成翕悅,李丹丹,崔 如,靖博雅,曹 巖,趙 晶,劉俊川

(1河北醫(yī)科大學第三醫(yī)院全科醫(yī)學科,石家莊 050051;2河北醫(yī)科大學第三醫(yī)院友誼院區(qū)骨一科;*通訊作者,E-mail：liujunchuansy@163.com)

骨質疏松癥是一種以骨微結構破壞和骨質流失為特征的常見骨科疾病[1]。隨著骨質量的下降,骨的微觀結構被破壞;隨著時間的推移,骨骼變得非常脆弱,最終,在最小的外力下就會發(fā)生骨折[2]。骨質疏松性骨折康復期長,復發(fā)率高,已成為嚴重的公共衛(wèi)生問題[3]。治療骨質疏松性骨折的傳統(tǒng)臨床方法包括雌激素和雙磷酸鹽的應用,然而,這兩種藥物會引起的一些副作用,如骨痂重塑延遲和癌癥等[4]。因此,開發(fā)高效且副作用小的藥物對于骨質疏松性骨折愈合具有重要的意義。冬凌草甲素是一種從冬凌草中提取的四環(huán)二萜類化合物,具有抗炎、抗癌等作用[5]。已有研究報道,冬凌草甲素可改善骨質疏松小鼠骨礦物質密度和骨組織形態(tài)[6]。但關于冬凌草甲素對骨質疏松性骨折的影響鮮有報道。相關研究顯示,激活聲波刺猬(sonic hedgehog,Shh)/Gli家族鋅指蛋白1(Gli family zinc finger protein 1,Gli1)通路以促進骨形成,抑制骨吸收,可起到防止骨質疏松癥的作用[7]。但冬凌草甲素能否通過調控Shh/Gli1信號通路影響骨質疏松大鼠骨折愈合尚不明確。因此,本研究主要探究冬凌草甲素對骨質疏松大鼠骨折愈合的影響以及其作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物

72只7周齡、體質量為200～210 g的SPF級雌性SD大鼠購自上海泰楚生物技術有限公司,許可證號：SCXK(滬)2023-0001。本研究獲得本院動物倫理委員會(KSD2023-043-1)的批準,所有動物實驗均符合3R原則。

1.2 主要試劑

冬凌草甲素購自武漢遠啟醫(yī)藥化工有限公司;戊酸雌二醇購自武漢東康源科技有限公司;Shh/Gli1信號通路抑制劑環(huán)巴胺購自艾美捷科技有限公司;大鼠腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白細胞介素6(interleukin-6,IL-6)ELISA試劑盒購自上海雙贏生物科技有限公司;兔源一抗堿性磷酸酶(alkaline phosphatase?,ALP)、Runt相關轉錄因子2(Runt related transcription factor 2,Runx2)、Shh、Gli1、GAPDH及辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)標記的山羊抗兔二抗均購自英國Abcam公司。

1.3 骨質疏松性骨折大鼠模型的構建

腹腔注射2%戊巴比妥鈉麻醉大鼠,俯臥位固定、皮膚消毒后,在背部正中行縱切口,分離并切除后腹膜外雙側卵巢,縫合切口。通過檢測骨密度篩選骨質疏松大鼠。骨質疏松大鼠造模成功率為100%。術后1周后進行右側股骨干骨折髓內固定術,簡言之,麻醉大鼠,在大鼠右大腿外側行縱行切口,分離并鋸斷股骨中段,將克氏針固定在髓腔內,縫合傷口,以構建骨質疏松性骨折大鼠模型[8]。

1.4 動物分組及給藥

按照隨機數(shù)字表法將72只大鼠隨機分為對照組、模型組、冬凌草甲素低劑量組、冬凌草甲素高劑量組、戊酸雌二醇組、冬凌草甲素高劑量+環(huán)巴胺組,每組12只。對照組大鼠僅切除卵巢周圍部分脂肪組織,不切除雙側卵巢,術后1周后行右側股骨干骨折髓內固定術。其余各組大鼠均采用雙側卵巢切除術聯(lián)合右側股骨干骨折髓內固定術的方法構建骨質疏松性骨折大鼠模型。建模成功24 h后,進行給藥處理,冬凌草甲素低劑量組、冬凌草甲素高劑量組、戊酸雌二醇組大鼠分別需灌胃2.2 mg/kg冬凌草甲素、6.66 mg/kg冬凌草甲素[9]、9 mg/kg戊酸雌二醇[10],且均需腹腔注射等體積的生理鹽水;冬凌草甲素高劑量+環(huán)巴胺組大鼠需灌胃6.66 mg/kg冬凌草甲素且還需腹腔注射3.33 mg/kg環(huán)巴胺[11];對照組、模型組大鼠均需灌胃且腹腔注射等量的生理鹽水,給藥1次/d,持續(xù)4周。

