楊 軍,游小妹,陳常頌

(福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 茶葉研究所/國(guó)家茶樹改良中心福建分中心/農(nóng)業(yè)部福建茶樹及烏龍茶加工科學(xué)觀測(cè)實(shí)驗(yàn)站,福州 350000)

茶樹[Camelliasinensis(L.) O.Kuntze]屬山茶科(Theaceae)山茶屬(CamelliaL.),起源于中國(guó)西南地區(qū),至今已有3 000多年的栽培歷史,并先后傳入日本、印度、斯里蘭卡等50多個(gè)國(guó)家,目前已成為全世界三大飲料作物之一[1]。茶樹是多年生、常綠木本、異花授粉植物,在遺傳組成上高度異質(zhì)雜合,在品種選育初期通過(guò)早期鑒定和準(zhǔn)確選擇目標(biāo)性狀提高育種效率尤為重要[2-3]。分子標(biāo)記技術(shù)是茶樹種質(zhì)資源鑒定的重要手段之一[4-5]。余繼忠等[6]比較‘福鼎大白茶’、云南大葉茶雜交后代遺傳多樣性與親緣關(guān)系,顯示以云南大葉茶為母本比以福鼎大白茶為母本遺傳多樣性更高;姜曉輝等[7]鑒定結(jié)果顯示,5個(gè)云南白鶯山茶樹種質(zhì)資源亞群間存在基因交流;陳立杰等[8]分析貴陽(yáng)花溪古茶樹資源,結(jié)果表明貴陽(yáng)花溪古茶樹資源由喬木型向灌木型進(jìn)化;安紅衛(wèi)等[9]對(duì)貴州茶樹種質(zhì)資源進(jìn)行鑒定,貴州茶樹種質(zhì)資源間親緣關(guān)系、遺傳距離與取樣的海拔高度與密切相關(guān);毛娟等[10]認(rèn)為野生大理茶居群大雪山與栽培大理茶居群香竹箐和白鶯山遺傳距離相對(duì)較大,大理茶栽培居群和阿薩姆茶通過(guò)漸滲雜交,可能造成大理茶栽培居群的遺傳背景較復(fù)雜;張明澤等[11]分析黔南野生茶樹種質(zhì)資源來(lái)源地間遺傳距離與地理距離不存在顯著相關(guān)性。以分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)多個(gè)茶樹自然雜交后代進(jìn)行親緣關(guān)系、遺傳多樣性、親本模擬分析的相關(guān)研究較少,利用分子標(biāo)記輔助多個(gè)茶樹自然雜交后代進(jìn)行鑒定,對(duì)于明確茶樹自然雜交后代遺傳組成上的差異,加快茶樹品種選育進(jìn)程,具有重大的意義。

親本模擬分析是了解自然雜交后代遺傳背景的重要手段之一,主要用于分析親本的遺傳方式(花粉轉(zhuǎn)播距離、自交不親性)。常用的親本模擬分析軟件有PAPA、CERVUS、FAMOZ、和COLONY,其中李博等[12]對(duì)比PAPA、CERVUS、COLONY 親本模擬鑒定的準(zhǔn)確率,認(rèn)為CERVUS 親本模擬分析的準(zhǔn)確率最高。近些年,在不同的植物與動(dòng)物研究中都有大量利用CERVUS 軟件親本模擬分析,分別確定了馬尾松25粒種子[13]、油松126粒種子[14]、桉樹7個(gè)半同胞子代[15]、油橄欖29個(gè)子代[16]、圓口銅魚297尾子一代[17]、許氏平鲉18個(gè)子代[18]、鳙42尾子代[19]、長(zhǎng)鰭吻鮈96個(gè)子代[20]的親本。茶樹上利用CERVUS軟件對(duì)茶樹自然雜交后代進(jìn)行模擬分析,并將其結(jié)果與遺傳距離、遺傳多樣性分析相結(jié)合,研究茶樹自然雜交后代遺傳背景的報(bào)道較少。試驗(yàn)以福建省主要栽培品種為參照,對(duì)‘丹桂’、‘白雞冠’、‘黃觀音’自然雜交后代進(jìn)行親本模擬、親緣關(guān)系、遺傳多樣性、基因流等研究,旨在對(duì)茶樹自然雜交后代進(jìn)行初步鑒定,確定自然雜交后代遺傳背景,為茶樹育種、茶樹自然雜交后代篩選提供初步依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料包括福建主要栽培品種與茶樹自然雜交后代種質(zhì)資源一共116個(gè),其中‘丹桂’(母本)自然雜交后代58個(gè),‘白雞冠’(母本)自然雜交后代15個(gè),‘黃觀音’(母本)自然雜交后代9個(gè),福建省主要栽培品種34個(gè)(表1)。2021年10月在福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所采集116個(gè)材料的1芽2葉嫩葉后用液氮保存帶回實(shí)驗(yàn)室,保存在-70 ℃冰箱中備用。

