丁 麗,陳俏麗,田鵬飛,張旭強,雷志萍

甘肅省蘭州市第二人民醫(yī)院肝病研究所,甘肅蘭州 730046

乙型肝炎是由乙型肝炎病毒(HBV)引起的可導(dǎo)致肝損傷的慢性傳染性疾病。全球約有20億人既往或正在感染HBV,每年約有82萬人死于HBV相關(guān)的肝衰竭、肝硬化和肝癌[1]。我國屬于HBV感染高發(fā)國家,約有2 000萬人為攜帶HBV的慢性乙型肝炎患者[2]。核苷酸類似物(NAs)是治療慢性乙型肝炎患者的主要藥物,且不同基因型患者對NAs的治療應(yīng)答有所差異。相關(guān)研究報道,HBV會產(chǎn)生耐藥突變甚至多重耐藥[3],給臨床治療帶來了困擾。因此,本文采用Sanger測序法就目前甘肅地區(qū)HBV感染者體內(nèi)HBV基因型及耐藥情況進行統(tǒng)計分析,為臨床慢性乙型肝炎患者的個體化治療提供數(shù)據(jù)支持。

1 資料與方法

1.1一般資料 納入2018年1月至2019年8月在本院就診的HBV感染者131例,其中男101例、女30例,年齡15～74歲、平均(45±12)歲。所有患者均符合2015年中華醫(yī)學(xué)會肝病學(xué)分會和中華醫(yī)學(xué)會感染病學(xué)會聯(lián)合修訂的《慢性乙型肝炎防治指南(2015年版)》[4]中的診斷標準,同時排除甲、丙、丁、戊型肝炎病毒感染,排除自身免疫性肝炎、酒精性肝炎、藥物性肝炎等疾病。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審核通過(審批號:lzsdermyyyxllwyh202308)。

1.2儀器與試劑 3500Dx基因分析儀(美國ABI公司)、Eppendorf Centrifuge 5430R 404A離心機、Eppendorf Research plus加樣槍、Life technologies 2720 Thermal Cycler PCR儀。HBV耐藥基因突變檢測試劑盒(中山大學(xué)達安基因股份有限公司)、HBV核酸提取試劑盒(湖南圣湘生物技術(shù)有限公司)、SanPrep柱式PCR產(chǎn)物純化試劑盒(上海生工生物工程股份有限公司)。

1.3方法

1.3.1DNA的提取 嚴格按照圣湘生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品說明書進行操作,取HBV患者分離血清1 mL,采用磁珠法提取患者HBV DNA。

1.3.2PCR測序 按照中山大學(xué)達安基因產(chǎn)品說明書取37 L反應(yīng)液、3 L反應(yīng)酶、10 L核酸產(chǎn)物加入PCR反應(yīng)管中,充分混勻后瞬時離心,上機運行PCR程序;PCR擴增結(jié)束后,按照PCR產(chǎn)物純化試劑盒步驟純化獲得PCR產(chǎn)物,鑒定后立即進行PCR測序;按照1 L PCR純化產(chǎn)物、2 L BigDye、3 L BigDye緩沖液、1 L測序引物、13 L滅菌純化水的比例配制測序PCR體系,混勻后上機運行測序程序。

1.3.3測序產(chǎn)物純化 各PCR反應(yīng)管分別加入2 L 125 mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)、2 L 3mol/L醋酸鈉(pH值5.2)和50 L 100%無水乙醇,短時振蕩,室溫避光放置15 min。4 ℃ 12 000 r/min 離心30 min,去上清液,加入150 L 預(yù)冷70%乙醇,4 ℃ 12 000 r/min離心10 min,立即去上清液,室溫避光放置15～30 min;加入10 L甲酰胺,短時振蕩溶解DNA,短時離心后95 ℃變性5 min,迅速置冰水中冷卻4 min,取樣電泳分析。

1.3.4基因分析儀測序 變性后的測序產(chǎn)物加入與基因分析儀配套的96孔板,蓋好,按加樣順序編輯樣品列表。根據(jù)測序儀型號選用具有IVD標志的測序程序進行測序。

1.3.5結(jié)果分析 測序結(jié)束后運用美國國家生物技術(shù)信息中心網(wǎng)站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/genotyping/formpage.cgi)及生物信息分析云平臺(https://www.celloud.cn/#/app/dashboard/list)進行測序結(jié)果的基因分型和耐藥突變位點分析。常見耐藥突變位點的信息參考《歐洲肝病協(xié)會HBV感染臨床操作指南》及試劑盒說明書。

1.4統(tǒng)計學(xué)處理 采用Excel2010軟件進行統(tǒng)計分析,計數(shù)資料以例數(shù)或百分率表示。

2 結(jié) 果

2.1HBV感染者病毒基因型及耐藥情況 131例乙型肝炎患者中男性占比(77.10%)顯著高于女性(22.90%),40歲以上中老年患者比例(67.18%)高于青年(32.82%)。131例HBV感染者中產(chǎn)生耐藥突變51例,耐藥率為38.93%。此外,共檢測出B、C、D 3種基因型別,其中C型是主要基因型。見表1。