1.5 標本收集

末次處理24 h后,每組選取全部大鼠,2%戊巴比妥鈉麻醉所有大鼠以進行X射線檢測評估大鼠骨折愈合情況;然后收集大鼠的腹主動脈血經(jīng)離心得血清用于ELISA實驗;血液收集完成后,處死大鼠,分離并收集大鼠完整的右股骨,分為兩部分,每部分包含6只大鼠的股骨,一部分用于三點彎曲實驗,三點彎曲實驗結束后,取股骨骨痂組織凍存于-80 ℃用于Western blot實驗;另一部分用于雙能X線骨密度掃描儀檢測,骨密度檢測結束后,截取股骨骨痂組織用于HE-阿爾新藍染色。

1.6 X射線檢測評估大鼠骨折愈合

利用X射線照射大鼠右側股骨骨折處以評估大鼠骨折愈合情況。

1.7 ELISA法檢測大鼠血清中TNF-α、IL-6水平

嚴格按照ELISA試劑盒說明書檢測大鼠血清中TNF-α、IL-6水平。

1.8 三點彎曲實驗檢測大鼠股骨最大載荷、最大位移

固定大鼠完整的右股骨,使用力學測試裝置進行三點彎曲實驗[12],參數(shù)設置為：支點跨距20 mm,加載速度2 mm/min,施加壓力直至骨頭斷裂,最后通過計算機計算最大載荷、最大位移。

1.9 雙能X線骨密度掃描儀檢測大鼠股骨骨密度

利用雙能X線骨密度掃描儀檢測大鼠股骨骨密度。

1.10 HE染色檢測大鼠骨痂組織病理變化

截取股骨骨痂組織,浸入20%乙二胺四乙酸溶液中進行脫鈣處理。將脫鈣樣品包埋在石蠟中,切成厚度為5 μm的切片,并用HE-阿爾新藍染色。使用光學顯微鏡對股骨骨痂組織的染色切片進行組織學評估。

1.11 Western blot檢測大鼠骨痂組織中ALP、Runx2、Shh、Gli1蛋白表達

利用RIPA裂解緩沖液提取大鼠骨痂組織總蛋白。將蛋白進行定量、電泳、轉膜、封閉后,將膜與一抗ALP(1∶4 000)、Runx2(1∶4 000)、Shh(1∶3 000)、Gli1(1∶3 000)、GAPDH(1∶3 000)在4 ℃下孵育過夜。再將膜與二抗(1∶2 000)共同孵育1 h。加入ECL試劑可視化蛋白,利用Image J軟件評估目的蛋白灰度值。

1.12 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 冬凌草甲素對大鼠骨折愈合的影響

對照組大鼠骨折端有連續(xù)性骨痂生長,骨折線消失;模型組大鼠骨折端未見骨痂生長,骨折線清晰可見;與模型組比較,冬凌草甲素低劑量組、冬凌草甲素高劑量組、戊酸雌二醇組大鼠骨折端可見骨痂生長,骨折線模糊不清;與冬凌草甲素高劑量組比較,冬凌草甲素高劑量+環(huán)巴胺組大鼠骨折端骨痂生長較少,骨折線較清晰(見圖1)。

圖1 大鼠股骨骨折X線表現(xiàn)Figure 1 X-ray of femoral fracture in rats

2.2 冬凌草甲素對大鼠血清中TNF-α和IL-6水平變化的影響

與對照組比較,模型組大鼠血清中TNF-α和IL-6水平升高(P<0.05);與模型組比較,冬凌草甲素低劑量組、冬凌草甲素高劑量組和戊酸雌二醇組大鼠血清中TNF-α和IL-6水平降低(P<0.05);冬凌草甲素高劑量組和戊酸雌二醇組大鼠血清中TNF-α和IL-6水平變化差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05);與冬凌草甲素高劑量組比較,冬凌草甲素高劑量+環(huán)巴胺組大鼠血清中TNF-α和IL-6水平升高(P<0.05,見表1)。

表1 各組大鼠血清中TNF-α和IL-6水平變化比較n=12,ng/L)