表1 116份供試材料的名稱與來(lái)源Table 1 Name and origin of 116 materials used in this study

1.2 樣品DNA提取與SSR擴(kuò)增

1.2.1基因組DNA提取與檢測(cè)

采用金基強(qiáng)等[21]的方法,利用CTAB法提取茶樹嫩葉的總DNA。用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行茶樹基因組分子量大小檢測(cè),用756-MC 型紫外分光光度計(jì)測(cè)定茶樹基因組DNA 的純度(OD260/280比值)。

1.2.2引物合成

參照文獻(xiàn)[22]引物序列(上海Sangon 公司合成),引物信息見表2。

表2 24對(duì) SSR 引物及其序列Table 2 Nucleotide sequences of the 24 primer pairs

1.2.3PCR擴(kuò)增和產(chǎn)物鑒定

PCR 反應(yīng)體系為:ddH2O 18.8 μL,10×Buffer 2.5 μL(Mg2+),dNTP(10 mmol/L)0.5 μL,上、下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL,Taq 聚合酶 0.2 μL(0.5 U/μL),模板DNA 1.0 μL。PCR 反應(yīng)于美國(guó)ABI-9600型擴(kuò)增儀上進(jìn)行,熱循環(huán)程序?yàn)?94 ℃預(yù)變性4 min,使模板DNA 充分變性,然后進(jìn)入下列溫度循環(huán):94 ℃變性45 s,不同溫度條件退火60 s,72 ℃延伸75 s,重復(fù)35 個(gè)熱循環(huán);72 ℃延伸10 min,最后4 ℃保存。引物統(tǒng)一在反向引物(R)的5′段標(biāo)記熒光(FAM/TAMRA),由上海百力格生物科技有限公司合成。擴(kuò)增產(chǎn)物0.5 μL,GeneScanTM500 ROXTM0.5 μL,HiDi 9.0 μL,混勻后使用ABI公司3730XL進(jìn)行毛細(xì)管電泳。

1.2.4數(shù)據(jù)處理

采用ABI公司的GeneMapper4.0軟件,選擇GeneScanTM500 ROXTM作為分子量標(biāo)準(zhǔn),對(duì)每1個(gè)擴(kuò)增出的條帶記錄大小。運(yùn)用PopGen3.2軟件計(jì)算等位基因數(shù)(Na)、有效等位基因數(shù)(Ne)、觀測(cè)雜合度(Ho)、期望雜合度(He),Shannon's信息指數(shù)(I)和Nei's基因多樣性指數(shù)(H);群體間遺傳分化系數(shù)(Fst)、基因流(Nm),遺傳相似度(GI)、遺傳距離(GD)。使用PIC-CALC軟件計(jì)算各引物的多態(tài)性信息含量指數(shù)(PIC)。運(yùn)用NTSYSpc2.1計(jì)算材料間遺傳距離,利用MEGA7.0進(jìn)行UPGMA 聚類分析,并采用網(wǎng)站https://itol.embl.de/進(jìn)行圖片優(yōu)化。