表1 不同基因型突變及耐藥情況

2.2不同基因型耐藥突變模式分析 51例耐藥患者中檢出M204I(10例)、M204V/I(29例)、M204V(10例)、M250V/L/I(10例)、S202G/I(3例)、T184A/G/S/(2例)、A181V/T(17例)、N236T(11例)、L180M(13例)、V173L(2例)及I160T(1例)共11個耐藥突變位點。其中突變頻率最高的位點是M204V/I(29例),這種高頻突變主要引起拉米夫定(LAM)和替比夫定(LDT)耐藥;其次為A181V/T(17例),這種突變主要引起阿德福韋酯(ADV)耐藥。此外,共檢出19種耐藥突變位點組合模式,其中單一位點突變17例(33.33%,17/51),雙位點突變17例(33.33%,17/51),3位點突變12例(23.53%,12/51),4位點及以上突變5例(9.80%,5/51)。多位點突變以M204V/I+M204V聯(lián)合突變多見,常在此基礎(chǔ)上發(fā)生3位點、4位點甚至5位點突變,未檢出與富馬酸替諾福韋酯(TDF)耐藥相關(guān)位點。見表2。

表2 HBV感染者耐藥突變情況(n)

2.3HBV感染者耐藥情況突變位點分析 51例耐藥患者中,耐單藥突變15例,突變率為29.41%(15/51);耐多藥突變36例,突變率為70.59%(36/51)。其中與ADV相關(guān)的A181V/T、N236T、A181V/T+N236T以耐單藥突變最常見,共15例(29.41%,15/51)?；旌贤蛔冎饕訪AM和LDT聯(lián)合耐藥為主(21.57%,11/51),在此基礎(chǔ)上多有ADV(5.88%,3/51)、恩替卡韋(ETV,9.80%,5/51)以及與ADV、ETV聯(lián)合耐藥(5.88%,3/51)發(fā)生。此外,還有LAM和ETV聯(lián)合耐藥(13.72%,7/51),ADV、ETV聯(lián)合耐藥(13.73%,7/51),未檢出TDF耐藥株。見表2。

3 討 論

HBV是嚴重危害人類健康的肝炎病毒之一,NAs能有效抑制HBV DNA復(fù)制,緩解病情,但HBV在慢性持續(xù)感染中可產(chǎn)生自然變異,也會因藥物治療產(chǎn)生誘導(dǎo)變異,從而導(dǎo)致其對抗病毒藥物敏感性降低,難以根除病毒,患者病情反復(fù)發(fā)作,給臨床治療帶來了極大的困擾[5-6]。本研究對甘肅地區(qū)HBV基因分型特征及耐藥突變模式進行分析,對指導(dǎo)臨床用藥具有一定意義。

目前,將HBV分為9個基因型(A～I),另有報道J型HBV[7]。HBV不同基因型呈現(xiàn)不同的地區(qū)分布特點,B型和C型是我國最常見的HBV基因型,約占我國乙型肝炎患者的95%[8]。其中北方以C型多見,南方以B型為主,各省間分布不完全相同[9]。本研究對甘肅地區(qū)131例HBV感染者進行HBV基因型分析,結(jié)果顯示,共檢出B、C、D 3種基因型,C型為主要基因型,這與既往研究結(jié)果一致[10]。

臨床常用的NAs有LAM、LDT、ADV、ETV、TDF這5種[11]。本研究131例患者中共檢出51例耐藥突變,耐藥率達38.93%,耐藥形勢嚴峻,且多發(fā)生聯(lián)合耐藥。混合突變以M204V/I/、L180M、M204V位點及其組合形式突變例數(shù)較多,這3種位點突變導(dǎo)致LAM及LDT耐藥。LAM與LDT是我國較早上市的核苷酸類藥物,雖有一定的抗病毒療效,但耐藥屏障低,長時間服用易導(dǎo)致患者產(chǎn)生耐藥性[12]。單藥耐藥以A181V/T、N236T及其組合形式突變導(dǎo)致的ADV耐藥最為常見,耐藥率為29.41%。部分患者在LAM、LDT及ADV耐藥基礎(chǔ)上發(fā)生M250V/I、T184A/G/S/I、V173L、S202G/I位點突變導(dǎo)致ETV耐藥且耐藥率高,這提示本地區(qū)患者仍大量使用耐藥屏障低的NAs作為初治藥物,會導(dǎo)致ETV類耐藥屏障高的藥物耐藥,應(yīng)減少LAM、ADV、LDT等耐藥屏障低的藥物的使用,首選強效耐藥屏障高的藥物[13]。有研究顯示80%患者在使用LAM、ADV等耐藥屏障低的藥物作為初治藥物是導(dǎo)致我國HBV耐藥率居高不下的重要因素之一[14-15]。TDF耐藥在臨床中少見,這提示TDF在本地乙型肝炎治療中具有廣泛應(yīng)用前景。

慢性乙型肝炎患者需長期服藥,停藥后復(fù)陽率高[16-17]。但由于經(jīng)濟條件差及隨訪制度不健全等因素,我國慢性乙型肝炎患者堅持長期服藥的依從性并不高。有研究顯示,依從性差是導(dǎo)致慢性乙型肝炎抗病毒初級治療失敗的主要原因[18-20]?；颊咦孕型Ｋ幉粌H起不到治療作用,還可能加速HBV耐藥的發(fā)生,甚至使病毒復(fù)制增多,導(dǎo)致病情加重。一旦發(fā)生耐藥,患者須加大藥物劑量或者換藥,從而進一步增加治療成本。隨著NAs納入醫(yī)保及強效低耐藥屏障藥物的應(yīng)用,患者的依從性及耐藥情況都有所改善。

綜上所述,本研究通過對甘肅地區(qū)HBV患者進行基因分型及耐藥突變位點的檢測分析,為制訂患者個體化精準治療方案提供了一定科學(xué)依據(jù),在用藥過程中臨床需加強對患者的監(jiān)測與管理,以免發(fā)生多重耐藥。