楊廣銘，梁光林，李結(jié)貞，李土珍，趙善飛

1.茂名市人民醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，廣東 茂名 525000；2.茂名市人民醫(yī)院兒科，廣東 茂名 525000

在生理條件之下，通過卵泡刺激素（folliclestimulating hormone, FSH）的作用，機體的卵母細胞中的胞漿會進一步發(fā)育成熟，再進一步通過黃體生成素（luteinizing hormone, LH）的作用最后成熟[1]。當(dāng)進行體外受精-胚胎移植（in vitro fertilizationembryo transfer, IVF-ET）技術(shù)時，會向患者注射外源性人絨毛膜促性腺激素（human choriogonadotropin,HCG），目的是讓卵母細胞有效成熟，進一步進行排卵，其成熟程度緊密影響著卵母細胞的受精能力和功能；不能成熟欠佳，也不能過熟，不然會整體影響受精與胚胎發(fā)育?，F(xiàn)今臨床通常在34～36 h 時間內(nèi)取卵，但是最佳授精時間還沒有確定一致[2]。本研究回顧性分析2021年3月—2023年3月在茂名市人民醫(yī)院生殖中心接受IVF-ET 治療，并采取拮抗劑方案的161 例COS 患者的臨床資料，研究拮抗劑方案注射HCG 后不同授精時間和IVF 助孕結(jié)局的關(guān)系，來分析最佳的授精時間，為實驗室和臨床提高IVF 助孕結(jié)局提供依據(jù)?，F(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取在本院生殖中心接受IVF-ET 治療，并采取拮抗劑方案，行新鮮周期移植的161 例COS 患者，分組的依據(jù)為注射HCG 后的不同授精時間，A組（n=26）：注射HCG 后的38～39 h（含39 h）授精；B組（n=77）：注射HCG 后的39～40 h（含40 h）授精；C組（n=46）：注射HCG 后的40～41 h（含41 h）授精；D組（n=12）：注射HCG 后的41～42h（含42 h）授精。4組患者的一般資料比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。見表1。

表1 4 組患者基線資料比較

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

納入標(biāo)準(zhǔn)：①因輸卵管方式不孕的女方；②獲卵數(shù)3～20 枚；④男方精液質(zhì)量達到IVF-ET 標(biāo)準(zhǔn)[3]；⑤夫妻雙方染色體正常。

排除標(biāo)準(zhǔn)：①女方患有多囊卵巢綜合征；②女方患有子宮內(nèi)膜異位癥；③女方的卵巢功能衰退；④生殖器結(jié)核；⑤女方的染色體異?；蛘咦訉m畸形。

1.3 方法

①控制性超促排：在月經(jīng)周期的第2～3 天選擇促性腺激素（gonadotropins, Gn）來開啟促排卵，并監(jiān)測機體卵泡的具體生長情況，用Gn 5～6 d 后如果優(yōu)勢卵泡的直徑在12～14 mm 時予以促性腺激素釋放激素拮抗劑（gonadotropin-releasing hormone antagonists, GnRH）0.25 mg/d，直至HCG 注射日。

②取卵、卵母細胞的臨床培養(yǎng)：在機體注射HCG，經(jīng)過34～36 h 后進一步取卵，需要借助陰道超聲的引導(dǎo)，并把卵母細胞放置在授精液的培養(yǎng)液里面培養(yǎng)，培養(yǎng)≥2 h 才能IVF 授精。

③體外授精與胚胎培養(yǎng)：精液通過密度梯度離心法與上游法共同處理后，把卵子和精子根據(jù)1∶20 000 的比例去放到授精液里面，放在培養(yǎng)箱里面培養(yǎng)。

④胚胎評分與胚胎移植：在授精后（17±1）h 左右，對受精情況進一步觀察，正常受精的標(biāo)志是出現(xiàn)兩個原核和兩個極體，然后需要每天進行觀察1次。于第3 天依據(jù)細胞數(shù)卵裂球數(shù)，均一度及碎片評分1～4 級，其中1 級為優(yōu)質(zhì)胚胎，1、2、3 級為可利用胚胎，按照患者的實際情況，決定是否要移植和最終要移植的胚胎數(shù)量，剩余的胚胎，在經(jīng)過患者的知情同意后對其進行囊胚培養(yǎng)或者是囊胚培養(yǎng)，形成囊胚后，根據(jù)Gardner 評分對其進行評估。

⑤臨床結(jié)局的有效判斷：在移植14 d 后抽取機體血測HCG 去判斷是否出現(xiàn)生化妊娠，在移植28 d時予以超聲檢查，確認(rèn)有無胎心與孕囊，確認(rèn)有無臨床妊娠。

其中A 組注射HCG 后的38～39 h（含39 h）授精；B 組注射HCG 后的39～40 h（含40 h）授精；C 組注射HCG 后的40～41 h（含41 h）授精；D 組注射HCG 后的41～42 h（含42 h）授精。

1.4 觀察指標(biāo)

胚胎發(fā)育指標(biāo)情況：正常受精率、1PN（單原核）率、多PN（多原核）率、正常卵裂率、可用胚胎率、優(yōu)質(zhì)胚胎率、囊胚形成率。其中正常受精率=正常受精卵子數(shù)/受精卵子數(shù)×100%；可用胚胎率=可用胚胎數(shù)/正常受精卵子數(shù)×100%；正常卵裂率=正常受精卵裂數(shù)/受精數(shù)×100%；優(yōu)質(zhì)胚胎率=優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)/可利用胚胎數(shù)×100%；囊胚形成率=2 期及以上囊胚/囊胚培養(yǎng)數(shù)×100%。

