李海霞 彭 穎 李晨華 李學(xué)剛

（廣東警官學(xué)院刑事技術(shù)系，廣東 廣州 510440）

利用DNA 分析技術(shù)檢測(cè)陳舊血跡的DNA，通過(guò)DNA 的數(shù)量和質(zhì)量分析，了解血跡DNA 的降解過(guò)程，目前研究主要集中于不同載體對(duì)DNA 降解的影響及存儲(chǔ)DNA 的狀態(tài)效果［1-2］。其中，A.L. Rahikainen 等利用存儲(chǔ)16 年的FTA 血卡研究DNA 的質(zhì)量變化，評(píng)估依賴于時(shí)間的降解情況，從1998 年到2013 年的8 個(gè)時(shí)間點(diǎn)隨機(jī)采集了4 個(gè)FTA 樣本，采用Quantifiler?Human Plus (HP)定量試劑盒測(cè)定提取DNA 樣品的數(shù)量和質(zhì)量，證明FTA 卡存儲(chǔ)效果較明顯，DNA 較為穩(wěn)定。然而國(guó)內(nèi)外關(guān)于利用DNA 檢測(cè)技術(shù)判斷血跡陳舊度的研究較為鮮見。

本研究通過(guò)直擴(kuò)法、Chelex-100 提取法、磁珠提取法等DNA 檢測(cè)方法對(duì)陳舊血跡進(jìn)行DNA 質(zhì)與量檢測(cè)，比較分析各自圖譜的均衡性，峰值、峰面積的差異性等，得出利用DNA 檢測(cè)技術(shù)對(duì)血跡陳舊度的初步探索。

1 材料與方法

1.1 材料

收集2009 ～ 2018 年每年度各2 份血濾紙檢材，共20 份血濾紙檢材，均為本鑒定中心日常檢案的檢材。

1.2 方法

根據(jù)《法庭科學(xué)DNA實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)范》（GA/T383-2014）標(biāo)準(zhǔn)，通過(guò)直擴(kuò)法、Chelex-100 提取法、磁珠提取法等3 種不同的DNA 分析方法對(duì)陳舊的血濾紙進(jìn)行檢測(cè)。采用1.2mm 打孔器對(duì)20 份血濾紙檢材進(jìn)行取樣，其中，直擴(kuò)法取1 片血濾紙，Chelex-100 提取法與磁珠提取法取3 片血濾紙，同時(shí)，加入10%的Chelex-100懸液為30μL，磁珠提取法的洗脫液亦為30μL，其余步驟按照試劑說(shuō)明書進(jìn)行規(guī)范操作提取DNA。采用GoldeneyeTM DNA 身份鑒定系統(tǒng) 20A 試劑盒（基點(diǎn)認(rèn)知，北京，簡(jiǎn)稱20A）進(jìn)行擴(kuò)增，2 種方法均為全模板擴(kuò)增，即加入3.84μL 的DNA 提取液，擴(kuò)增熱循環(huán)數(shù)為30 個(gè)循環(huán)，其余步驟按照商業(yè)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作。采用ABI-3130 遺傳分析儀進(jìn)行電泳分離和基因分型。利用GeneMapper?ID V2.0 軟件進(jìn)行分型結(jié)果的分析。

2 結(jié)果

因血濾紙檢材的放置年份長(zhǎng)久，取樣面積并不多，為了確?；蚍中偷臏?zhǔn)確性，每個(gè)血濾紙檢材所得基因分型均與之前檢案的圖譜進(jìn)行比較，血濾紙檢測(cè)所得圖譜（見圖1 ～圖2）。從不同年份圖中的峰高值和峰面積值可以看出，血濾紙存在降解趨勢(shì)，年份越久降解趨勢(shì)越明顯。按照265bp 作為大小片段的分界線，將各個(gè)基因座分為小片段基因座和大片段基因座，即小片段基因座包含D19S433、D5S818、D21S11、D3S1358、D13S317、D7S820、AMEL、vWA、D8S1179、TH01、D12S391 和D2S1338，大片段基因座包含D18S51、D6S1043、D16S539、CSF1PO、Penta D、TPOX、Penta E 和FGA，3 種方法的大小片段的峰高值和峰面積值（見表1 ～表3）。從表1 可以看出，無(wú)論是大片段還是小片段，直擴(kuò)法的峰高值和峰面積值是最高的，其次是磁珠提取法，最低是Chelex-100 提取法。不同年份的大小片段峰高值和峰面積值的比值（見表4），從表2 可以得出，直擴(kuò)法、Chelex-100提取法和磁珠提取法的峰高比值分別為3.24、4.13、3.31，同理，峰面積比值分別為2.81、3.57、2.81，直擴(kuò)法和磁珠提取法的峰高和峰面積比值相當(dāng)，而Chelex-100 提取法的峰高和峰面積比值差異大些。

