王軍偉,馬桂巧,張佩佩,邵 婧,馬嬋娟,3*

(1山西中醫(yī)藥大學(xué)第三臨床學(xué)院腎內(nèi)科,晉中 030600;2山西醫(yī)科大學(xué)第五臨床醫(yī)學(xué)院腎內(nèi)科;3山西省人民醫(yī)院腎內(nèi)科;*通訊作者,E-mail：mcj5670206@163.com)

糖尿病腎病(diabetic kidney disease,DKD)作為糖尿病的嚴重并發(fā)癥,對患者的健康構(gòu)成了嚴重威脅,影響了數(shù)億人的生活質(zhì)量[1]。DKD是糖尿病患者進展為終末期腎病(end-stage renal disease,ESRD)的主要原因之一,最終需要腎臟透析或移植[2]。長期高血糖會誘導(dǎo)氧化應(yīng)激和線粒體功能障礙,破壞細胞內(nèi)氧化還原平衡,并引起胰島素抵抗,從而導(dǎo)致多種并發(fā)癥[3]。高糖(high glucose,HG)誘導(dǎo)的腎小管上皮細胞氧化應(yīng)激和凋亡在DKD的發(fā)病機制中起重要作用。高糖不僅增加了細胞內(nèi)ROS水平,而且削弱了抗氧化酶系統(tǒng)的能力,從而加重了機體的氧化應(yīng)激狀態(tài)[4]。氧化應(yīng)激對腎小管的損傷包括凋亡、肥大、纖維化等病理改變。腎小管損傷被認為是DKD的重要病理改變[5]。因此,預(yù)防和治療腎小管損傷,阻斷高糖誘導(dǎo)的細胞凋亡和氧化損傷已成為DKD治療的重要靶點之一。

AKT/GSK3β信號通路是一個重要的細胞信號傳導(dǎo)途徑,它參與調(diào)節(jié)多種生物學(xué)過程,包括細胞增殖、存活和凋亡等。這個信號通路由蛋白激酶B(protein kinase B,PKB又稱AKT)和糖原合成酶激酶-3β(glycogen synthase kinase 3β,GSK3β)2個主要蛋白質(zhì)組成[6]。AKT通過直接抑制GSK3β的磷酸化來增強細胞生存的信號。GSK3β具有促進細胞凋亡的作用,活化的AKT通過抑制GSK3β的活性,降低了其對凋亡相關(guān)蛋白的磷酸化,從而抑制細胞凋亡[7]。因此AKT的激活抑制了GSK3β的活性,從而減輕細胞凋亡。細胞氧化應(yīng)激是細胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)失衡引起的一種病理過程。AKT的激活可以通過抑制GSK3β減少細胞內(nèi)活性氧自由基的產(chǎn)生,并增強抗氧化能力,從而減輕細胞的氧化應(yīng)激損傷。

槐杞黃(Huaiqihuang, HQH)是一種傳統(tǒng)中藥復(fù)方制劑,由槐耳、枸杞子、黃精組成。包括黃酮類化合物、多糖、多酚類化合物等有效成分[8]。槐杞黃具有多種藥理作用,包括抗氧化、抗炎、抗纖維化等,在中醫(yī)藥臨床實踐中被廣泛應(yīng)用于治療腎臟病等其他疾病[9]。然而,槐杞黃對腎小管上皮細胞(human kidney-2,HK-2)氧化應(yīng)激和凋亡的作用鮮有報道。因此,本研究將聚焦槐杞黃對腎小管上皮細胞氧化應(yīng)激和凋亡的作用及其調(diào)控機制,通過高糖處理HK-2細胞,觀察槐杞黃對細胞氧化損傷和凋亡的保護作用,并以AKT/GSK3β抗氧化抗凋亡途徑為切入點探索其作用機制,為臨床防治腎臟病提供新的思路及支持。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

卡托普利購自美國MCE公司;CCK-8試劑盒購自美國APExBIO公司;SOD和MDA檢測試劑盒購自南京建成生物工程有限公司;活性氧檢測試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司;BCA蛋白定量試劑盒購自上海雅酶生物醫(yī)藥科技有限公司;cleaved-Caspase-3抗體購自美國CST公司;p-GSK3β抗體和GSK3β抗體購自美國Santa Cruz公司;蛋白提取裂解液、TUNEL檢測試劑盒、p-AKT抗體、AKT抗體、Bax抗體、Bcl-2抗體、Caspase-3抗體和GAPDH抗體,以及HRP標記的山羊抗兔、山羊抗小鼠二抗購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司。

