合位點(diǎn)(substrate site);其中,磷酸化位點(diǎn)中均含有2個(gè)保守的甘氨酸(Gly)殘基,底物結(jié)合位點(diǎn)中含有3個(gè)疏水通道氨基酸。對(duì)比發(fā)現(xiàn),StHXK1結(jié)構(gòu)域保守性略低于其他5個(gè)HXK基因編碼蛋白,共含有11個(gè)突變的氨基酸。

圖4 馬鈴薯HXK 家族基因編碼蛋白多序列比對(duì)Phosphorylation site is phosphorylation site;substrate site is substrate binding site;C is hydrophobic channel amino acid;+is conservative amino acid residue;* is other conserved residues.Fig.4 Multiple sequence alignment of proteins encoded by potato HXK family genes

為了探究StHXK 家族基因的進(jìn)化關(guān)系,利用MEGA7.0軟件,根據(jù)已注冊(cè)的擬南芥(6個(gè))、水稻(10個(gè))、玉米(9個(gè))、葡萄(4個(gè))和木薯(7個(gè))中的HXK基因和分析獲得的6個(gè)StHXK基因,共42個(gè)基因構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)(圖5)。通過(guò)分析將其分為5個(gè)亞族(A_E),其中,C 亞族有3 個(gè)StHXK成員,分別是StHXK2、StHXK4和StHXK6;E 亞族中 有2 個(gè)StHXK成員,分別是StHXK3和StHXK5;D 亞族中 僅有1 個(gè)StHXK成員,為StHXK1。除此,馬鈴薯HXK與木薯之間親緣關(guān)系最近,其次,馬鈴薯HXK與擬南芥和葡萄之間的親緣關(guān)系較其他兩物種之間的親緣關(guān)系近。

圖5 HXK 家族基因的進(jìn)化樹(shù)分析Fig.5 Phylogenetic tree analysis of HXK family genes

2.5 馬鈴薯HXK家族基因的基因定位共線性分析

為進(jìn)一步了解HXK 家族基因的擴(kuò)展及功能,對(duì)馬鈴薯HXK基因進(jìn)行染色體定位和共線性分析。通過(guò)染色體定位(圖6)發(fā)現(xiàn),馬鈴薯HXK基因分布于Chr02、Chr03、Chr04、Chr06、Chr11 及Chr12染色體上,分布均勻,每條染色體均只有1個(gè)成員且主要位于染色體的后半部分。

圖6 馬鈴薯HXK 家族染色體定位The scale on the left indicates the chromosome length (Mb).Different chromosome colors indicate different gene densities,with red indicating the highest density and blue the lowest.Fig.6 Chromosomal localization of potato HXK family genes

共線性基因是指能夠通過(guò)復(fù)制存在于另一基因組,并且具有相同連續(xù)順序的旁系同源基因,系同源基因是物種形成后由于基因復(fù)制而產(chǎn)生的基因[29]。分析馬鈴薯HXK 家族基因的共線關(guān)系(圖7,A)發(fā)現(xiàn),馬鈴薯內(nèi)部的基因復(fù)制現(xiàn)象不明顯,存在2對(duì)共線性基因,分別是StHXK2與StHXK4、StHXK4與StHXK6。為進(jìn)一步研究HXK基因在不同物種間的進(jìn)化關(guān)系,對(duì)馬鈴薯與擬南芥、水稻的關(guān)聯(lián)性進(jìn)行分析(圖7,B),發(fā)現(xiàn)馬鈴薯與雙子葉植物擬南芥及單子葉植物水稻的關(guān)聯(lián)性存在明顯的不同。分析表明,馬鈴薯與擬南芥之間的關(guān)聯(lián)性較高,存在5對(duì)共線性基因,馬鈴薯與水稻之間的關(guān)聯(lián)性相對(duì)較低,存在2對(duì)基因?qū)Α?/p>

圖7 馬鈴薯HXK 家族成員之間的共線性(A)和擬南芥、水稻與馬鈴薯之間的 HXK 基因組共線性(B)Fig.7 Collinearity between HXK family members in potato (A) and HXK genomic collinearity between Arabidopsis,rice and potato (B)

