向林果,譚憬一,姚 遠(yuǎn),孫雪琴,張陽麗

重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院臨床分子醫(yī)學(xué)檢測中心,重慶 400016

結(jié)直腸癌(CRC)是我國常見的惡性腫瘤之一,其發(fā)病率和病死率分別位于惡性腫瘤的第2位和第5位,且呈逐漸上升趨勢[1]。CRC的發(fā)生、發(fā)展涉及多個(gè)基因和多條細(xì)胞信號傳導(dǎo)通路,是由一系列復(fù)雜的遺傳和表觀遺傳事件逐步累積所致[2-3]。相關(guān)分子標(biāo)志物的檢測不僅可作為CRC篩查的有效補(bǔ)充,還在用藥方案選擇、預(yù)后判斷及療效預(yù)測等方面起到關(guān)鍵作用。

錯(cuò)配修復(fù)(MMR)蛋白、微衛(wèi)星不穩(wěn)定性(MSI)、大鼠肉瘤(RAS)基因和致癌同源體B1(BRAF)基因突變已被公認(rèn)是影響CRC患者個(gè)體化治療策略的主要標(biāo)志物[4]。此前雖有研究報(bào)道了關(guān)于MMR蛋白、MSI、RAS和BRAF基因在CRC患者中的表達(dá)情況,但由于病例納入標(biāo)準(zhǔn)的差異,標(biāo)志物組合不同和臨床資料的覆蓋度不同以及樣本量的限制,研究結(jié)果不盡相同[5-6]。因此,本研究分析了352例CRC患者的病理標(biāo)本和詳細(xì)的臨床資料,旨在更完整地探討MMR蛋白表達(dá)、MSI、RAS(含KRAS和NRAS)基因和BRAF基因突變與各臨床病理特征的關(guān)系,以及RAS和BRAF基因分別與MMR蛋白表達(dá)和MSI的關(guān)系,為CRC患者的個(gè)體化治療提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集本院2022年1-12月352例病理診斷明確、臨床病歷資料完整患者(CRC組)的CRC組織和血液標(biāo)本,以及42例非CRC的其他實(shí)體瘤患者(非CRC組)癌組織和血液標(biāo)本。非CRC的其他實(shí)體瘤包括膽管癌、肝癌、卵巢癌、胰腺癌、肺癌等共計(jì)42例。所有患者未接受放化療、靶向或免疫治療,未合并其他腫瘤?；颊吆图覍賹Ρ敬窝芯烤橥?并簽署知情同意書。本研究通過本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)的審核批準(zhǔn)(倫理審批號:K2023-566號)。CRC組和非CRC組研究對象之間性別、年齡、病理特征等比較,差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),具有可比性。見表1。

表1 兩組患者的臨床及病理特征比較[n(%)]

1.2儀器與試劑 儀器:全自動(dòng)免疫組化染色儀(Dakocytomation)、基因測序儀(ABI 3500Dx)、熒光定量PCR儀(SLAN 96S)、移液器(Eppendorf)、紫外分光光度計(jì)(NanoDrop One)、全自動(dòng)核酸提取儀(奧盛Auto-Pure 32A)、渦旋混勻器(其林貝爾 QB-328)、微型高速離心機(jī)(Mini-15K)、恒溫金屬浴(奧盛 MiniT-H2C)。試劑:友芝友人類KRAS基因7種突變檢測試劑盒、人類NRAS基因突變檢測試劑盒、人類BRAF基因V600E突變檢測試劑盒、新百基FFPE核酸提取或純化試劑盒、桐樹MSI檢測試劑盒、福州邁新抗體。

1.3方法

1.3.1MMR蛋白表達(dá)檢測 使用全自動(dòng)免疫組化染色儀檢測394例癌組織標(biāo)本MMR蛋白(含MSH2、MSH6、MLH1、PMS2)表達(dá)。MSH2、MSH6、MLH1和PMS2四者均表達(dá)為(+)判斷為錯(cuò)配修復(fù)功能完整(pMMR),任意一種表達(dá)為(-)則判為錯(cuò)配功能修復(fù)缺陷(dMMR)。