槐杞黃清膏是槐耳菌質(zhì)、黃精、枸杞的提取物,為棕褐色稠厚的半流體,由江蘇啟東蓋天力醫(yī)藥有限公司饋贈;將2 g的槐杞黃溶解在20 ml的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中,作為濃度為100 mg/ml的原液,通過0.22 μm濾膜滅菌,密封后-20 ℃保存。

1.2 細胞株及細胞培養(yǎng)

HK-2細胞購自湖南豐暉生物科技有限公司。HK-2細胞使用含有5.5 mmol/L葡萄糖、10%胎牛血清、1%青霉素和鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基在37 ℃、95%濕度和5%CO2的培養(yǎng)箱環(huán)境條件下進行培養(yǎng)。

1.3 細胞分組和處理

HK-2細胞分為5組：正常對照組(Control,CON)、甘露醇組(Mannitol,MAN)、高糖模型組(high glucose,HG),槐杞黃組(HQH),卡托普利組(Captopril, CAP)。正常對照組使用含有5.5 mmol/L葡萄糖的DMEM培養(yǎng)基正常培養(yǎng);甘露醇組在正常組的基礎(chǔ)上加入終濃度為34.5 mmol/L的甘露醇刺激48 h;高糖模型組使用含有40 mmol/L葡萄糖的DMEM培養(yǎng)基刺激48 h;槐杞黃組在高糖模型組的基礎(chǔ)上加入終濃度為8 mg/ml的槐杞黃共同刺激48 h;卡托普利組在高糖模型組的基礎(chǔ)上加入終濃度為100 μmol/L的卡托普利共同刺激48 h。甘露醇組用于排除滲透壓對細胞的影響,另外,卡托普利是一種血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑,能縮小腎小球濾過膜孔徑,修復(fù)其通透性,進一步減少蛋白尿和腎小管損傷[10],因此本研究選擇了卡托普利作為陽性對照。

1.4 CCK-8檢測細胞活力

將細胞以1×104個/孔的密度接種到96孔培養(yǎng)板中,當(dāng)細胞融合度達到70%時,將細胞分為正常對照組、高糖模型組和不同藥物濃度槐杞黃組,正常對照組使用含有5.5 mmol/L葡萄糖的DMEM培養(yǎng)基正常培養(yǎng);高糖模型組使用含有40 mmol/L葡萄糖的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h;槐杞黃組在高糖模型組的基礎(chǔ)上分別加入終濃度為2,4,6,8,10,12和14 mg/ml的槐杞黃共同孵育48 h。在干預(yù)結(jié)束后,向每孔中加入10 μl CCK-8試劑,并在37 ℃下繼續(xù)孵育2 h,使用酶標儀檢測450 nm的吸光度。

1.5 活性氧檢測試劑盒檢測ROS生成

將HK-2細胞接種到6孔板中,細胞按照1.3分組處理后,用PBS洗滌,并用10 μmol/L 2′,7′二氯二氫熒光素二乙酸酯(DCFH-DA)在37 ℃下避光孵育20 min。用無血清培養(yǎng)基洗滌細胞3次,在倒置熒光顯微鏡下觀察ROS的生成并采集圖像,隨后用Image J軟件分析圖像的平均熒光強度。

1.6 HK-2細胞中SOD和MDA含量測定

超氧化物歧化酶活性檢測試劑盒、丙二醛測定試劑盒測定HK-2細胞中SOD和MDA含量。細胞分組和處理后,去除培養(yǎng)液,收集細胞。使用超聲波細胞破碎器對收集的HK-2細胞進行勻漿,離心收集上清。將上清液和工作試劑轉(zhuǎn)移到96孔板中,通過計算的蛋白質(zhì)濃度對SOD和MDA濃度歸一化。分別在450,532,562 nm處的吸光度檢測SOD、MDA和蛋白含量。

