侯效佳，任楚旋，李 燕

（1.山西師范大學(xué) 化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院，山西 太原 030031；2.長治學(xué)院 化學(xué)系，山西 長治 046011）

隨著“后疫情時(shí)代”到來，我們的生活逐漸回歸正常，但疫情已經(jīng)重塑了人們對(duì)健康的觀念和生活習(xí)慣，同時(shí)，人們對(duì)居家生活以及公共環(huán)境的消殺防疫提出了更高的要求。

次氯酸鹽作為活性氧（ROS）的一種，在日常生活中得到了廣泛的應(yīng)用，如飲用水的消毒、冷卻水處理、家用漂白劑、抗菌劑等。然而，HClO 的使用濃度需要維持在10-5-10-2mol/L，過高或者過低的次氯酸濃度都會(huì)對(duì)人類健康造成影響。次氯酸（HClO）/次氯酸鹽（ClO-）在對(duì)微生物的免疫防御和免疫過程中起著關(guān)鍵作用［1］，具有重要的抗菌性能［2］。在生物體中，次氯酸與殺滅多種病原體的先天宿主防御有關(guān)［3］，它主要由過氧化氫和氯離子在血紅素酶髓過氧化物酶（MPO）參與的反應(yīng)中產(chǎn)生［4］。人們生活中使用的自來水主要通過活性氯殺菌以保證飲用安全，余氯含量過少會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌滋生影響健康，余氯過高會(huì)影響飲用水口感，同時(shí)對(duì)人體健康造成一定的傷害。世衛(wèi)組織規(guī)定飲用水余氯濃度低于5 mg/L，而我國《生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》［5］也規(guī)定，出廠的自來水的余氯含量應(yīng)該保持在0.3～2 mg/L之間，而家庭末端余氯含量不得小于0.05 mg/L，這樣才能保證在整個(gè)管線運(yùn)輸過程中完全、徹底且持續(xù)的殺菌消毒，以保證用水的安全。因此開發(fā)一種具簡便、快捷且高靈敏度的有效氯檢測(cè)方法，對(duì)于后疫情時(shí)代背景下的消殺防疫以及用水安全都極為重要。

與液相色譜-質(zhì)譜（LC-MS）、電位法、離子色譜、電分析和化學(xué)發(fā)光等傳統(tǒng)技術(shù)相比，熒光分析技術(shù)因其良好的時(shí)空分辨率、優(yōu)異的靈敏度和特異性以及操作方便、快速響應(yīng)和原位可視化而受到越來越多的關(guān)注［6，7］。迄今為止，已有諸多課題組開發(fā)出各種原理和報(bào)告基團(tuán)的熒光探針［8-11］用于生命體系次氯酸根的檢測(cè)，但是高靈敏度、能直接用于消殺防疫以及家庭用水余氯含量檢測(cè)的有效氯探針還少有報(bào)道。

文章以熒光素為報(bào)告基團(tuán)，以吡啶二甲酸為橋，設(shè)計(jì)并合成了一種能夠快速檢測(cè)市售含氯消殺產(chǎn)品以及自來水管網(wǎng)余氯含量的有效氯熒光探針D-FL-Cl。通過吡啶二甲酸將兩個(gè)熒光素酰肼橋聯(lián)，在提高檢測(cè)靈敏度的同時(shí)，進(jìn)一步提高了探針響應(yīng)的可靠性。通過熒光光譜對(duì)有效氯含量監(jiān)測(cè)能力進(jìn)行了考察，并進(jìn)一步探索了其在日用含氯消殺產(chǎn)品以及自來水余氯含量監(jiān)測(cè)中的應(yīng)用。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器和試劑

主要儀器：Esquire 3000 plus 電噴霧離子阱質(zhì)譜儀（美國，布魯克·道爾頓公司）；Bruker Advance-400 型核磁儀（美國，布魯克·道爾頓公司）；F-4600 熒光光度計(jì)（日立，Hitachi F-4600）。

主要試劑：熒光素購自于安耐吉公司；吡啶二甲酰氯購自梯希愛公司（上海），水合肼以及合成所用溶劑及常見原料藥品均購自于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；分析測(cè)試試劑選用分析純（A.R.），合成及分析實(shí)驗(yàn)如未特別注釋，均在室溫下進(jìn)行。

1.2 探針D-FL-Cl 合成

探針D-FL-Cl 的合成路線如圖1 所示。

圖1 探針D-FL-Cl 合成路線

1.2.1 熒光素肼的合成

將熒光素（3.320 g，10 mmol）溶于50 mL乙醇中，用恒壓滴液漏斗逐滴加入含有6 mL 水合肼的無水乙醇溶液（15 mL），30 min 內(nèi)滴加完畢，回流過夜至溶液熒光消失，顏色變?yōu)闊o色。將反應(yīng)液冷卻至室溫，加入到500 mL 冰水中，產(chǎn)生乳白色沉淀，抽濾，用水洗滌，干燥，得到白色固體（2.95 g，產(chǎn)率：85%）。產(chǎn)物無需純化，進(jìn)行下一步反應(yīng)。