2.3 冬凌草甲素對大鼠股骨最大載荷和最大位移的影響

與對照組比較,模型組大鼠股骨最大載荷和最大位移降低(P<0.05);與模型組比較,冬凌草甲素低劑量組、冬凌草甲素高劑量組和戊酸雌二醇組大鼠股骨最大載荷和最大位移升高(P<0.05);冬凌草甲素高劑量組與戊酸雌二醇組大鼠股骨最大載荷和最大位移變化差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05);與冬凌草甲素高劑量組比較,冬凌草甲素高劑量+環(huán)巴胺組大鼠股骨最大載荷和最大位移降低(P<0.05,見表2)。

表2 各組大鼠股骨最大載荷和最大位移變化比較n=6)

2.4 冬凌草甲素對大鼠股骨骨密度的影響

與對照組比較,模型組大鼠股骨的骨密度降低(P<0.05);與模型組比較,冬凌草甲素低劑量組、冬凌草甲素高劑量組和戊酸雌二醇組大鼠股骨的骨密度升高(P<0.05);冬凌草甲素高劑量組與戊酸雌二醇組大鼠股骨骨密度的變化差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05);與冬凌草甲素高劑量組比較,冬凌草甲素高劑量+環(huán)巴胺組大鼠股骨的骨密度降低(P<0.05,見表3)。

表3 各組大鼠股骨的骨密度變化比較

2.5 冬凌草甲素對大鼠骨痂組織病理變化的影響

對照組大鼠骨小梁排列整齊,結構完整;模型組大鼠骨小梁結構紊亂,間隙大,數(shù)量少且形態(tài)較細,血腫尚未完全機化;與模型組比較,冬凌草甲素低劑量組、冬凌草甲素高劑量組和戊酸雌二醇組大鼠骨小梁排列較密集,間隙小,數(shù)量多且較粗;與冬凌草甲素高劑量組比較,冬凌草甲素高劑量+環(huán)巴胺組大鼠骨小梁變細,結構疏松(見圖2)。

藍色為血腫部分;黑色箭頭指示為骨小梁圖2 HE-阿爾新藍染色檢測大鼠骨痂組織病理變化 (×200)Figure 2 Pathological changes of rat callus by HE-Alcianblue staining (×200)

2.6 冬凌草甲素對大鼠骨痂組織中成骨關鍵蛋白及Shh/Gli1信號通路相關蛋白表達的影響

與對照組比較,模型組大鼠骨痂組織中ALP、Runx2、Shh和Gli1蛋白表達降低(P<0.05);與模型組比較,冬凌草甲素低劑量組、冬凌草甲素高劑量組和戊酸雌二醇組大鼠骨痂組織中ALP、Runx2、Shh和Gli1蛋白表達升高(P<0.05);冬凌草甲素高劑量組與戊酸雌二醇組hesi大鼠骨痂組織中ALP、Runx2、Shh和Gli1蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05);與冬凌草甲素高劑量組比較,冬凌草甲素高劑量+環(huán)巴胺組大鼠骨痂組織中ALP、Runx2、Shh和Gli1蛋白表達降低(P<0.05,見圖3和表4)。

圖3 Western blot檢測各組大鼠骨痂組織中ALP、Runx2、Shh、Gli1蛋白表達Figure 3 Expressions of ALP, Runx2, Shh and Gli1 proteins in callus tissue of rats in each group by Western blot

表4 各組大鼠骨痂組織中ALP、Runx2、Shh、Gli1蛋白表達比較

3 討論

骨質疏松性骨折是骨質疏松癥最嚴重的并發(fā)癥,其發(fā)病率和死亡率高,嚴重影響中老年人的健康和生活質量[13]。骨折愈合是一個復雜的動態(tài)過程,主要受力學穩(wěn)定性和骨折區(qū)周圍微環(huán)境的影響[14]。骨折部位的局部骨折微環(huán)境富含多種細胞、細胞因子和生長因子,這是骨和軟組織修復所必需的[15]。當骨折微環(huán)境的內穩(wěn)態(tài)被破壞時,如TNF-α和IL-6過度積累引起的炎癥反應,可導致骨折愈合延遲甚至骨不愈合[16,17]。因此,通過抑制TNF-α和IL-6來緩解炎癥反應對于骨折愈合至關重要。在本項研究中,首先采用雙側卵巢切除術聯(lián)合右側股骨干骨折髓內固定術的方法構建骨質疏松性骨折大鼠模型,結果顯示,與對照組比較,模型組大鼠股骨最大載荷、最大位移、骨密度降低,骨小梁結構紊亂,間隙大,數(shù)量少且形態(tài)較細,骨折端未見骨痂生長,骨折線清晰可見,符合骨質疏松性骨折的病理特征。此外,本研究還發(fā)現(xiàn),與對照組比較,模型組大鼠血清中TNF-α和IL-6水平升高,表明炎癥反應參與了大鼠骨質疏松性骨折過程。另有研究表明,ALP是成骨細胞成熟的標志物,其在骨折中呈下調表達[18];Runx2作為早期成骨細胞轉錄因子,其突變會誘導骨骼發(fā)育異常[19]。因此,本研究檢測了骨痂組織中成骨相關蛋白ALP、Runx2的表達,結果顯示,與對照組比較,模型組大鼠骨痂組織中ALP、Runx2蛋白表達降低,表明骨質疏松性骨折大鼠骨生長受到抑制。因此,減輕炎癥反應、促進骨生長可能成為改善骨質疏松性骨折的有效策略之一。

