付怡丹 ，陳文婷 ，蘇曉楊 ，趙 燕 ，蘭丹鳳 ，楊秋萍

（1）昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院干療科;2）重癥醫(yī)學(xué)科;3）糖尿病科，云南 昆明 650032;4）云南省第一人民醫(yī)院消化內(nèi)科，云南昆明 650032;5）昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院內(nèi)分泌一科，云南 昆明 650032）

糖尿?。╠iabetes mellitus，DM）是一組以慢性高血糖為特征的代謝性疾病。糖尿病周?chē)窠?jīng)病變（diabetic peripheral neuropathy，DPN）是糖尿病最常見(jiàn)的并發(fā)癥之一，國(guó)內(nèi)患病率達(dá)67.6%，其中重度 DPN 患病率達(dá)19.3%[1]。雪旺細(xì)胞作為周?chē)窠?jīng)系統(tǒng)中最重要的髓鞘細(xì)胞，參與維持周?chē)窠?jīng)的正常結(jié)構(gòu)和功能[2-3]，炎癥反應(yīng)對(duì)雪旺細(xì)胞的損傷是DPN 發(fā)生發(fā)展的重要因素[4]。核因子κB（nuclear factor kappa-b，NF-κb）級(jí)聯(lián)反應(yīng)是炎癥反應(yīng)的調(diào)控中心，抑制NF-κb 通路，有望降低炎性細(xì)胞因子的表達(dá)，最終改善神經(jīng)損傷[5]。

Mer 受體酪氨酸激酶（Mer receptertyroshin kinase，Mertk）是受體酪氨酸激酶家族TAM 成員之一，作為一種單跨膜受體可以通過(guò)結(jié)合多種配體將信號(hào)從細(xì)胞外基質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)至細(xì)胞質(zhì)，調(diào)節(jié)眾多生理過(guò)程[6-8]?，F(xiàn)有文獻(xiàn)顯示[9-10]，Mertk 能夠抑制促炎性細(xì)胞因子IL-12、干擾素和NF-κb 的表達(dá)，從而抑制炎癥信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。本課題前期利用公共數(shù)據(jù)庫(kù)，發(fā)現(xiàn)并報(bào)道[11]Mertk 基因表現(xiàn)出糖尿病周?chē)窠?jīng)病變的疾病特異性，但Mertk 在雪旺細(xì)胞中的可能作用及其調(diào)控機(jī)制尚不清楚。為此，本研究通過(guò)沉默大鼠雪旺細(xì)胞內(nèi)Mertk 基因，探究Mertk 是否通過(guò)調(diào)控炎癥反應(yīng)NF-κb 通路相關(guān)蛋白B 細(xì)胞κ 輕肽基因增強(qiáng)子抑制因子激酶ε（inhibitor kappa B kinaseβ，Ikbkb）、P65、TNFα，從而影響雪旺細(xì)胞炎癥反應(yīng)。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

AI1600 超靈敏化學(xué)發(fā)光成像儀（GE 公司，美國(guó)）和正置熒光顯微鏡（Olympus 公司，日本）來(lái)源于昆明醫(yī)科大學(xué)科技成果孵化中心，垂直電泳及濕式轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)購(gòu)自北京六一生物科技公司。葡萄糖濃度為4.5 g/L（25 mmol/L）的DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清、青霉素-鏈霉素雙抗和含EDTA 的0.25%胰蛋白酶消化液均購(gòu)自美國(guó)GIBCO 公司，無(wú)水葡萄糖購(gòu)自廣州光華科技有限公司，BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)自上海碧云天公司，Mertk、Ikbkb抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam 公司，P65 抗體、TNF-α抗體、β-actin 抗體、IgG 抗體、抗兔/抗鼠第二抗體購(gòu)自武漢Proteintech 公司，免疫熒光試劑盒購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司，免疫共沉淀試劑盒購(gòu)自上海愛(ài)必信科技有限公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

大鼠雪旺氏細(xì)胞株（RSC96）來(lái)自昆明醫(yī)科大學(xué)科技成果孵化中心，生長(zhǎng)所需細(xì)胞培養(yǎng)基配比是DMEM 培養(yǎng)基∶胎牛血清∶雙抗=100∶10∶1，放置在37℃、5% CO2飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。

1.3 Mertk 在高糖環(huán)境雪旺細(xì)胞中表達(dá)

將RSC96 細(xì)胞隨機(jī)分為對(duì)照組（25 mmol/L 組）和處理組（50、75、100 及125 mmol/L 組）。首先使用不添加胎牛血清的培養(yǎng)基進(jìn)行饑餓處理4 h，再將DMEM 培養(yǎng)基中葡萄糖濃度分別調(diào)整至50 mmol/L、75 mmol/L、100 mmol/L 及125 mmol/L，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，Western blot 檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)Mertk 蛋白表達(dá)水平。