1.2.5親本模擬分析

利用CERVUS 3.0軟件對(duì)子代模擬親本鑒定。對(duì)‘丹桂’、‘白雞冠’和‘黃觀音’自然雜交后代,34個(gè)候選親本進(jìn)行親子鑒定分析,分別運(yùn)行Simulation 程序與Parentage Analysis程序中的paternity子程序,模擬10 000次親子鑒定,候選親本檢測(cè)率為80%,位點(diǎn)檢測(cè)率為90%,基因型判別錯(cuò)誤率為0.01,計(jì)算候選父本基因型似然對(duì)數(shù)比(LOD)值和95%置信水平,根據(jù)LOD 值大小判定親子關(guān)系。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物的多態(tài)性信息量

從表3看出,24對(duì)SSR 引物在供試樣品中共獲得157 個(gè)等位基因,如圖1 為毛細(xì)管電泳對(duì)引物TM352擴(kuò)增片段進(jìn)行分析的部分結(jié)果,其中最多的為16個(gè),最少為3個(gè),平均為6.542;有效等位基因數(shù)(Ne)的變化范圍是1.235～6.166,平均為2.959。本試驗(yàn)中PIC值變化范圍在0.226～0.819,平均大于0.5(PIC值平均值=0.542),因此,24對(duì)引物整體多態(tài)性較高。Shannon's多樣性指數(shù)(I)變化范圍在0.398～2.073,平均值為1.182,說(shuō)明供試樣品具有較高的遺傳多樣性。

圖1 引物TM352的部分毛細(xì)管電泳圖譜Fig.1 Partial capillary electrophoresis patterns of TM352

表3 24對(duì)引物多樣性信息Table 3 Diversity information of 24 SSR primers

2.2 茶樹自然雜交后代親緣關(guān)系與親子模擬分析

從遺傳距離聚類(圖2)看出,供試材料主要分布在4個(gè)群體。群體1主要為‘丹桂’及其自然雜交后代;群體2主要為‘丹桂’、‘黃觀音’自然雜交后代與福建省烏龍茶品種;群體3主要為‘白雞冠’及其自然雜交后代;群體4主要為福建省綠茶品種,‘福鼎大毫茶’、‘歌樂(lè)茶’與‘福鼎大白茶’及其雜交后代,其中‘福鼎大毫茶’、‘歌樂(lè)茶’與‘福鼎大白茶’均為福鼎市當(dāng)?shù)仄贩N;從4個(gè)群體茶樹品種分布看出,茶樹品種自然雜交后代大多與其母本親緣關(guān)系較近,遺傳基礎(chǔ)受母本遺傳信息影響較大。群體1中主要為‘丹桂’及其自然雜交后代,按親緣關(guān)系分為3個(gè)亞群。將遺傳距離聚類與親子分析結(jié)果(表4)相結(jié)合可以看出,亞群a由‘丹桂’及其29個(gè)自然雜交后代與BJG5組成,親子模擬母本(‘丹桂’)與真實(shí)母本(‘丹桂’)相符合為26個(gè),準(zhǔn)確率為89.6%,不符合的DG26、DG34模擬父本為‘肉桂’(‘肉桂’為‘丹桂’的母本),親子模擬受祖母‘肉桂’遺傳基礎(chǔ)的影響;BJG5 真實(shí)母本(‘白雞冠’)與模擬母本(‘白雞冠’)相符合,模擬父本為‘丹桂’,BJG5 與‘丹桂’聚類在一起,說(shuō)明BJG5遺傳基礎(chǔ)更偏向父本‘丹桂’;29個(gè)‘丹桂’自然雜交后代模擬父本中21個(gè)為綠茶品種,8個(gè)為烏龍茶,推測(cè)亞群a整體遺傳基礎(chǔ)與同母本‘丹桂’的自然雜交后代具有更多綠茶屬性。

圖2 遺傳距離聚類圖Fig.2 Cluster diagram of genetic distance

表4 82個(gè)茶樹品種親子分析結(jié)果Table 4 Parentage analysis result of the 82 tea varieties

亞群b由18個(gè)‘丹桂’自然雜交后代組成,親子模擬母本(‘丹桂’)與真實(shí)母本(‘丹桂’)相符合為14個(gè),準(zhǔn)確率為77.8%;18個(gè)‘丹桂’自然雜交后代模擬父本中17個(gè)為烏龍茶品種,1個(gè)為綠茶品種,推測(cè)亞群b整體遺傳基礎(chǔ)與同母本‘丹桂’的自然雜交后代具有更多烏龍茶屬性。亞群c由6個(gè)‘丹桂’自然雜交后代組成,親子模擬母本(‘丹桂’)與真實(shí)母本(‘丹桂’)相符合為6個(gè),準(zhǔn)確率為100%,6個(gè)‘丹桂’自然雜交后代4個(gè)為烏龍茶品種,2個(gè)為綠茶品種。