1.3.2KRAS、NRAS和BRAF基因突變檢測 每個(gè)癌組織標(biāo)本制備3張8 μm厚的石蠟切片用于核酸提取,1張4 μm白片用于HE染色。HE染色后由兩位病理醫(yī)師鏡下閱片標(biāo)識(shí)出腫瘤細(xì)胞比例>20%的區(qū)域。于HE染色片腫瘤富集區(qū)域刮取3張白片對應(yīng)區(qū)域組織用于DNA提取。采用全自動(dòng)核酸提取儀進(jìn)行DNA提取并采用紫外分光光度計(jì)測得DNA標(biāo)本的濃度和純度。采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)檢測標(biāo)本DNA中KRAS基因第2外顯子,NRAS基因第2、3、4號外顯子,BRAF基因第15號外顯子的熱點(diǎn)突變。DNA標(biāo)本的提取、稀釋、加樣、擴(kuò)增程序和結(jié)果判讀均嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.3.3MSI檢測 采用一代測序片段分析法(熒光PCR-毛細(xì)管電泳法),使用MSI檢測試劑盒對所有患者腫瘤組織和血液標(biāo)本進(jìn)行MSI檢測。試劑盒覆蓋5個(gè)MS位點(diǎn)(BAT-25、BAT-26、D5S346、D2S123、D17S250)。結(jié)果判定:≥2個(gè)MS位點(diǎn)不穩(wěn)定為高度微衛(wèi)星不穩(wěn)定(MSI-H);1個(gè)MS位點(diǎn)不穩(wěn)定為低度微衛(wèi)星不穩(wěn)定(MSI-L);若5個(gè)MS位點(diǎn)均穩(wěn)定,則為微衛(wèi)星穩(wěn)定(MSS)。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS25.0統(tǒng)計(jì)軟件處理和分析數(shù)據(jù)。計(jì)數(shù)資料采用例數(shù)或百分率表示,突變狀態(tài)及臨床特征單因素分析采用χ2檢驗(yàn),當(dāng)理論數(shù)1≤T<5時(shí)用連續(xù)性校正χ2檢驗(yàn);當(dāng)T<1或n≤40時(shí),用Fisher確切概率法;多因素Logistic回歸分析基于單因素分析結(jié)果。采用一致性檢驗(yàn)(Kappa值)統(tǒng)計(jì)分析免疫組化法檢測MMR蛋白和熒光PCR-毛細(xì)管電泳法檢測MSI結(jié)果的一致性程度:Kappa值<0表示極差;0～0.2表示微弱;>0.2～0.4表示弱;>0.4～0.6表示中度;>0.6～0.8表示高度;>0.8～1.0表示極強(qiáng)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1MMR蛋白表達(dá),MSI,KRAS、NRAS、BRAF基因突變情況 352例CRC患者中dMMR檢出率為8.2%,4種MMR蛋白(MSH2、MSH6、MLH1、PMS2)的缺陷檢出率分別為0.9%、1.7%、4.5%和6.8%。MSI-H檢出26例,MSI-L檢出3例,MSS共323例。

KRAS、NRAS、BRAF基因突變率依次為45.7%、3.7%、3.1%;NRAS基因只檢出G12D和Q61R位點(diǎn)突變,未發(fā)現(xiàn)KRAS、NRAS、BRAF基因之間存在交叉突變。42例非CRC的腫瘤患者dMMR檢出率、MSI-H檢出率、KRAS和NRAS基因突變率依次為2.4%、4.8%、23.8%、2.4%,未檢出BRAF基因突變。與非CRC組相比,CRC組的KRAS基因突變率顯著升高(P<0.05),兩組MMR蛋白表達(dá),MSI、NRAS和BRAF基因突變情況比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 dMMR,MSI-H以及KRAS、NRAS、BRAF常見基因突變類型分析[n(%)]