冬凌草甲素是東亞草藥中常用的二萜類天然產物,因其具有抗腫瘤、抗炎、抗菌、預防肝纖維化等廣泛的生物活性,正日益受到生物醫(yī)學界的關注[20]。據(jù)報道,冬凌草甲素可改善小鼠炎癥誘導的骨質流失[9];冬凌草甲素可在體外水平上促進成骨細胞分化[21];冬凌草甲素能夠有效降低糖皮質激素誘導的大鼠股骨頸骨折風險[22]。本研究結果與其是一致的,本研究顯示,冬凌草甲素可增加骨質疏松性骨折大鼠骨密度,減輕炎癥反應,促進骨生長,進而促進骨折愈合,且冬凌草甲素劑量越高,骨折愈合能力越強。另有研究報道,戊酸雌二醇是臨床上常用于治療骨質疏松性骨折的常用藥物[23],本研究以該藥物為陽性藥物,結果顯示,高劑量冬凌草甲素與戊酸雌二醇對骨質疏松大鼠骨折愈合的促進作用差異無統(tǒng)計學意義,提示冬凌草甲素可能成為治療骨質疏松性骨折的潛在有效藥物之一。

Shh/Gli1信號通路可調節(jié)胚胎發(fā)育的所有階段以及許多組織和器官的產生,該通路的激活可促進骨形成[24]。已有研究報道,激活Shh/Gli1信號通路可改善糖皮質性骨質疏松模型大鼠成骨[25]。本研究顯示,與對照組比較,模型組大鼠骨痂組織中Shh、Gli1蛋白表達降低,大鼠骨質疏松性骨折嚴重,表明Shh/Gli1信號通路的抑制參與了大鼠骨質疏松性骨折過程。此外,本研究還發(fā)現(xiàn),冬凌草甲素可上調骨質疏松性骨折大鼠骨痂組織中Shh、Gli1蛋白表達,且冬凌草甲素劑量越高,上調作用越明顯,推測冬凌草甲素可能通過激活Shh/Gli1信號通路促進骨質疏松大鼠骨折愈合。為了驗證該推測,本研究在高劑量冬凌草甲素作用的基礎上再加上Shh/Gli1信號通路抑制劑環(huán)巴胺來干預骨質疏松性骨折大鼠,結果顯示,環(huán)巴胺減弱了高劑量冬凌草甲素對骨質疏松大鼠骨折愈合的促進作用。證實了猜想的正確性,即冬凌草甲素可能通過激活Shh/Gli1信號通路促進骨質疏松大鼠骨折愈合。此外,有研究顯示,Shh/Gli1信號通路的上調可促進二甲雙胍誘導的人牙周韌帶干細胞成骨,表現(xiàn)為ALP、Runx2表達升高[26];Shh/Gli1信號通路可通過調控TNF-α、IL-6等炎性因子的表達抑制煙霧誘導小鼠的氣道炎癥反應[27]。表明Shh/Gli1信號通路可通過調控ALP、Runx2、TNF-α、IL-6表達影響成骨及炎癥反應。結合本研究結果,提示冬凌草甲素可能通過激活Shh/Gli1信號通路下調TNF-α和IL-6表達抑制炎癥,上調ALP和Runx2表達促進成骨,進而促進骨質疏松大鼠骨折愈合。

綜上所述,冬凌草甲素可能通過激活Shh/Gli1信號通路促進骨質疏松大鼠骨折愈合。冬凌草甲素促進骨質疏松大鼠骨折愈合的機制較為復雜,具體通過Shh/Gli1信號通路下游的哪些蛋白來發(fā)揮作用有待后續(xù)實驗進一步探究。