1.4 免疫共沉淀檢測(cè)內(nèi)源性Mertk、Ikbkb 相互作用

培養(yǎng)3 瓶RSC96 細(xì)胞。以L(fǎng)ysis buffer∶PMSF=100∶1 配制裂解液，將RSC96 細(xì)胞裂解、超聲、離心、留取Input 蛋白，所得產(chǎn)物分別加入Mertk、Ikbkb、IgG 一抗1～5 μg，4℃孵育過(guò)夜后加入5 μL Protein A 與Protein G，再經(jīng)過(guò)孵育、洗滌、離心、SDS 緩沖液重懸、變性得到終產(chǎn)物，最后利用免疫印跡法檢測(cè)Mertk 與Ikbkb 的相互作用。

1.5 免疫印跡法檢測(cè)沉默Mertk 后RSC96 內(nèi)Ikbkb、P65、TNF-α 表達(dá)水平

將3 種Mertk siRNA 試劑（siRNA1/siRNA2/siRNA3）及空載對(duì)照（NC）利用GP-Transfect-Mate試劑轉(zhuǎn)染進(jìn)入RSC96 細(xì)胞。48 h 后根據(jù)BCA 試劑盒說(shuō)明書(shū)所述提取總蛋白，免疫印跡法檢測(cè)Mertk、Ikbkb、P65、TNF-α 表達(dá)水平。siRNA核苷酸序列見(jiàn)表1。

表1 Mertk 小干擾核苷酸序列Tab.1 Mertk-RNA oligo sequences

1.6 免疫熒光法檢測(cè)沉默Mertk 后炎癥因子TNFα 表達(dá)

在玻璃爬片上培養(yǎng)RSC96 細(xì)胞，隨機(jī)分為對(duì)照組（Con 組）和實(shí)驗(yàn)組（siRNA3 組），按組別處理細(xì)胞。48 h 后細(xì)胞經(jīng)過(guò)固定、通透、封閉等步驟后，分別加入Mertk（1∶200）、Ikbkb（1∶200）、P65（1∶200）一抗4℃孵育過(guò)夜，第2 天加入相對(duì)應(yīng)種屬的熒光二抗暗室內(nèi)孵育；DAPI 染細(xì)胞核10 min 后，將細(xì)胞爬片倒扣在滴有熒光淬滅劑的載玻片上，使用正置熒光顯微鏡觀(guān)察并拍照。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS23.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料采用Kolmogorov-Smirnov 法檢驗(yàn)數(shù)據(jù)正態(tài)性，符合正態(tài)分布時(shí)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間單因素比較采用單因素方差分析。P＜ 0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Mertk 在雪旺細(xì)胞的表達(dá)

首先明確Mertk 在雪旺細(xì)胞中是否表達(dá)，以及模擬糖尿病高糖環(huán)境下Mertk 表達(dá)水平的變化情況。免疫印跡結(jié)果顯示，Mertk 在雪旺細(xì)胞中存在表達(dá)，且隨葡萄糖濃度增加，細(xì)胞Mertk 表達(dá)水平增加（P＜ 0.05），見(jiàn)表2 和圖1。

圖1 不同葡萄糖水平RSC96 內(nèi)Mertk 蛋白表達(dá)Fig.1 Mertk protein expression within RSC96 at different glucose levels

表2 不同葡萄糖水平RSC96 內(nèi)Mertk 蛋白表達(dá)Tab.2 Mertk protein expression within RSC96 at different glucose levels

2.2 Mertk 與Ikbkb 內(nèi)源性相互作用

以非特異免疫的同源抗體IgG 作為陰性對(duì)照，以Input 作為陽(yáng)性對(duì)照，免疫共沉淀結(jié)果顯示，RSC96 細(xì)胞內(nèi)同時(shí)表達(dá)Mertk、Ikbkb，且二者之間存在相互作用關(guān)系，見(jiàn)圖2。

圖2 Mertk 與Ikbkb 免疫共沉淀Fig.2 Co-Immunoprecipitation of Mertk with Ikbkb

2.3 沉默Mertk 對(duì)雪旺細(xì)胞Ikbkb、P65、TNF-α蛋白表達(dá)的影響

免疫印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，3 種siRNA 均使Mertk 表達(dá)含量下降（P＜ 0.05），同時(shí)Ikbkb、P65、TNF-α 表達(dá)水平隨Mertk 表達(dá)水平的降低而升高（P＜ 0.05），見(jiàn)表3 和圖3。

圖3 沉默Mertk 后Ikbkb、P65、TNF-α 蛋白表達(dá)水平Fig.3 Ikbkb，P65，and TNF-α protein expression levels after silencing Mertk