2.2不同臨床病理特征CRC癌組織中MMR蛋白表達(dá),MSI,KRAS、NRAS、BRAF基因突變狀態(tài) 352例CRC患者的5種分子標(biāo)志物與臨床病理特征關(guān)系的分析結(jié)果顯示:年齡≤50歲、黏液腺癌、原發(fā)于右半結(jié)腸的患者dMMR檢出率更高(P<0.05);MSI-H多見于年齡≤50歲、有腫瘤家族史、黏液腺癌、原發(fā)于右半結(jié)腸、TNM分期Ⅰ+Ⅱ期、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者(P<0.05)。KRAS基因高突變率的臨床特征表現(xiàn)為女性、無吸煙史、黏液腺癌(P<0.05);NRAS基因僅在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者中突變率升高(P<0.05);BRAF基因突變率在低分化和原發(fā)于右半結(jié)腸的患者中更高(P<0.05)。見表3。

將單因素分析中差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的變量納入多因素Logistic回歸模型。由于在單因素分析中只有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與NRAS基因突變有關(guān),因此在多因素分析中排除了NRAS基因突變。多因素Logistic回歸分析結(jié)果顯示,黏液腺癌患者更易發(fā)生KRAS基因突變(P<0.05);低齡、有腫瘤家族史的右半結(jié)腸癌患者更易表現(xiàn)出MSI-H(P<0.05);dMMR和BRAF基因突變多因素分析結(jié)果與單因素分析一致。見表4。

表4 影響MMR蛋白表達(dá),MSI,KRAS、BRAF基因突變的多因素分析

2.3不同MMR蛋白表達(dá)和MSI狀態(tài)下RAS和BRAF基因突變情況 352例CRC患者中,KRAS、BRAF基因突變與dMMR有關(guān),與pMMR患者相比,dMMR患者KRAS基因突變率降低而BRAF突變率顯著升高(P<0.05)。MSI-H的患者同樣具有更高的BRAF基因突變率(P<0.05),而KRAS和NRAS基因突變率與MSI狀態(tài)無關(guān)(P>0.05)。見表5。

表5 不同MMR蛋白表達(dá)和MSI狀態(tài)下RAS和BRAF基因突變情況分析[n(%)]

2.4MMR蛋白檢測與MSI檢測一致性分析 將MSS和MSI-L劃為一組,dMMR對應(yīng)MSI-H,pMMR對應(yīng)MSS或MSI-L,分析免疫組化法檢測MMR和熒光PCR-毛細(xì)管電泳法檢測MSI結(jié)果的一致性。兩組共394份標(biāo)本中,MMR蛋白檢測和MSI檢測結(jié)果相符的共有378例,總體相符率為95.9%,Kappa一致性檢驗(yàn)結(jié)果表明,兩種檢測方法檢測結(jié)果高度一致(Kappa=0.702,P<0.001)。結(jié)果不一致標(biāo)本中有9例免疫組化檢測為dMMR,PCR-毛細(xì)管電泳結(jié)果為MSS;7例PCR-毛細(xì)管電泳結(jié)果為MSI-H,免疫組化顯示pMMR。

3 討 論

MMR基因的主要功能是修復(fù)DNA復(fù)制和重組過程中的堿基錯(cuò)配,以確?；蚪Y(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性,其編碼的最重要的蛋白家族包括MSH2、MSH6、MLH1和PMS2。dMMR可引起微衛(wèi)星復(fù)制錯(cuò)誤、不能被修復(fù),導(dǎo)致微衛(wèi)星長度改變,從而表現(xiàn)為MSI。既往研究已經(jīng)證實(shí),MMR基因突變或高甲基化和MSI不僅是林奇綜合征的主要原因,也是CRC的重要發(fā)病機(jī)制之一[2,7]。本研究顯示,dMMR在CRC患者中的檢出率為8.2%,與之前報(bào)道3%～13%的亞洲CRC患者表現(xiàn)出dMMR狀態(tài)的結(jié)果相符[8];MSI-H檢出率為7.4%,略低于dMMR檢出率。在本研究中,與dMMR和MSI-H高檢出率有關(guān)的共同臨床病理因素為低齡和原發(fā)部位為右半結(jié)腸癌,表明dMMR和MSI-H與CRC疾病早發(fā)性和原發(fā)部位有關(guān)。也有研究報(bào)道,TNM分期為Ⅰ～Ⅱ期的無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的CRC患者中MSI-H的發(fā)生率較高[9-10],這與本研究中MSI的單因素分析結(jié)論相符。但在多因素Logistic回歸分析中,與MSI相關(guān)因素排除了病理學(xué)類型、分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移,顯示有腫瘤家族史的患者更容易發(fā)生MSI-H,黏液腺癌更容易發(fā)生dMMR。