1.2.2 D-FL-Cl 的合成

將熒光素肼（766 mg，2.2 mmol）和三乙胺（400 mg，4 mmol）溶于10 mL 無水乙腈中，置于50 mL 圓底燒瓶中，冰浴下用恒壓滴液漏斗逐滴加入溶有吡啶二甲酰氯（204 mg，1 mmol）的無水乙腈溶液，滴加完畢恢復(fù)至室溫，攪拌過夜，旋蒸，柱色譜純化（V二氯甲烷∶V甲醇=20 ∶1），得到D-FL-Cl 無色白色粉末（約650 mg，產(chǎn)率：79%）。1H NMR（400 MHz，DMSO-d6）δ 10.57（s，2 H），9.80（s，5 H），8.05（dd，J=8.5，7.0 Hz，1 H），7.92（dd，J=15.4，7.5 Hz，4 H），7.71-7.55（m，4 H），7.10（d，J=7.5 Hz，2 H），6.62（d，J=8.7 Hz，4 H），6.51（d，J=2.4 Hz，4 H），6.49（s，1 H）。

2 結(jié)果與討論

2.1 探針D-FL-Cl 對(duì)次氯酸ClO-的檢測(cè)性能

2.1.1 探針D-FL-Cl 對(duì)次氯酸ClO-的熒光響應(yīng)

文章首先研究了探針D-FL-Cl 與ClO-在PB緩沖液（pH=7.4，10 mmol/L）中的熒光光譜響應(yīng)情況。如圖2a 所示，在PB 緩沖液中，探針表現(xiàn)出非常微弱的熒光，隨著ClO-的不斷加入，體系在516 nm 處的熒光逐漸增強(qiáng)，當(dāng)體系中ClO-的濃度增加到30 μmol/L 時(shí)，體系的熒光強(qiáng)度增強(qiáng)了約212 倍，表現(xiàn)出超高的靈敏度。這緣于ClO-的存在使熒光素發(fā)生開環(huán)反應(yīng)進(jìn)而釋放出熒光素的熒光。由圖2b 可知，熒光強(qiáng)度與ClO-的濃度在0～15 μmol/L 范圍內(nèi)表現(xiàn)出非常好的線性關(guān)系（R2=0.9960）。

圖2 a）探針D-FL-Cl（5 μmol/L）對(duì)PB（pH=7.4，10 mmol/L）中不同濃度ClO-（0～30 μmol/L）的熒光滴定光譜；b）反應(yīng)體系在516 nm 處的熒光強(qiáng)度與ClO-濃度的關(guān)系

2.1.2 選擇性研究

為了考察探針D-FL-Cl 對(duì)ClO-的選擇性，在平行條件下考察了不同的陰離子、陽離子和氨基酸等在探針溶液中的響應(yīng)情況（圖3）。所有的陰、陽離子和氨基酸的濃度均為100 μmol/L，與之對(duì)照的ClO-的濃度為30 μmol/L。

圖3 探針D-FL-Cl（5 μmol/L）對(duì)PB（pH=7.4,10 mmol/L）中100 μmol/L 陰離子（a）、陽離子（b）、氨基酸（c）的熒光（516 nm 處）響應(yīng)

由圖3 可知，這些常見的分析物質(zhì)均未能引起探針分子熒光的恢復(fù)，D-FL-Cl 對(duì)ClO-表現(xiàn)出較好的選擇性。

2.1.3 熒光響應(yīng)機(jī)制

根據(jù)探針對(duì)次氯酸根的光譜響應(yīng)情況及參考相關(guān)文獻(xiàn)［12，13］，D-FL-Cl 對(duì)ClO-可能的響應(yīng)機(jī)制如圖4 所示，HClO 可將熒光素基吡啶二甲酰肼氧化為吡啶二甲酰亞胺，進(jìn)而導(dǎo)致熒光素螺環(huán)開環(huán)，熒光得以恢復(fù)。同時(shí)，體系在水溶液中進(jìn)一步發(fā)生水解而釋放出熒光素分子，實(shí)現(xiàn)探針體系對(duì)ClO-的熒光OFF-ON 響應(yīng)。

