曾 余,周子靖,陳月華,韋 懿,胡 勤

四川省自貢市婦幼保健院檢驗(yàn)科,四川自貢 643000

不良孕產(chǎn)史通常是指因夫妻雙方或者胚胎染色體異常、內(nèi)分泌系統(tǒng)異常、風(fēng)濕免疫系統(tǒng)異常等出現(xiàn)有大于或等于3次自然流產(chǎn)、稽留流產(chǎn)或者終止妊娠的情況,發(fā)生率為10%～20%[1],遺傳因素已被證實(shí)是導(dǎo)致不良孕產(chǎn)史的重要病因之一[2]。不孕癥的定義是至少一年的無保護(hù)性交后無法懷孕。世界衛(wèi)生組織調(diào)查結(jié)果顯示,15%的夫婦無法受孕,其中約20%僅由男性因素引起,30%～40%的不孕癥是由男性和女性因素共同引起的[3]。目前核型檢測是查找不良孕產(chǎn)史和不孕不育原因的重要工具,該技術(shù)可以為患者提供遺傳咨詢和適合其自身的治療方式[4]。本文就近8年在本院遺傳生殖中心就診的患者染色體核型進(jìn)行不良孕產(chǎn)史和不孕不育遺傳因素方面的分析,并分析自貢地區(qū)不孕不育、不良孕產(chǎn)史患者的染色體異常分布特征,旨在為本地區(qū)不孕不育、不良孕產(chǎn)史患者的診斷、治療及輔助生殖提供有力的實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2014年1月至2022年12月至本院遺傳生殖中心進(jìn)行遺傳咨詢的不孕不育及不良孕產(chǎn)史患者作為研究對象。納入標(biāo)準(zhǔn):(1)夫妻雙方正常未避孕性生活1年未懷孕者;(2)生殖器官正常者;(3)有不良孕產(chǎn)史需查找原因者。排除標(biāo)準(zhǔn):不愿接受研究者。研究對象共4 059例,其中男1 993例、年齡(31.40±5.78)歲,女2 066例、年齡(29.58±5.29)歲。咨詢原因包括自然流產(chǎn)、死胎、胚胎停育、少弱精子或無精子癥、智力低下、第二性征異常、先天性畸形等不良孕產(chǎn)史及不孕不育史。本研究獲得本院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)[審批號:2020倫審批第(1)號],所有患者均簽署知情同意書。

1.2方法 采用無菌采血技術(shù)采集患者靜脈血2.5 mL于肝素抗凝管中,顛倒混勻。細(xì)胞生長培養(yǎng)液解凍后加入適量植物凝集素(PHA),將外周血接種于淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基中刺激細(xì)胞生長,在5%CO2,37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h,制片前3 h加入10 μg/mL秋水仙素50 μL,離心收集細(xì)胞,KCl低滲處理后固定,滴片染色,G顯帶水平300～400條帶,核型分析按照人類細(xì)胞遺傳學(xué)國際命名體制ICSN(2020)命名。根據(jù)染色體大小遞減的順序和著絲粒的位置,可將所有染色體分為7組(A～G)組,A組為1～3號染色體,B組為45號染色體,C組為6～12號以及X染色體,D組為13～15號染色體,E組為16～18號染色體,F組為19～20號染色體,G組為21～22號以及Y染色體。每份標(biāo)本計(jì)數(shù)20個中期分裂相,分析5個核型,染色體分辨率均到320條帶水平。

2 結(jié) 果

2.1染色體異常構(gòu)成比 4 059例遺傳咨詢者中共檢出染色體異常590例,檢出率為14.54%。染色體數(shù)目異常44例,占染色體異常的7.46%,檢出率為1.08%;染色體結(jié)構(gòu)異常546例,占染色體異常的92.54%,檢出率為13.45%。其中:多態(tài)性432例,檢出率為10.64%;非多態(tài)性結(jié)構(gòu)異常114例,檢出率為2.81%。見表1。

表1 異常染色體核型分布

2.2染色體數(shù)目異常的分布情況 近8年在遺傳生殖中心進(jìn)行咨詢的患者染色體數(shù)目異常共檢出44例,其中Klinefelter綜合征(47,XXY)25例,占總異常核型的4.24%,檢出率為0.62%;21-三體女性(47,XX,+21)7例,占數(shù)目異常核型的15.91%,檢出率為0.17%;Turner綜合征(45,XO)患者6例,占數(shù)目異常核型的13.64%,檢出率為0.15%;發(fā)現(xiàn)2例marker染色體與1例48,XXYY。見表2。

表2 染色體數(shù)目異常分布(%)

2.3染色體平衡易位的分布情況 4 059例患者中,共檢出染色體平衡易位50例,其中男26例,女24例,占異常核型的8.47%,總檢出率為1.23%。其中羅氏平衡易位18例,非羅氏平衡易位32例,檢出率分別為0.44%和0.79%,非羅氏平衡易位發(fā)生率高于羅氏平衡易位。D組(13/14/15染色體)內(nèi)染色體發(fā)生易位的頻率最高,主要以13和14號染色體羅氏易位為主,其次是A組和C組。見表3。發(fā)生易位的染色體核型見表4。