表3 沉默Mertk 后Ikbkb、P65、TNF-α 蛋白表達(dá)量Tab.3 Ikbkb，P65，and TNF-α protein expression after silencing Mertk

2.4 免疫熒光檢測(cè)Mertk、Ikbkb、P65 蛋白

以siRNA3 轉(zhuǎn)染RSC96 細(xì)胞后，Mertk、Ikbkb、P65 蛋白免疫熒光結(jié)果與免疫印跡實(shí)驗(yàn)一致，見(jiàn)圖4。

圖4 免疫熒光檢測(cè)siRNA3 轉(zhuǎn)染后Mertk、Ikbkb、P65 蛋白表達(dá)（200x）Fig.4 Immunofluorescence detection of Mertk，Ikbkb，and P65 protein expression after siRNA3 transfection（200x）

3 討論

糖尿病周?chē)窠?jīng)病是糖尿病患者最常見(jiàn)的慢性并發(fā)癥，是導(dǎo)致糖尿病患者截肢，生活質(zhì)量下降及死亡的主要原因之一，加重社會(huì)負(fù)擔(dān)[12]。糖尿病周?chē)窠?jīng)病變以神經(jīng)纖維脫髓鞘、神經(jīng)傳導(dǎo)速度受損為特征[13]，而雪旺細(xì)胞正是周?chē)窠?jīng)系統(tǒng)中最重要的髓鞘細(xì)胞；雪旺細(xì)胞損傷與凋亡是糖尿病周?chē)窠?jīng)病變的重要病理學(xué)特征之一，也是導(dǎo)致糖尿病髓鞘功能不良的主要因素[14]。因此，本研究以大鼠雪旺細(xì)胞作為研究對(duì)象，以此作為糖尿病周?chē)窠?jīng)病變研究的重要切入點(diǎn)，并且首先明確了Mertk 在雪旺細(xì)胞中的表達(dá)，即隨著細(xì)胞生長(zhǎng)環(huán)境內(nèi)葡萄糖濃度的提高，Mertk 表達(dá)量也隨之提高。

蛋白質(zhì)通常不是作為單一物質(zhì)發(fā)揮作用，而是以蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的方式在活細(xì)胞生物過(guò)程中發(fā)揮作用。本研究結(jié)果通過(guò)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證了雪旺細(xì)胞內(nèi)Mertk 與Ikbkb 的內(nèi)源性相互作用。Ikbkb（也稱(chēng)IKKβ、IKK2）是IKK 復(fù)合體的催化亞基之一，而IKK 復(fù)合體是NF-κb信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，可迅速激活NFκb，以協(xié)調(diào)大多數(shù)靶基因的表達(dá)[15-16]。因此，本實(shí)驗(yàn)試圖進(jìn)一步探究Mertk 是否間接調(diào)控NFκb 通路，對(duì)雪旺細(xì)胞炎癥反應(yīng)產(chǎn)生影響。

為達(dá)到這一目的，本研究使用siRNA 敲減沉默表達(dá)Mertk 后，發(fā)現(xiàn)P65 及其下游炎癥因子TNF-α 表達(dá)水平升高，表明NF-κb 通路受到正向調(diào)控，雪旺細(xì)胞內(nèi)炎癥反應(yīng)加重。經(jīng)典的NFκb 系統(tǒng)是由亞基p50 和P65 組成的復(fù)合體，在大多數(shù)靜息細(xì)胞中，NF-κb 以抑制物IκB 的形式存在。糖尿病病理過(guò)程產(chǎn)生的刺激，可導(dǎo)致IKK 特異性地磷酸化IκB，進(jìn)而允許p50 和P65向細(xì)胞核發(fā)出信號(hào)，激活大量有關(guān)基因[17]。NFκb 通路調(diào)控的促炎細(xì)胞因子是神經(jīng)血管損傷和神經(jīng)傳導(dǎo)速度受損的主要原因，抑制NF-κb 通路，有望降低炎性細(xì)胞因子的表達(dá)，最終改善神經(jīng)損傷[5]。由此，課題組推測(cè)，以Mertk 基因?yàn)榘悬c(diǎn)進(jìn)行研究可能為糖尿病周?chē)窠?jīng)病的治療提供新的思路。

綜上所述，本研究以雪旺細(xì)胞為研究對(duì)象，發(fā)現(xiàn)Mertk 與Ikbkb 相互作用，沉默Mertk 可上調(diào)Ikbkb，繼而激活NF-κb 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，上調(diào)P65 及其下游炎癥因子TNF-α 表達(dá)水平。本研究對(duì)糖尿病周?chē)窠?jīng)病變的發(fā)病機(jī)制、臨床藥物的治療、靶向藥物的研發(fā)都有非常積極的作用，這些體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)也為進(jìn)一步的動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)以及臨床血清分子標(biāo)記驗(yàn)證打下了基礎(chǔ)。