1.7 RT-qPCR檢測KIM-1、NGAL mRNA表達水平

使用RNA細胞快速提取試劑盒從細胞中提取總mRNA。用PrimeScript RT reagent Kit將其逆轉(zhuǎn)成cDNA。用TB Green premix Ex TaqⅡ在CFX96系統(tǒng)進行定量PCR分析。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30 s、95 ℃變性5 s,60 ℃退火延伸30 s,變性和退火延伸進行40個循環(huán)。以β-actin作為內(nèi)參,使用2-ΔΔCt方法計算基因表達量差異。PCR引物見表1。

表1 RT-qPCR引物序列

1.8 Western blot檢測Bax、Bcl-2、cleaved-Caspase-3、Caspase-3、p-AKT、AKT、p-GSK-3β、GSK-3β蛋白表達水平

將細胞在含有1%磷酸酶抑制劑和蛋白酶抑制劑混合物的RIPA緩沖液中裂解。通過BCA蛋白測定試劑盒檢測蛋白濃度。通過SDS-PAGE分離所研究的蛋白質(zhì)并轉(zhuǎn)移至PVDF膜,將PVDF膜在室溫下在含有5%脫脂奶粉的TBST中封閉2 h,加一抗(cleaved-Caspase-3、Caspase-3、p-GSK-3β、GSK-3β的稀釋比例為1∶1 000,Bcl-2、p-AKT、AKT的稀釋比例為1∶2 000,Bax、GAPDH的稀釋比例為1∶5 000),4 ℃孵育過夜。用TBST緩沖液洗滌后,將膜與二抗(山羊抗兔二抗、羊抗小鼠二抗的稀釋比例為1∶8 000)在室溫孵育1 h。均勻滴加ECL顯色液,于凝膠成像儀中曝光和拍照。使用Image J軟件分析蛋白質(zhì)灰度值,以GAPDH作為內(nèi)參對照。

1.9 統(tǒng)計學(xué)分析

使用GraphPad Prism 8.0軟件進行統(tǒng)計分析。實驗數(shù)據(jù)以平均值±標準差表示,兩組間比較使用成組t檢驗進行分析。多組間比較采用單因素ANOVA分析,組間兩兩比較用Tukey檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 槐杞黃對高糖誘導(dǎo)的HK-2細胞存活率的影響

CCK-8結(jié)果顯示,與正常對照組比較,高糖模型組細胞存活率顯著降低(P<0.001);與高糖模型組相比,不同濃度槐杞黃(2,4,6,8,10,12,14 mg/ml)組HK-2細胞存活率明顯改善,并且當(dāng)槐杞黃濃度為8 mg/ml時達到峰值(P<0.001,見圖1),因此選擇8 mg/ml槐杞黃用于后續(xù)實驗。與正常對照組相比,高糖模型組腎小管損傷標志物KIM-1和中性粒細胞相關(guān)載脂蛋白NGAL mRNA的表達水平顯著增加(P<0.001),與高糖模型組比較,槐杞黃組和卡托普利組KIM-1和NGAL mRNA的表達水平均顯著降低(P<0.001);而槐杞黃組與卡托普利組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(見圖1)。

與CON比較,###P<0.001;與HG比較,*P<0.05,***P<0.001圖1 HQH對高糖誘導(dǎo)的HK-2細胞存活率和KIM-1、NGAL mRNA水平的影響 (n=3)Figure 1 Effect of HQH on the survival rate of high glucose-induced HK-2 cells and the levels of KIM-1 and NGAL mRNA (n=3)

2.2 槐杞黃減少高糖誘導(dǎo)的HK-2細胞ROS的產(chǎn)生

與正常對照組相比,高糖模型組細胞內(nèi)ROS水平顯著升高(P<0.001);與高糖模型組相比,槐杞黃組和卡托普利組藥物干預(yù)后ROS水平顯著降低(P<0.001,見圖2);而槐杞黃組與卡托普利組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果表明,槐杞黃對ROS的過量產(chǎn)生具有顯著的抑制作用。

2.3 槐杞黃抑制高糖誘導(dǎo)的HK-2細胞氧化應(yīng)激

與正常對照組比較,高糖模型組HK-2細胞MDA含量顯著升高,SOD活性顯著下降(均P<0.001);與高糖模型組比較,槐杞黃組和卡托普利組MDA含量顯著下降,而SOD活性顯著上升(均P<0.001);而槐杞黃組與卡托普利組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(見圖3)。表明槐杞黃可以降低高糖環(huán)境下HK-2細胞中脂質(zhì)過氧化反應(yīng),并提高細胞的抗氧化能力。