既往研究發(fā)現(xiàn),dMMR或MSI-H的CRC患者中BRAF V600E突變和MLH1啟動(dòng)子甲基化與散發(fā)性CRC密切相關(guān)[11-12]。本研究顯示,BRAF V600E突變與dMMR和MSI-H密切相關(guān),其突變率在dMMR和MSI-H患者中明顯高于pMMR和非MSI-H(MSS和MSI-L)患者。因此,當(dāng)CRC患者單獨(dú)檢測到MSI-H或MLH1缺失時(shí),有必要進(jìn)行BRAF基因突變和(或)MLH1啟動(dòng)子甲基化的后續(xù)檢測,如有BRAF V600E突變則不能確診為林奇綜合征。有報(bào)道指出,在dMMR或MSI-H的轉(zhuǎn)移性CRC患者中,若存在BRAF基因突變則提示生存率更差,而RAS基因突變可能與生存率無關(guān)[13]。

盡管MMR蛋白表達(dá)和MSI反映的是同一生物學(xué)事件,但本研究中MMR蛋白表達(dá)和MSI與臨床病理特征的關(guān)系仍存在略微不同,這可能是由于兩種標(biāo)志物檢測結(jié)果不完全一致所致。同一標(biāo)本出現(xiàn)免疫組化結(jié)果為pMMR而熒光PCR-毛細(xì)管電泳法結(jié)果為MSI-H這種情況的原因:一方面可能是MMR蛋白的基因發(fā)生變異,這些變異雖不影響蛋白的抗原結(jié)構(gòu),但卻能影響其MMR功能,導(dǎo)致微衛(wèi)星位點(diǎn)MMR失敗;另一方面可能是其他MMR蛋白(除外MSH2、MSH6、MLH1和PMS2這4種主要的MMR蛋白)的缺失亦會(huì)影響微衛(wèi)星的穩(wěn)定性,表現(xiàn)出pMMR而微衛(wèi)星不穩(wěn)定[14]。當(dāng)然,由于MMR蛋白之間存在功能重復(fù)(PMS2和PMS1、MSH6和MSH3),當(dāng)孤立性的MSH6缺失時(shí),MSH3可以功能性替代部分MSH6,活化MMR系統(tǒng)而繼續(xù)保留MSS狀態(tài),從而表現(xiàn)為dMMR而MSS[14]。此外,免疫組化法依賴于染色過程,染色質(zhì)量不佳會(huì)影響結(jié)果準(zhǔn)確判讀,同一份標(biāo)本不同的切取角度也有可能造成兩種檢測結(jié)果不一致。因此,為提高檢測準(zhǔn)確性,不管是在林奇綜合征的篩查時(shí),還是CRC患者治療指導(dǎo)時(shí),建議進(jìn)行MMR蛋白和MSI聯(lián)合檢測,相互補(bǔ)充。