群體2由5個(gè)‘黃觀音’、2個(gè)‘丹桂’自然雜交后代與17個(gè)烏龍茶品種組成,按親緣關(guān)系分為2個(gè)亞群。5個(gè)‘黃觀音’自然雜交后代親子模擬母本(‘黃觀音’)與真實(shí)母本(‘黃觀音’)相符合為4個(gè),準(zhǔn)確率為80.0%,4個(gè)與母本‘黃觀音’親緣關(guān)系較近,HGY8與‘黃旦’(‘黃觀音’的父本)親緣關(guān)系較近。DG29、DG52與烏龍茶品種‘春蘭’親緣關(guān)系較近,未與母本‘丹桂’聚類在一起,可能遺傳基礎(chǔ)受父本影響較大。

群體3由12個(gè)‘白雞冠’自然雜交后代,2個(gè)烏龍茶品種,DG16、HGY7組成。12個(gè)‘白雞冠’自然雜交后代親子模擬母本(‘白雞冠’)與真實(shí)母本(‘白雞冠’)相符合為12個(gè),準(zhǔn)確率為100%,10個(gè)模擬父本為烏龍茶品種,且母本‘白雞冠’聚類在一起,說(shuō)明‘白雞冠’自然雜交后代多具有烏龍茶品種特征,遺傳基礎(chǔ)主要來(lái)自于母本‘白雞冠’。DG16、HGY7模擬父本均為‘白雞冠’,與‘白雞冠’親緣關(guān)系較近,說(shuō)明DG16、HGY7受模擬父本遺傳基礎(chǔ)影響較大。

2.3 茶樹自然雜交后代遺傳多樣性分析

Hardy-Weinberg遺傳偏離指數(shù)D與Shannon's遺傳多樣性指數(shù)是衡量群體結(jié)構(gòu)的重要指標(biāo)之一。從表5看出,按材料來(lái)源分析,‘丹桂’、‘白雞冠’、‘黃觀音’自然雜交后代遺傳偏離指數(shù)D值均大于0,均表現(xiàn)為雜合子過(guò)剩現(xiàn)象,屬于親本單一,基本遺傳信息主要來(lái)自與其自然雜交后代母本,‘丹桂’、‘白雞冠’、‘黃觀音’自然雜交后代間Shannon's遺傳多樣性指數(shù)相當(dāng),遺傳多樣性均低于福建參照品種群體;福建參照品種遺傳偏離指數(shù)D值小于0,存在雜合子缺失現(xiàn)象,材料遺傳來(lái)源復(fù)雜,Shannon's遺傳多樣性指數(shù)最較高,遺傳多樣性高。按遺傳距離聚類群體分析,8個(gè)群體(包含亞群與雜合組)遺傳偏離指數(shù)D值均大于0,說(shuō)明8個(gè)群體遺傳信息較為一致;其中群體3與雜合組Shannon's遺傳多樣性指數(shù)較高,群體3主要為‘白雞冠’自然雜交后代,推測(cè)‘白雞冠’父本的遺傳多樣性強(qiáng)于‘丹桂’、‘黃觀音’的父本;雜合組的遺傳來(lái)源豐富,遺傳雜合度高。116個(gè)材料整體遺傳偏離指數(shù)D值小于0,Shannon's遺傳多樣性指數(shù)為1.181,說(shuō)明整體遺傳多樣性豐富。

表5 4個(gè)群體遺傳多樣性對(duì)比Table 5 Contrasting the genetic diversity of 4 groups

2.4 遺傳距離與遺傳相似度分析

從表6遺傳距離看出,‘丹桂’自然雜交后代與福建主要栽培品種遺傳距離數(shù)值最小,親緣關(guān)系最近;3個(gè)自然雜交后代群體中,‘丹桂’與‘白雞冠’的遺傳距離最小,親本模擬分析結(jié)果顯示DG16的模擬父本為‘白雞冠’,BJG1、BJG9的模擬父本為‘丹桂’,‘丹桂’與‘白雞冠’自然雜交后代親緣關(guān)系較近,受互為其模擬父本的影響。