圖2 DCFH-DA檢測槐杞黃對高糖誘導(dǎo)HK-2細胞ROS表達水平的影響 (×200,n≥3)Figure 2 Effect of HQH on ROS expression in HK-2 cells induced by high glucose by DCFH-DA (×200,n≥3)

與CON比較,###P<0.001;與HG比較,***P<0.001圖3 槐杞黃對高糖誘導(dǎo)HK-2細胞MDA和SOD含量的影響 (n=3)Figure 3 Effect of HQH on MDA and SOD contents in HK-2 cells induced by high glucose (n=3)

2.4 槐杞黃抑制高糖誘導(dǎo)的HK-2細胞凋亡

Western blot結(jié)果顯示,與正常對照組相比,高糖模型組細胞中促凋亡蛋白Bax和cleaved-Caspase-3的表達水平顯著增加(P<0.001),而抗凋亡蛋白Bcl-2的表達水平明顯下調(diào)(P<0.001),同時Bcl-2/Bax比值也顯著降低(P<0.001,見圖4)。與高糖模型組相比,槐杞黃組和卡托普利組細胞中促凋亡蛋白Bax和cleaved-Caspase-3的表達水平顯著下降(P<0.001),而抗凋亡蛋白Bcl-2的表達水平明顯上調(diào)(P<0.01),同時Bcl-2/Bax比值也顯著上升(P<0.001,見圖4)。槐杞黃組與卡托普利組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

2.5 槐杞黃對AKT/GSK3β信號通路的調(diào)控效應(yīng)

與對照組比較,高糖模型組p-AKT蛋白表達水平明顯減少(P<0.001),p-GSK-3β蛋白表達水平明顯增加(P<0.001);與高糖模型組比較,槐杞黃組和卡托普利組p-AKT表達上升(P<0.01),p-GSK-3β表達水平降低(P<0.01,見圖5)?；辫近S組與卡托普利組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

3 討論

DKD是糖尿病最嚴重的并發(fā)癥之一,并且是慢性腎臟病的最常見原因[11]。越來越多的證據(jù)表明,氧化應(yīng)激和細胞凋亡與糖尿病誘導(dǎo)的腎損害有關(guān)[12,13]。腎小球系膜擴張、基底膜增厚和腎小管損傷是DKD的主要形態(tài)學(xué)改變,這些病理改變均與氧化應(yīng)激和細胞凋亡有關(guān)[14,15]。在這種情況下,抗氧化應(yīng)激和抗細胞凋亡可能為DKD的治療提供有希望的策略[16,17]。近年來,中成藥槐杞黃顆粒由于其具有抗氧化和抗凋亡特性而被廣泛研究[18,19]。

與CON比較,###P<0.001;與HG比較,**P<0.01,***P<0.001圖4 Western blot法檢測槐杞黃對高糖誘導(dǎo)HK-2細胞Bcl-2、Bax、Caspase-3和cleaved-Caspase-3表達的影響 (n=3)Figure 4 Effect of HQH on expressions of Bcl-2, Bax, Caspase-3 and cleaved-Caspase-3 in HK-2 cells induced by high glucose by Western blot (n=3)

與CON比較,###P<0.001;與HG比較,**P<0.01圖5 Western blot法檢測槐杞黃對AKT/GSK3β信號通路的影響 (n=3)Figure 5 Effects of HQH on AKT/GSK3β signaling pathway by Western blot (n=3)

先前的研究指出,槐杞黃對腎臟疾病甚至多種癌癥都有輔助治療作用,其具體機制可能涉及氧化應(yīng)激、免疫、自噬、凋亡、鐵死亡和焦亡等[20,21]。在本研究中,高糖環(huán)境下HK-2細胞存活率顯著下降,細胞受到生長抑制。細胞內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)的增加導(dǎo)致細胞內(nèi)產(chǎn)生大量的ROS,破壞細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)平衡。實時熒光定量PCR結(jié)果顯示,高糖組腎小管損傷標記物(KIM-1)、中性粒細胞相關(guān)載脂蛋白(NGAL)mRNA表達水平增加,槐杞黃干預(yù)減輕了高糖對HK-2細胞存活率的抑制作用及其對腎小管的損害程度,以上結(jié)果說明槐杞黃對高糖誘導(dǎo)HK-2細胞損傷有明顯改善作用。