表皮生長因子受體(EGFR)是臨床上治療CRC的主要靶點(diǎn)之一。KRAS、NRAS和BRAF基因是EGFR依賴的下游絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路中的3個(gè)關(guān)鍵分子,這些基因的突變可導(dǎo)致MAPK通路的激活,促進(jìn)大多數(shù)癌細(xì)胞增殖和抗凋亡,使EGFR受體抑制劑無效。臨床研究表明,MSS、RAS和BRAF基因野生型的轉(zhuǎn)移性CRC患者能從抗EGFR單抗治療中獲益[15]。本研究中KRAS基因第2外顯子突變率為45.7%,與文獻(xiàn)[16]報(bào)道結(jié)果相近。在單因素分析中,與KRAS基因突變有關(guān)的臨床病理參數(shù)為女性、黏液腺癌和無吸煙史,但多因素Logistic回歸分析顯示,僅黏液腺癌是KRAS基因突變的獨(dú)立影響因素。已有研究報(bào)道,由于CRC中KRAS等位基因的多樣性,不同KRAS基因突變可能具有不同的預(yù)后,但導(dǎo)致預(yù)后不同的原因尚不清楚。其中KRAS基因第2外顯子12號密碼子G12C已被證明與較差的總生存率相關(guān)[17-18]。NRAS基因突變較少發(fā)生,本研究中CRC組NRAS基因突變檢出率為3.7%,有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者NRAS基因突變率高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者(P=0.010),有腫瘤家族史和MSI-H的CRC患者未檢測出NRAS基因突變。筆者推測NRAS突變可能與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤家族史及MSI有一定關(guān)系,但因本次NRAS基因突變例數(shù)較少,有待增加病例數(shù)進(jìn)一步分析證實(shí)。

BRAF基因編碼一種RAF激酶蛋白,參與調(diào)控細(xì)胞生長、增殖、分化和凋亡等過程,其突變狀態(tài)與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和臨床預(yù)后相關(guān)。BRAF基因V600E突變往往被認(rèn)為是腫瘤侵襲性的標(biāo)志,與BRAF野生型相比,它是轉(zhuǎn)移性CRC患者預(yù)后不良和總生存期更短的危險(xiǎn)因素[19]。本研究中,CRC組BRAF基因V600E突變率為3.1%,低于西方人群8%～12%的突變率[20],但與之前報(bào)道的中國CRC患者BRAF基因突變率相當(dāng)[21],進(jìn)一步證實(shí)CRC患者BRAF基因突變在中國和西方人群存在種族差異。本研究顯示BRAF基因在低分化、原發(fā)于右半結(jié)腸的患者中突變率高,但未發(fā)現(xiàn)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等其他不良預(yù)后的臨床病理特征有關(guān)。BRAF和RAS基因同處于RAS-RAF-MAPK通路,突變結(jié)果相互排斥,本研究未發(fā)現(xiàn)RAS和BRAF基因同時(shí)發(fā)生突變。

毋庸置疑,MMR蛋白,MSI,以及KRAS、NRAS、BRAF基因已經(jīng)成為需要新輔助治療和轉(zhuǎn)移性CRC腫瘤患者的常規(guī)檢測項(xiàng)目[4]。隨著分子診斷技術(shù)的飛速發(fā)展,適用于腫瘤早篩早診的分子標(biāo)志物也得到越來越多的關(guān)注和重視。硫酸類肝素蛋白多糖2(SDC2)、隔膜蛋白9(SEPT9)、組織因子通路抑制因子2(TFPI2)基因被認(rèn)為是潛在的CRC早篩分子標(biāo)志物,特別是糞便標(biāo)本SDC2基因甲基化檢測,有望普及作為一種新的無創(chuàng)的高靈敏度、高特異度的CRC輔助診斷方法[22]。循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTC)檢測也是一種理想的臨床腫瘤液體活檢技術(shù),可提供CRC患者疾病狀態(tài)的實(shí)時(shí)信息,有助于CRC的預(yù)后評估、治療反應(yīng)監(jiān)測、復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)評估等。

綜上所述,本研究分析了CRC患者的MMR蛋白,MSI,以及KRAS、NRAS、BRAF基因共5個(gè)分子標(biāo)志物,發(fā)現(xiàn)它們與多種臨床病理特征相關(guān)。這些發(fā)現(xiàn)為CRC的臨床診斷和個(gè)體化精準(zhǔn)治療提供了額外的支持。本研究也存在不足,缺乏這些患者的臨床治療和預(yù)后的數(shù)據(jù),不能分析這些分子標(biāo)志物與療效或預(yù)后之間的關(guān)系,下一步將繼續(xù)完善隨訪數(shù)據(jù),進(jìn)行更深入全面的探討。