圖4 探針D-FL-Cl 對(duì)ClO-的響應(yīng)機(jī)制

2.2 探針D-FL-Cl 對(duì)84 消毒液有效氯評(píng)估

后疫情時(shí)代，含活性氯的消殺產(chǎn)品為家庭及公共健康安全提供了強(qiáng)有力的保障。有效氯的含量是該類產(chǎn)品殺菌消毒的關(guān)鍵，一種快速評(píng)估活性氯濃度的檢測(cè)方法至關(guān)重要。為了評(píng)估探針在后疫情時(shí)代消殺防疫領(lǐng)域應(yīng)用的可行性，文章選擇了家庭消殺最常用的市場(chǎng)化商品84 消毒液作為測(cè)試對(duì)象，并將其濃度稀釋20、200 和1000 倍。圖5-1 和圖5-2 分別顯示了自然光以及熒光燈下探針D-FL-Cl 對(duì)不同稀釋倍數(shù)的84 消毒液進(jìn)行活性氯檢測(cè)，并與1 mol/L H2O2溶液和空白（蒸餾水）對(duì)比。84 消毒液正常使用濃度為產(chǎn)品原液稀釋20 倍，結(jié)果表明，探針對(duì)稀釋1000 倍的產(chǎn)品仍表現(xiàn)出較強(qiáng)的熒光響應(yīng)，探針的靈敏度足以滿足日常消殺產(chǎn)品評(píng)估的需求。且H2O2等其他類型的氧化劑不能引起熒光響應(yīng)，不會(huì)對(duì)有效氯的含量監(jiān)測(cè)評(píng)估造成影響。

圖5 探針D-FL-Cl 在1）自然光、2）熒光下對(duì)不同稀釋倍數(shù)的84 消毒液進(jìn)行活性氯檢測(cè)（a：84消毒液稀釋20 倍，有效氯含量0.4～1.025 mg/mL；b：稀釋200 倍，有效氯含量0.04～0.1025 mg/mL；c：稀釋1000 倍，有效氯含量0.008～0.0205 mg/mL；d：1 mol/L H2O2 溶液；e：空白）

考慮到使用時(shí)的便攜性，文章將探針負(fù)載于Al2O3粉末上，對(duì)不同稀釋倍數(shù)（20、200、1000和2000 倍）的84 消毒液進(jìn)行了檢測(cè)，并與1 mol/L H2O2溶液和空白（蒸餾水）對(duì)比，結(jié)果如圖6。圖6 表明，固相負(fù)載的探針對(duì)稀釋2000 倍的產(chǎn)品仍表現(xiàn)出較強(qiáng)的熒光響應(yīng)，顯示了超高的靈敏度，能夠滿足日用消殺產(chǎn)品活性氯檢測(cè)要求。同樣，H2O2不能引起熒光響應(yīng)。

圖6 探針D-FL-Cl 負(fù)載于Al2O3 粉末上對(duì)不同稀釋倍數(shù)的84 消毒液進(jìn)行活性氯檢測(cè)（a：空白；b：1 mol/L H2O2 溶液；c：84 消毒液稀釋20 倍，有效氯含量0.4～1.025 mg/mL；d：稀釋200 倍，有效氯含量0.04～0.1025 mg/mL；e：稀釋1000 倍，有效氯含量0.008～ 0.0205 mg/mL；f：稀釋2000 倍，有效氯含量0.004～0.01025 mg/mL）

2.3 探針D-FL-Cl 對(duì)各種飲用水中余氯含量檢測(cè)

相較于消殺產(chǎn)品，日常自來水的飲用安全更是直接關(guān)系我們的健康。我國居民家用自來水凈化方式采用的是氯氣殺菌的方法。家庭用水余氯含量控制在一定范圍內(nèi)極為重要。過少的余氯意味著自來水出廠及運(yùn)輸過程中有效氯濃度不夠，容易導(dǎo)致水中細(xì)菌等滋生，凈化不徹底。而過高的余氯含量會(huì)直接影響到人體健康。文章通過所設(shè)計(jì)合成的探針D-FL-Cl 對(duì)自來水、井水以及蒸餾水進(jìn)行了余氯檢測(cè)（圖7）。由圖7 可知，b 管中熒光較強(qiáng)，可知自來水中相較于井水與蒸餾水余氯含量更高。結(jié)果表明，探針對(duì)自來水中的余氯含量表現(xiàn)出超高的靈敏度，可以用來指導(dǎo)自來水輸送過程中及管網(wǎng)末端余氯含量的監(jiān)測(cè)。

圖7 探針D-FL-Cl 用于自來水余氯檢測(cè)

3 結(jié)論

綜上所述，文章設(shè)計(jì)并合成了一種基于雙酰肼熒光素的吡啶二甲酸橋接熒光探針（D-FL-Cl）用于活性氯檢測(cè)。該探針對(duì)ClO-具有較高靈敏度，可以用于裸眼識(shí)別ClO-，同時(shí)該探針對(duì)活性氯表現(xiàn)出較好的選擇性。該探針可以應(yīng)用于日常生活中對(duì)84 消毒液等活性殺菌劑活性氯的有效評(píng)估，也可以實(shí)現(xiàn)自來水中余氯含量的監(jiān)測(cè)。