表6 4個(gè)群體間遺傳距離和遺傳相似度Table 6 Genetic distance and genetic identity among 4 groups

群體2(亞群a)、群體2(亞群b)內(nèi)主要材料為福建省烏龍茶品種,群體4主要材料為福建省綠茶品種;‘丹桂’自然雜交后代分布在群體1(亞群a、b、c)內(nèi),群體1(亞群b)與群體2(亞群a)、群體2(亞群b)的遺傳相似度分別為0.899、0.822,高于群體1(亞群a)、群體1(亞群c),群體1(亞群b)優(yōu)先進(jìn)行烏龍茶品種篩選;群體1(亞群a)與群體4的遺傳相似度為0.805,群體1(亞群a)優(yōu)先進(jìn)行綠茶品種篩選。

群體3主要為‘白雞冠’自然雜交后代,除雜合組外,與其遺傳相似度最高的為群體1(亞群b),親緣關(guān)系較近(表7)。

表7 8個(gè)群體間遺傳距離和遺傳相似度Table 7 Genetic distance and genetic identity among 8 groups

2.5 遺傳分化與基因流分析

參考Wright等[23]對(duì)遺傳分化系數(shù)Fst值大小對(duì)種群的分化程度高低進(jìn)行評(píng)估,‘黃觀音’自然雜交后代與‘丹桂’、‘白雞冠’自然雜交后代的Fst值分別為0.065、0.054,達(dá)到中度分化,其他組合間幾乎無(wú)分化(表8)。從表9中可以看出,群體間Fst值范圍0.043～0.144之間,群體1(亞群b)與群體2(亞群a)小于0.05,兩群體幾乎無(wú)分化外,其他群體間均達(dá)到了中度分化,因此,按遺傳距離分類群體能使群體分化更為顯著,群體代表的遺傳信息特征更為明顯。群體間的基因流大小是衡量群體間遺傳差異的重要指標(biāo),Nm＞4,說(shuō)明群體間基因流充分;Nm＜1,說(shuō)明群體間可能發(fā)生遺傳漂變,基因交流較少[24]。本試驗(yàn)中‘丹桂’、‘白雞冠’、‘黃觀音’自然雜交后代與福建主要栽培品種的基因流分別為8.331、5.806、6.706,說(shuō)明‘丹桂’自然雜交后代與福建主要栽培品種基因交流最為充分,‘白雞冠’自然雜交后代與福建主要栽培品種基因交流為最低。按遺傳距離分類8個(gè)群體,群體間Nm值為1.476～5.480,群體1(亞群c)與群體4 間基因交流值為1.476,基因流最少,按遺傳距離分類群體能使群體基因交流降低。

表8 4個(gè)群體間遺傳分化系數(shù)和基因流Table 8 Genetic differentiation index and gene flow among 4 groups

表9 8個(gè)群體間遺傳分化系數(shù)和基因流Table 9 Genetic differentiation index and gene flow among 8 groups

2.6 分子方差分析

從表10中可以看出,供試材料取樣來(lái)源與遺傳距離聚類分類的群體內(nèi)遺傳變異分別為88.52%、79.53%,群體內(nèi)遺傳變異主要來(lái)自于材料間個(gè)體差異。遺傳距離聚類分類與材料取樣來(lái)源分類相比,群體內(nèi)個(gè)體間遺傳變異變小,群體間遺傳變異增加。說(shuō)明遺傳距離聚類分類比自然雜交后代群體來(lái)源分類,在一定程度降低自然雜交后代未知父本帶來(lái)遺傳的影響,能夠更清晰、準(zhǔn)確掌握自然雜交后代的遺傳背景。

表10 群體內(nèi)和群體間AMOVA分析結(jié)果Table 10 AMOVA results for within and among population variations