表3 染色體平衡易位核型分布特點(diǎn)

表4 染色體平衡易位核型(%)

2.4染色體倒位 4 059例患者中檢出56例染色體倒位,占異常核型的9.49%,檢出率為1.38%。其中9號染色體和Y染色體倒位發(fā)生較多,占倒位異常核型的91.07%。男性和女性的倒位檢出率分別為0.86%(35/4 059)和0.52%(21/4 059),男性倒位檢出率高于女性,差異主要在于Y染色體倒位結(jié)構(gòu)異常。見表5。

表5 染色體倒位核型分布特點(diǎn)

2.5染色體多態(tài)性 4 059例患者中檢出染色體多態(tài)性432例,占異常核型的73.22%,檢出率為10.64%。其中Y染色體多態(tài)性發(fā)生最多,占多態(tài)性核型的28.94%,其次是21號染色體、14號染色體和15號染色體,占比分別是15.74%、14.12%和13.43%。見表6。

表6 多態(tài)性核型分布特點(diǎn)

2.6自貢地區(qū)近8年各種染色體異常檢出情況 自貢地區(qū)2021年以前遺傳咨詢患者人數(shù)比較均衡,2022年咨詢?nèi)藬?shù)陡增(因2020年數(shù)據(jù)缺失,并未做相關(guān)統(tǒng)計(jì)),染色體異常檢出例數(shù)與前期比較增加不明顯,染色體多態(tài)性檢出數(shù)與染色體總異常數(shù)走勢一致,染色體數(shù)目異常和結(jié)構(gòu)異常近幾年檢出數(shù)比較均衡。見圖1。

圖1 自貢地區(qū)2014-2022年遺傳咨詢?nèi)舜渭叭旧w異常檢出情況

3 討 論

機(jī)體的正常染色體核型為23對,分為A/B/C/D/E/F/G組。染色體數(shù)目及結(jié)構(gòu)正常是機(jī)體表型及功能正常的基礎(chǔ),染色體的數(shù)目或者結(jié)構(gòu)變異會導(dǎo)致遺傳物質(zhì)的改變,從而錯誤表達(dá),引起相應(yīng)的臨床表現(xiàn)[5]。自然流產(chǎn)、稽留流產(chǎn)、胚胎停育、死胎、不孕不育等都有可能是由于染色體異常導(dǎo)致,本研究對4 059例進(jìn)行遺傳咨詢的不孕不育及不良孕產(chǎn)史患者外周血染色體進(jìn)行核型分析,結(jié)果顯示異常染色體核型檢出率為14.54%(590/4 059);異常染色體核型中,染色體數(shù)目異常44例(7.46%),染色體結(jié)構(gòu)異常546例(92.54%,包含多態(tài)性),其中非羅氏平衡易位32例(5.42%)、羅氏平衡易位18例(3.15%)、倒位56例(9.49%)、缺失/重復(fù)3例(0.51%)、社會性別不符3例(0.51%)、多態(tài)性432例(73.22%)。自貢地區(qū)2021年以前遺傳咨詢患者人數(shù)比較均衡,2022年咨詢?nèi)藬?shù)陡增,染色體異常檢出例數(shù)與前期比較增加不明顯,染色體多態(tài)性檢出數(shù)與染色體總異常數(shù)走勢一致,染色體數(shù)目異常和結(jié)構(gòu)異常近幾年檢出數(shù)較為均衡。

核型可用于檢測染色體異常,最常發(fā)現(xiàn)的是染色體隨體變異,指南將其歸為染色體多態(tài)性。多態(tài)性是指染色體形態(tài)的變化,包括其大小、形狀和數(shù)量的變化,發(fā)生率較高[6]。因此,具有外中心結(jié)構(gòu)且含有大量異染色質(zhì)的Y染色體很可能出現(xiàn)形態(tài)變化[7]。本研究的統(tǒng)計(jì)結(jié)果也符合這一規(guī)律,Y染色體多態(tài)性發(fā)生最多,占多態(tài)性核型的28.94%,其次是21號染色體、14號染色體和15號染色體,占比分別是15.74%、14.12%和13.43%,據(jù)報道,精子的發(fā)生受位于Y染色體上的基因網(wǎng)絡(luò)控制[8]。隨著不孕癥患者數(shù)量的增加,Y染色體多態(tài)性與復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的關(guān)系越來越受到遺傳咨詢和生殖研究的關(guān)注。墨西哥一項(xiàng)針對158對復(fù)發(fā)性流產(chǎn)夫婦的研究發(fā)現(xiàn),25對夫婦(15.82%)在1qh+、9qh+和16qh+染色體發(fā)現(xiàn)多態(tài)性變異,21對夫婦(13.29%)在Yqh+染色體上發(fā)現(xiàn)多態(tài)性變異,12對夫婦(7.59%)在D/G組發(fā)現(xiàn)多態(tài)性變異[9]。這表明染色體多態(tài)性可能在復(fù)發(fā)性流產(chǎn)中起著重要但未知的作用。既往研究發(fā)現(xiàn),26例染色體多態(tài)性同時精液狀態(tài)差的患者中,Yqh+染色體多態(tài)性6例,Yqh-染色體多態(tài)性7例,16qh+染色體多態(tài)性1例,inv(9)染色體多態(tài)性6例[10]。這表明Y染色體的多態(tài)性可能與弱精、少精有關(guān)。雖然目前專家共識認(rèn)為染色體多態(tài)性是染色體上存在的正常差異,不會影響生育,但很多的大數(shù)據(jù)研究發(fā)現(xiàn)不孕不育患者多態(tài)性的發(fā)生率高于健康人群,這值得進(jìn)一步研究。