來自體外和體內(nèi)的大量數(shù)據(jù)表明,氧化應(yīng)激與DKD的發(fā)病機制有關(guān),抗氧化應(yīng)激可能為預(yù)防和治療糖尿病誘導(dǎo)的腎損傷提供新的治療思路[22,23]。SOD是在各種器官中提供針對氧化應(yīng)激的第一線酶促抗氧化防御的最重要的保護酶,MDA是膜脂質(zhì)過氧化的終產(chǎn)物之一[24],已有研究表明腎損傷中SOD活性降低,MDA含量增加[25]。而本研究也通過對SOD活性和MDA水平的檢測,發(fā)現(xiàn)高糖能夠增加MDA含量,并減少SOD活性,引起細胞氧化損傷;而用槐杞黃藥物進行干預(yù)后,受損的細胞內(nèi)MDA含量降低,SOD活性升高。這些數(shù)據(jù)證實了槐杞黃可以通過提高HK-2細胞中SOD活性,抑制MDA含量,從而抑制高糖誘導(dǎo)的HK-2細胞氧化應(yīng)激損傷。

以往的研究已經(jīng)證實細胞凋亡在高血糖刺激后腎臟結(jié)構(gòu)和功能損傷中起著至關(guān)重要的作用,但這種損傷和功能障礙的潛在機制尚未得到很好的解釋[26]。為探討槐杞黃對糖尿病腎病的保護作用及其減輕腎臟損害的具體作用機制,本研究采用免疫印跡法檢測HK-2細胞中凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2和cleaved-Caspase-3的表達。發(fā)現(xiàn)與對照組比較,高糖對HK-2細胞中Bcl-2蛋白表達水平具有顯著抑制作用,對Bax和cleaved-Caspase-3蛋白水平具有明顯的促進作用;而槐杞黃干預(yù)顯著提高了Bcl-2蛋白的表達,并降低了Bax和cleaved-Caspase-3蛋白的表達。這表明槐杞黃能夠抑制高糖誘導(dǎo)的HK-2細胞凋亡。AKT信號通路已被證實參與糖尿病腎病的發(fā)病機制。AKT磷酸化可以改善糖尿病動物的抗凋亡和抗氧化能力,但AKT磷酸化也可以被氧化應(yīng)激抑制[27]。當(dāng)AKT磷酸化降低時,其下游因子GSK-3β磷酸化被激活,其他凋亡相關(guān)因子如Bax和cleaved-Caspase-3表達增加[28]。為進一步驗證槐杞黃對高糖誘導(dǎo)的HK-2細胞保護作用機制,我們又檢測了AKT及其下游GSK3β的蛋白的表達水平,通過Western blot檢測發(fā)現(xiàn)在高糖處理下,HK-2細胞中p-AKT表達降低,p-GSK-3β表達升高,高糖誘導(dǎo)HK-2細胞GSK-3β磷酸化水平增加,說明GSK-3β在高糖誘導(dǎo)的HK 2細胞中活性受到了抑制。而經(jīng)槐杞黃處理后,p-AKT蛋白的表達顯著提高,并p-GSK-3β蛋白的表達降低。上述結(jié)果揭示了槐杞黃治療糖尿病腎病的分子機制,表明槐杞黃可能是通過激活A(yù)KT信號通路并抑制GSK3β磷酸化來調(diào)控細胞的氧化應(yīng)激反應(yīng)和凋亡過程。

綜上所述,槐杞黃具有良好的抗氧化功能,并能夠抑制高糖誘導(dǎo)的HK-2細胞凋亡,其機制可能與調(diào)控AKT/GSK3β信號通路有關(guān)。本研究局限于體外細胞水平,后續(xù)還需在體內(nèi)實驗深入研究HQH延緩糖尿病腎病的進展與氧化應(yīng)激和凋亡的關(guān)系,以及其影響AKT/GSK3β信號通路的具體機制。