3 討論

3.1 茶樹自然雜交后代遺傳背景分析

親緣關(guān)系分析是鑒定種質(zhì)資源遺傳背景的重要手段之一。郭俊等[25]對(duì)32份油梨資源進(jìn)行親緣關(guān)系分析,親緣關(guān)系與地理分布有一定的關(guān)系;王鑫等[26]明確了17個(gè)類群的野生鐵線蓮親緣關(guān)系,部分鐵線蓮形態(tài)上十分相似,親緣關(guān)系較遠(yuǎn),尤其是槭葉鐵線蓮與其他16種親緣關(guān)系較遠(yuǎn);王留彬等[27]鑒定表明廣西南渡鎮(zhèn)茶樹群體與六堡鎮(zhèn)茶樹群體、栽培種間親緣關(guān)系較遠(yuǎn),材料間親緣關(guān)系遠(yuǎn)近與栽培種、野生種關(guān)系密切。宋艷畫等[28]分析沒有血緣記錄的黑山羊親緣關(guān)系,依據(jù)利用CERVUS 軟件以父權(quán)分為11個(gè)群體,得出整個(gè)群體的親緣關(guān)系,為群體的選育選配提供參考。試驗(yàn)按照材料間遺傳距離進(jìn)行分類,顯示多數(shù)自然雜交后代都與其母本親緣關(guān)系較近?！す稹匀浑s交后代多數(shù)與‘丹桂’聚類在群體1,‘丹桂’的自然雜交后代親緣關(guān)系都較為接近;群體1中的3個(gè)亞群,按模擬父本(父權(quán))分類群體1亞群a的模擬父本主要為綠茶品種,可以優(yōu)先進(jìn)行早生、高香綠茶鑒定篩選;群體1亞群b的模擬父本主要為烏龍茶品種,可以優(yōu)先進(jìn)行高香烏龍茶篩選。說(shuō)明同一母本遺傳背景情況下,親緣關(guān)系分析與按模擬親本(父權(quán))分群結(jié)果具有相關(guān)性,且親本模擬分析比親緣關(guān)系分析能更深刻了解供試材料的遺傳背景,有助于利于分子標(biāo)記進(jìn)行輔助育種選擇。

3.2 茶樹自然雜交后代遺傳多樣性分析

Shannon's多樣性指數(shù)是衡量植物遺傳多樣性重要指標(biāo)之一,在茶樹種質(zhì)資源鑒定上進(jìn)行大量研究。楊陽(yáng)等[29]利用EST-SSR 標(biāo)記研究黃金茶群體遺傳多樣性,結(jié)果顯示湖南黃金茶38 個(gè)材料的Shannon's多樣性指數(shù)為0.550;王松琳等[30]采用SSR 標(biāo)記對(duì)16個(gè)白化和黃化茶樹品種遺傳多樣性分析,Shannon's信息指數(shù)0.790;楊軍等[31]對(duì)‘金牡丹’、‘悅茗香’、‘紫玫瑰’自然雜交后代進(jìn)行遺傳多樣性分析,結(jié)果顯示Shannon's 信息指數(shù)分別0.899、1.041、1.010。彭靖茹等[32]分析14 份廣西德保縣和隆林縣野生古茶樹遺傳多樣性,茶樹種質(zhì)資源Shannon's多樣性指數(shù)0.970;周萌等[33]對(duì)122個(gè)云南野生茶樹種質(zhì)資源進(jìn)行遺傳多樣性分析,Shannon's多樣性指數(shù)為0.880;姜曉輝等[34]分析廣東曲江羅坑茶與豐順馬圖茶的Shannon's多樣性指數(shù)分別為1.217與1.228;本試驗(yàn)中,‘丹桂’、‘黃觀音’、‘白雞冠’3個(gè)群體的Shannon's多樣性指數(shù)分別為1.029、1.035、1.044,與前人研究相比,高于黃金茶群體、浙江白化和黃化茶、云南野生茶樹,與‘金牡丹’、‘悅茗香’、‘紫玫瑰’自然雜交后代相當(dāng),低于廣東曲江羅坑茶與豐順馬圖茶,初步說(shuō)明‘丹桂’、‘黃觀音’和‘白雞冠’3個(gè)群體遺傳多樣性豐富。