在分析男性不育癥時,核型是分析原因的有價值的工具。無精子癥男性中最常見的染色體異常是數(shù)目異常,如Klinefelter綜合征(47、XXY)。本次研究共檢出44例染色體數(shù)目異常患者,其中Klinefelter綜合征25例。經(jīng)典的Klinefelter綜合征表現(xiàn)為身材高大,男性乳房發(fā)育,面部和體毛有限,睪丸異常小,無精子癥,代謝評估顯示促卵泡激素(FSH)、促黃體生成素(LH)水平升高,17-酮類固醇和睪酮水平降低[11]。臨床上一般會將精液分析和核型分析同時進(jìn)行,因?yàn)槿旧w異常在男性人群中的發(fā)生率為1/1 000～1/500[12],而無精子癥和嚴(yán)重少精子癥的男性染色體異常發(fā)生率分別為13.7%和4.6%[13]。本研究還發(fā)現(xiàn)1例48,XXYY核型異常,人群中發(fā)生率為1/40 000～1/18 000,臨床表型與Klinefelter綜合征相似。更細(xì)致的研究發(fā)現(xiàn)了男性不育癥相關(guān)的無精子癥區(qū)域AZF,該區(qū)域的缺失占特發(fā)性男性不育癥的1%～18%[14]。AZF檢測可分為AZFa、AZFb、AZFc 3個片段,對AZFa、AZFb、AZFc都缺失患者進(jìn)行精子提取后未發(fā)現(xiàn)精子[15],但AZFc缺失后,精子是有可能恢復(fù)正常的,并且幸運(yùn)的是,AZFc缺失占AZF缺失總數(shù)的60%[16]。

在分析女性不孕癥時,首先考慮激素、子宮及輸卵管因素,同時會排查核型。Turner綜合征(45,XO)又稱為先天性卵巢發(fā)育不全,臨床表現(xiàn)為身材矮小、生殖器與第二性征不發(fā)育,智力發(fā)育程度不同等[17]。Turner綜合征患者一般存在卵巢不發(fā)育或發(fā)育不全,僅8%～10%的患者擁有正常的卵巢,且只有5%～10%的生育率,針對確診較早且有卵子存在的患者,可以通過輔助生殖技術(shù)實(shí)現(xiàn)生育[18]。本研究檢測出Turner綜合征患者6例,占染色體數(shù)目異常的13.64%,檢出率為0.15%。

易位是染色體遺傳物質(zhì)的重新排列,可以是平衡易位或不平衡易位,取決于重新排列后的遺傳物質(zhì)有無增減。平衡易位沒有基因量的改變,因此不會對個體產(chǎn)生影響,但產(chǎn)生非平衡易位配子的風(fēng)險更高,會遺傳給子代[19]。本研究共檢出染色體平衡易位患者50例,其中男26例,女24例,占異常核型的8.47%,總檢出率為1.23%,高于文獻(xiàn)[20-23]報道的一般群體中平衡易位的檢出率(0.08%～0.30%)。其中發(fā)生D組(13/14/15染色體)內(nèi)染色體平衡易位的頻率最高,其次是A組和C組。不平衡易位中,遺傳信息交換不均勻,從而導(dǎo)致基因增加或缺失。如兩例46,XX,+21,der(21;21)(q10;q10)屬于21三體綜合征,但其中兩條21號染色體發(fā)生易位形成1條,使得個體染色體總數(shù)目正常,但基因量多了1條21號染色體,這種情況好發(fā)于平衡易位患者的子代。

綜上所述,自貢地區(qū)因不良孕產(chǎn)史、不孕不育等原因進(jìn)行遺傳咨詢的患者,其重要病因之一是染色體異常,檢出率達(dá)14.54%,高于其他地區(qū),如青海地區(qū)(9.43%)[11],河南南陽地區(qū)(6.44%)[3]。外周血染色體核型作為遺傳咨詢分析的重要檢測方法,可為染色體病的診斷提供依據(jù)。對重點(diǎn)人群進(jìn)行遺傳分析有助于查明病因,指導(dǎo)生育,提高人口質(zhì)量,為本地遺傳咨詢及染色體核型分析提供參考。