臨床結(jié)局指標(biāo)：臨床妊娠率、胚胎著床率、早期流產(chǎn)率以及每移植周期活產(chǎn)率。其中臨床妊娠率=臨床妊娠周期數(shù)/移植周期數(shù)×100%；胚胎著床率=孕囊數(shù)/總移植胚胎數(shù)×100%；早期流產(chǎn)率=孕12 周內(nèi)自然流產(chǎn)周期數(shù)/臨床妊娠周期數(shù)×100%；每移植周期活產(chǎn)率=活產(chǎn)的分娩數(shù)/新鮮胚胎移植周期數(shù)×100%。

1.5 統(tǒng)計方法

數(shù)據(jù)用SPSS 22.0 統(tǒng)計學(xué)軟件做分析，計數(shù)資料行χ2檢驗，用例數(shù)（n）和率（%）表示，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 4 組患者胚胎發(fā)育指標(biāo)對比

D 組的優(yōu)質(zhì)胚胎率優(yōu)于另外3 組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。而4 組正常受精率、1PN 率、多PN 率、可用胚胎率、正常卵裂率以及囊胚形成率對比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

表2 4 組患者胚胎發(fā)育指標(biāo)對比（%）

2.2 4 組患者臨床結(jié)局指標(biāo)對比

4 組的臨床妊娠率以及每移植周期活產(chǎn)率對比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），但是D 組的胚胎著床率和早期流產(chǎn)率優(yōu)于另外3 組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表3。

表3 4 組患者臨床結(jié)局指標(biāo)對比（%）

3 討論

正常的機體條件下，核成熟與胞質(zhì)成熟是機體卵母細胞的整體成熟的標(biāo)志，兩者共同作用才能有效保障卵母細胞的正常受精和胚胎[4-5]。但是有研究發(fā)現(xiàn)，控制性促排卵獲得的機體卵母細胞的成熟狀態(tài)呈現(xiàn)不一致。取卵后，整體的成熟情況和受精、胚胎的發(fā)育潛能也會受到體卵母細胞在外界具體的孵育時間，若受精太早的話，有部分的卵母細胞會有胞質(zhì)未成熟的現(xiàn)象，還有部分卵母細胞的核質(zhì)沒有達到成熟，會造成受精率低的現(xiàn)象，但若授精時間太晚的情況下，卵母細胞會容易出現(xiàn)老化的現(xiàn)象，這樣會進一步提升紡錘體結(jié)構(gòu)異常的整體比率，進一步使卵母細胞中的染色體結(jié)構(gòu)會發(fā)生異常，最終受精率與胚胎質(zhì)量會受到影響[6]。

現(xiàn)今的臨床中，在HCG 注射后，授精的具體時間沒有統(tǒng)一，以往的研究顯示，HCG 注射后在39～40 h 時間內(nèi)可以進行授精的話，其最終的臨床妊娠結(jié)局良好；所以研究認(rèn)為，該時間段內(nèi)卵母細胞的成熟情況良好，而且受精卵可以正常結(jié)合[7]。還有部分研究顯示，成熟卵母細胞里紡錘體的產(chǎn)生會受到HCG 注射后時間的影響，在39～40.5 h 時間內(nèi)，會發(fā)現(xiàn)大部分的MⅡ卵母細胞產(chǎn)生紡錘體，則會認(rèn)為這個時間段可能是最佳的授精時間段[8]。

有相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，卵母細胞的外界培養(yǎng)時間如果太長的話，機體的紡錘體結(jié)構(gòu)很容易遭到破壞，會影響最終的發(fā)育能力。有臨床學(xué)者研究HCG 注射后的不同授精時間，結(jié)果發(fā)現(xiàn)優(yōu)質(zhì)胚胎率和可利用胚胎率最高的時間段是41～42 h 之間，且臨床妊娠率也較好[9-10]，該研究結(jié)果和本文中研究結(jié)果數(shù)據(jù)是保持一致的。研究指出，在HCG 注射后40～41 h時間內(nèi)，其胚胎著床率與臨床妊娠率能夠提高。本研究結(jié)果數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，D 組的優(yōu)質(zhì)胚胎率44.00%更好（P＜0.05）；與汪佳星等[1]研究中優(yōu)質(zhì)胚胎率：A 組（33.9%）＜B 組（39.5%）＜C 組（41.8%）＜D 組（44.6%）（P＜0.05）的結(jié)果具有一致性。研究數(shù)據(jù)說明，HCG注射后，對授精時間適當(dāng)增加后，會整體提高胚胎的質(zhì)量；當(dāng)時間在41～42 h 內(nèi)進行受精的話，臨床妊娠率最高，說明這個時間段授精的妊娠結(jié)局良好。還有研究提出，拮抗劑方案聯(lián)合HCG 對IVF-ET 臨床結(jié)局的影響，得出了添加少量的HCG，將可以將優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)量進一步提高[11-12]。

綜上所述，時間在38～42 h 內(nèi)的IVF-ET 的臨床結(jié)局并不會受到拮抗劑方案HCG 注射后的不同授精時間的影響，但如果在這個時間范圍內(nèi)，將授精時間在一定程度上延遲時，會進一步增加患者優(yōu)質(zhì)胚胎率。