圖1 檢材編號(hào)為1 的圖譜

圖2 檢材編號(hào)為18 的圖譜

表1 不同年份檢材直擴(kuò)法的峰高和峰面積（單位：千）

表2 不同年份檢材Chelex-100 提取法的峰高和峰面積（單位：千）

表3 不同年份檢材磁珠提取法的峰高和峰面積（單位：千）

表4 不同年份的大小片段峰高值和峰面積值的比值

3 結(jié)論

直擴(kuò)法、Chelex-100 提取法和磁珠提取法是目前最為常用的DNA 提取法。直擴(kuò)法可以達(dá)到簡(jiǎn)化實(shí)驗(yàn)步驟，縮短檢驗(yàn)時(shí)間、減少污染、節(jié)約檢材和成本的效果，但是對(duì)于雜質(zhì)較多或降解較為嚴(yán)重的檢材，直擴(kuò)法不一定是最佳選擇［3-4］；Chelex-100 提取法可以做到DNA 量無(wú)損失，對(duì)于污染輕、雜質(zhì)少的接觸DNA 檢材用此法提取出的DNA 片段更加完整，但在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，Chelex-100 法卻不能有效地排除DNA 混有的雜質(zhì)和降解的DNA 碎片的干擾［5］；磁珠提取法可有效去除檢材中的雜質(zhì)，提高DNA 的質(zhì)量，并在降解和腐敗檢材上的處理略勝一籌，但在去除雜質(zhì)的同時(shí)，會(huì)對(duì)DNA 存在的量造成一定的損失，對(duì)于微量檢材是不利的［6］。3 種不同的DNA 檢測(cè)方法存在各自的優(yōu)缺點(diǎn)，根據(jù)不同條件的檢材選擇合適的DNA 檢測(cè)方法進(jìn)行分析。

本研究通過(guò)3 種不同的方法分析血跡陳舊度，從圖譜可以看出，與大片段的峰高值和峰面積相比，小片段均高些，而且越久年份的血濾紙降解程度越明顯，從而說(shuō)明用DNA 檢測(cè)方法去分析血跡陳舊度是可行的，圖譜結(jié)果可以明顯得出結(jié)論。

從檢測(cè)結(jié)果的均衡性、峰高比值和峰面積比值來(lái)看，直擴(kuò)法對(duì)于2009 ～ 2018 年血濾紙檢材的檢測(cè)，在同等條件之下，較其他兩種方法，其檢測(cè)的峰高值和峰面積是最高的，檢測(cè)效果是最好的，長(zhǎng)達(dá)14 年的血濾紙依然能檢測(cè)出較為完整的圖譜。假設(shè)3 片血濾紙的DNA 含量為100%，直擴(kuò)法1 片血濾紙的DNA 含量為33%，而Chelex-100 提取法和磁珠提取法僅為12.8%，排除其他因素的影響，DNA 含量的不同直接影響圖譜的結(jié)果。因檢材量有限，未能做到DNA 含量精準(zhǔn)相同，若檢材條件允許的情況下，可進(jìn)一步研究。

從血濾紙的保存年份進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，普遍是年份越久的，峰高和峰面積的均值越大，比值亦越大。同時(shí)，亦發(fā)現(xiàn)2011 年和2012 年度的血濾紙檢材與這個(gè)結(jié)論不符，無(wú)論哪種DNA檢測(cè)方法，這4 個(gè)檢材的峰高和峰面積的比值均變化較大，是檢測(cè)保存條件的問題還是提供血液的個(gè)體差異問題，原因仍需進(jìn)一步探討。