2.6 馬鈴薯HXK 家族基因順式作用元件分析

為進(jìn)一步明確馬鈴薯HXK 家族基因的潛在功能,選取起始密碼子前2 000 bp序列作為HXK基因上游2 kb區(qū)域,利用plant CARE 在線工具對(duì)其順式作用元件進(jìn)行分析。結(jié)果(圖8)顯示,StHXK啟動(dòng)子區(qū)域包含有光響應(yīng)元件、激素響應(yīng)元件、脅迫響應(yīng)元件及生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)元件。StHXK中均包含有脫落酸響應(yīng)元件(ABRE);激素響應(yīng)還包含有類(lèi)黃酮響應(yīng)元件(MBSI)、生長(zhǎng)素響應(yīng)元件(TCR-element)以及茉莉酸甲酯響應(yīng)元件(TGACG-motif,MeJA),StHXK中均含有茉莉酸甲酯響應(yīng)元件,其中StHXK5最多;除StHXK5和StHXK6外,其余4 個(gè)StHXK啟動(dòng)子均含有干旱響應(yīng)元件(MBS);StHXK啟動(dòng)子區(qū)域還含有與低溫相關(guān)的元件LTR。StHXK3和StHXK6含有較多的厭氧誘導(dǎo)響應(yīng)元件(ARE)。另外,StHXK1、StHXK3及StHXK5還包含分生組織表達(dá)響應(yīng)(CAT-box)。綜上,StHXK除了能夠正常進(jìn)行轉(zhuǎn)錄活動(dòng),還參與了植物的光響應(yīng)、激素響應(yīng)、逆境脅迫以及生長(zhǎng)發(fā)育活動(dòng)。

2.7 馬鈴薯HXK家族基因表達(dá)的qRT-PCR分析

對(duì)馬鈴薯HXK基因分別進(jìn)行高溫、低溫、ABA、200 mmol/L NaCl和10% PEG 進(jìn)行誘導(dǎo)脅迫處理2 h、6 h、12 h及24 h后,對(duì)不同HXK基因相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行分析(圖9),發(fā)現(xiàn)StHXK的表達(dá)水平在不同處理下表現(xiàn)出明顯的差異。qRT-PCR結(jié)果顯示,高溫脅迫處理后,該家族成員的相對(duì)表達(dá)量均呈不同程度的上調(diào)表達(dá),其中StHXK6在處理6 h 時(shí)相對(duì)表達(dá)量較高,達(dá)到對(duì)照的7.74 倍,StHXK1在處理24 h時(shí),相對(duì)表達(dá)量達(dá)到最大值,為對(duì)照的40.99倍。

低溫脅迫處理后,StHXK均呈不同程度的上調(diào)表達(dá),StHXK1在處理24 h時(shí)表達(dá)量達(dá)到最大值,達(dá)到對(duì)照的42.73倍。在200 mmol/L NaCl處理下,StHXK1、StHXK4基因相對(duì)表達(dá)量隨著時(shí)間推移呈現(xiàn)出先增高后降低的趨勢(shì),StHXK1、StHXK4在處理2 h時(shí)呈上調(diào)表達(dá)。其余StHXK基因在處理24 h內(nèi)均呈不同程度的下調(diào)表達(dá),推測(cè)StHXK在鹽脅迫中隨著時(shí)間變化既存在正向調(diào)控,也存在負(fù)向調(diào)控。

StHXK在100 μmol/L ABA 和50 μmol/L ABA 脅迫下均上調(diào)顯著,呈現(xiàn)正向調(diào)控。在100 μmol/L ABA 脅迫下,StHXK在處理6 h和24 h時(shí)響應(yīng)最為強(qiáng)烈,其中StHXK1在處理24 h時(shí)達(dá)到最大值,為對(duì)照的102.01 倍。在50 μmol/L ABA 脅迫下,多數(shù)基因在處理24 h時(shí)響應(yīng)最為強(qiáng)烈,其 中StHXK1、StHXK2、StHXK3、StHXK4的相對(duì)表達(dá)量分別是對(duì)照的286.40,152.02,126.60,112.37倍。qRT-PCR 結(jié)果顯示,在10% PEG 處理后,StHXK呈不同程度的上調(diào)表達(dá),StHXK1在處理24 h 時(shí)相對(duì)表達(dá)量達(dá)到最大值,達(dá)到對(duì)照的20.86倍。故推測(cè)StHXK在干旱脅迫下主要進(jìn)行正向調(diào)控,且StHXK1對(duì)10% PEG 的脅迫較敏感。綜上,高溫、低溫、不同濃度的ABA、NaCl、PEG處理均能誘導(dǎo)StHXK的表達(dá),但表達(dá)程度存在差異,在干旱脅迫下主要進(jìn)行正向脅迫;在ABA 處理下存在正向調(diào)控;而在鹽脅迫下隨著時(shí)間變化既存在正向調(diào)控,也存在負(fù)向調(diào)控。

3 討論

己糖激酶主要在生物體糖酵解第一階段發(fā)揮作用[30-32],同時(shí)能夠介導(dǎo)植物體內(nèi)多種糖信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)[7]。本研究采用生物信息學(xué)技術(shù),鑒定獲得共6個(gè)馬鈴薯HXK基因,分別命名為StHXK1～StHXK6。與擬南芥(6個(gè))、水稻(10個(gè))、木薯(7個(gè))、葡萄(4個(gè))、玉米(9個(gè))相比,馬鈴薯中HXK基因數(shù)量變化較小。蛋白理化性質(zhì)分析發(fā)現(xiàn),馬鈴薯家族成員均為酸性蛋白且均為親水性蛋白。馬鈴薯HXK 家族成員分布于3個(gè)亞家族,分別位于馬鈴薯的6條染色體上,其中StHXK2和StHXK4分別編碼497個(gè)和496個(gè)氨基酸,這與張凱等[33]發(fā)現(xiàn)肥城桃、雍彬等[34]對(duì)甘薯以及楊嬌嬌等[35]對(duì)枇杷HXK相關(guān)基因的鑒定結(jié)果類(lèi)似。進(jìn)化關(guān)系表明,馬鈴薯StHXK1與其他5個(gè)HXK基因同源關(guān)系較遠(yuǎn),與擬南芥AtHKL3親緣關(guān)系最近,因此,推測(cè)StHXK1與AtHKL3[15]一樣不具有磷酸化葡萄糖的功能。亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)表明,馬鈴薯HXK主要在葉綠體中表達(dá),推測(cè)其與光合作用關(guān)系密切,或直接影響馬鈴薯源器官對(duì)光能的同化效率,這與已報(bào)道的番茄LeHXK4[36]、擬南芥AtHXK3[15]及茶樹(shù)CsHXK2[37]能夠定位并作用于葉綠體的研究結(jié)果相似。與馬鈴薯HXK不同的是,StHXK3能夠在線粒體中表達(dá),此外,已有研究報(bào)道,橡膠HbHXK4[38]、毛竹PeHXK3[37]均能夠定位于線粒體并對(duì)呼吸作用發(fā)揮相應(yīng)的酶促作用,因此,推測(cè)StHXK3主要在馬鈴薯呼吸代謝過(guò)程中發(fā)揮作用。對(duì)多序列比對(duì)顯示,StHXKs大多具有2個(gè)磷酸化結(jié)合域和1個(gè)底物(葡萄糖和果糖)結(jié)合域,其中StHXK1的結(jié)構(gòu)域保守性較差,這與已報(bào)道的茶樹(shù)CsHXK1[31]、桂花OfHXK1～OfHXK4[39]以及梨PbHXK1[40]均具有完整的磷酸化位點(diǎn)、糖識(shí)別及結(jié)合位點(diǎn)研究結(jié)果類(lèi)似。共線性基因是指能夠通過(guò)復(fù)制存在于另一基因組,并且具有相同連續(xù)順序的旁系同源基因[29],本研究發(fā)現(xiàn)馬鈴薯HXK 內(nèi)的基因復(fù)制現(xiàn)象不明顯,研究HXK基因在馬鈴薯與其他物種之間的關(guān)聯(lián)性分析發(fā)現(xiàn),發(fā)現(xiàn)馬鈴薯與雙子葉植物擬南芥及單子葉植物水稻的關(guān)聯(lián)性存在一定差異,馬鈴薯與擬南芥之間的關(guān)聯(lián)性和與水稻之間相比較高。通過(guò)進(jìn)化結(jié)構(gòu)、基因結(jié)構(gòu)及保守基序分析發(fā)現(xiàn),存在于同一亞族的StHXK基因結(jié)構(gòu)和motif位置在結(jié)構(gòu)上的排列順序相似,其保守性較高,推測(cè)其具有相似功能。順式作用元件分析表明,每個(gè)成員所含有的應(yīng)答元件和數(shù)量各不相同,其中只有StHXK2基因含有低溫響應(yīng)元件。5個(gè)StHXK具鹽脅迫響應(yīng)元件TC-rich repeats,這與劉倩倩[17]在玉米Zm-HXK中的研究相似,GT 元件是與光反應(yīng)有關(guān)的順式作用元件,在植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮一定作用[41],所有的StHXK均含有大量的光響應(yīng)元件,說(shuō)明HXK 在馬鈴薯光信號(hào)調(diào)控中起到重要作用。激素響應(yīng)元件中,MBRE、TGACG-Motif和MBS、ABA 響應(yīng)元件相對(duì)較多,其中StHXK2中ABA響應(yīng)元件較多,推測(cè)馬鈴薯HXK 能夠?qū)ν庠碅BA誘導(dǎo)做出響應(yīng)。綜上,StHXK除了能夠正常進(jìn)行轉(zhuǎn)錄活動(dòng),還參與了植物的光響應(yīng)、激素響應(yīng)、逆境脅迫以及生長(zhǎng)發(fā)育活動(dòng),該結(jié)果與周玥[42]在大豆中的研究相似。

實(shí)時(shí)熒光定量結(jié)果表明,不同馬鈴薯HXK 在不同脅迫下的表達(dá)具有明顯的差異。其中,StHXK1在高溫、低溫、干旱和ABA 誘導(dǎo)下的相對(duì)表達(dá)量均遠(yuǎn)高于平均水平,表現(xiàn)出明顯的差異性,這與茶樹(shù)CsHXK1[31]在高溫、低溫和干旱逆境脅迫下的表達(dá)情況極為相似。低溫誘導(dǎo)能提高StHXK1、StHXK2以及StHXK4～StHXK6的酶活性,這與蘋(píng)果MdHXK1[19]、茶樹(shù)CsHXK3和CsHXK4[16]的研究結(jié)果相似,此外,董文科等[43]研究發(fā)現(xiàn),低溫脅迫能提高青海扁莖早熟禾HXK 的酶活性。高鹽(NaCl)脅迫對(duì)馬鈴薯HXK 的表達(dá)有普遍抑制作用,主要進(jìn)行負(fù)向調(diào)控,NaCl對(duì)馬鈴薯HXK 的脅迫機(jī)理還有待進(jìn)一步研究。馬鈴薯HXK 的表達(dá)明顯受ABA 的誘導(dǎo),并且在較低濃度的ABA 誘導(dǎo)下表達(dá)更顯著。這與Li等[18]發(fā)現(xiàn)在外源ABA 短期處理下,CsHXK3在葉片和根系中被顯著刺激的觀點(diǎn)類(lèi)似。

綜上所述,StHXK1～StHXK6均能在葉綠體中大量表達(dá),與光合作用密切相關(guān);StHXK2～StHXK6均含有高度保守的磷酸基團(tuán)結(jié)合域和底物結(jié)合域,具有己糖磷酸化功能;StHXK1不能使己糖磷酸化,但具有較強(qiáng)的信號(hào)感知作用,對(duì)外源環(huán)境變化高度敏感;StHXK3能在線粒體中有效表達(dá),推測(cè)是馬鈴薯呼吸代謝中的主要功能酶;高鹽脅迫能普遍抑制馬鈴薯HXK 的表達(dá),低溫誘導(dǎo)能普遍提高馬鈴薯HXK 的酶活性,高溫和PEG 對(duì)馬鈴薯HXK 的誘導(dǎo)效果不明顯;ABA 對(duì)StHXK的誘導(dǎo)最顯著,且對(duì)較低濃度的ABA 響應(yīng)更為強(qiáng)烈。