滕夢鑫 徐亞 何靜 汪奇 喬飛 李敬陽 李新國

（1. 熱帶作物生物育種全國重點實驗室 海南大學(xué)熱帶農(nóng)林學(xué)院，?？?70228；2. 中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所，?？?71101）

程序性細胞死亡（programmed cell death, PCD）在植物的生長發(fā)育中發(fā)揮著重要的作用，是植物抵抗生物和非生物脅迫的基本機制［1-2］。多項研究表明，動物和植物細胞［Ca2+］cyt的升高是誘導(dǎo)PCD發(fā)生的必要條件。Ca2+可通過增加細胞內(nèi)鈣水平導(dǎo)致液泡破裂［3］；直接激活鈣依賴的核酸內(nèi)切酶，使DNA 發(fā)生降解［4-5］；影響線粒體通透性轉(zhuǎn)變，促進線粒體釋放出細胞色素c，激活下游類caspase 3 等方式參與PCD［6］。

Metacaspases（MCs）屬于半胱氨酸蛋白酶類［7］，在植物PCD 過程中起著關(guān)鍵的調(diào)控作用。根據(jù)空間結(jié)構(gòu)域和氨基酸序列的相似性，植物 MCs 分為兩個亞類：I 型MCs 的N 端前結(jié)構(gòu)域包含富含脯氨酸的重復(fù)基序，并且在植物成員中還有一個鋅指基序。II 型MCs 不含有這樣的前結(jié)構(gòu)域［8-9］。但MCs 缺乏caspases 活性，并且不負責在植物細胞死亡期間檢測到的類caspase 活性［10］，另有研究表明MCs 的表達可能導(dǎo)致下游具有類caspase 活性的蛋白酶激活［11］，啟動PCD 的發(fā)生。MCs 在擬南芥中研究較多，AtMC1、AtMC2、AtMC8和AtMC9等可正向或反向調(diào)控PCD 的發(fā)生［12-14］，且多個成員受生物和非生物脅迫誘導(dǎo)表達［15-17］。水稻OsMCs家族成員在響應(yīng)非生物和生物脅迫下也有不同的表達模式，其中OsMC1和OsMC7受鹽脅迫誘導(dǎo)上調(diào)表達［18-19］。

香蕉產(chǎn)業(yè)已成為熱帶高效農(nóng)業(yè)的支柱，海南省因自然資源條件適宜，是中國香蕉主產(chǎn)區(qū)之一［20-21］。香蕉對環(huán)境的變化極其敏感［22］，由于生產(chǎn)上施肥不當和海水倒灌導(dǎo)致的土壤鹽堿化，以及發(fā)展海水灌溉農(nóng)業(yè)的需要［23］，使得對香蕉耐鹽的研究變得十分重要。在前期研究中我們發(fā)現(xiàn)，不同苗齡和組織部位對脅迫的響應(yīng)存在特異性［24-25］，而懸浮細胞同質(zhì)性高［26］，可以對外部刺激做出快速而一致的反應(yīng)，是一個對研究有價值的簡單和可控的系統(tǒng)，因此被廣泛用于大麥（Hordeum vulgareL.）、小麥（Triticum aestivumL.）、擬南芥（Arabidopsis thaliana）和柑橘（Citrus reticulataBlanco）等植物對脅迫響應(yīng)的生理和分子機制研究［27-30］。

前期研究中我們發(fā)現(xiàn)MaMC6可對鹽脅迫做出快速的響應(yīng)［31］，但該基因的表達在鹽脅迫下是否起著積極的調(diào)控作用有待進一步研究。本實驗從巴西蕉（MusaAAA Cavendish cv. Brazil）細胞中克隆到MaMC6基因，然后利用生物信息學(xué)和分子生物學(xué)等手段對其進行鑒定及分析。檢測鹽脅迫以及不同鈣效應(yīng)劑對MaMC6表達量的影響，轉(zhuǎn)大腸桿菌驗證基因功能，為豐富香蕉耐鹽機制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

材料來源于中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所保存的巴西蕉懸浮細胞系，繼代周期為7 d，培養(yǎng)條件為：溫度26℃，光照時間16 h/d，轉(zhuǎn)速150 r/min。

鹽脅迫及鈣效應(yīng)劑處理：分別用100 mmol/L NaCl、100 mmol/L NaCl + 10 mmol/L CaCl2、100 mmol/L NaCl + 10 mmol/L EGTA 和100 mmol/L NaCl +5 mmol/L LaCl3處理繼代后第5 天的巴西蕉細胞，并在處理后的0、2、4、8、16、24 h 進行取樣。取1.8 mL 懸浮細胞于2 mL 離心管中，25℃、8 000×g離心6 min，去除培養(yǎng)基，液氮速凍，置于?80℃保存?zhèn)溆谩Ｃ拷M處理取3 次重復(fù)。

煙草材料為30 d 苗齡的野生型本氏煙（Nicoti?ana benthamianaL.）。

1.2 方法

1.2.1MaMC6基因的克隆 根據(jù)MaMC6的CDS序列，設(shè)計帶有NcoI? 和SpeI?酶切位點的引物1302?MaMC6?F/R（表1），以巴西蕉細胞cDNA 為模板，用PrimeSTAR Max DNA 聚合酶擴增亞細胞定位所需的特異性目的片段，將MaMC6連接到pCAMBIA1302?GFP 載體上；用帶有NcoI? 和XhoI?酶切位點的引物pET28a?MaMC6?F/R 擴增構(gòu)建原核表達載體所需的特異性目的片段，將MaMC6連接到pET28a 載體上。連接后的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)DH5α，隨機挑取單克隆進行培養(yǎng)，菌液PCR 驗證，陽性單克隆菌液送至上海生工公司測序鑒定。

表1 試驗所用引物Table 1 Primers used in the experiment

1.2.2 生物信息學(xué)分析 從香蕉基因組數(shù)據(jù)庫（https://banana?genome?hub.southgreen.fr/） 中 檢 索獲得MaMC6 堿基序列、蛋白序列和上游2 000 bp啟動子序列；使用ProtParam（https://web.expasy.org/protparam/）對蛋白理化性質(zhì)進行預(yù)測；使用TMHMM（https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?TMHMM?2.0）進行蛋白跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測；利用NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）檢索MaMC6 的氨基酸同源序列，然后使用DNAMAN 進行多序列比對，MEGA?X 構(gòu)建系統(tǒng)進化樹；通過PredictProtein（https://predictprotein.org/）進行蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測，SWISS?MODEL（https://swissmodel.expasy.org/interactive）進行蛋白三級結(jié)構(gòu)預(yù)測；通過PlantCARE（https://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）進行順式作用元件預(yù)測，并使用TBtools 對其進行可視化。

1.2.3MaMC6的表達分析 使用TIANGEN 多糖多酚植物總RNA 提取試劑盒，提取巴西蕉細胞總RNA。諾唯贊反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書，將總RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物在?20℃下保存?zhèn)溆?。實時熒光定量PCR（RT?qPCR），使用 QuantStudio 6 Flex實時熒光定量 PCR 儀，以香蕉A 基因組Actin為內(nèi)參基因，用目標引物進行PCR 擴增（表1），對目的基因進行特異性表達分析。反應(yīng)體系（10 μL），反應(yīng)程序：50℃ 2 min，95℃ 10 min，95℃ 15 s，60℃1 min，95℃ 15 s，60℃ 1 min，95℃ 15 s，共40 個循環(huán)，反應(yīng)結(jié)束后將結(jié)果導(dǎo)入Excel 軟件，采用 2-ΔΔCt法計算相對表達量［25］。

1.2.4 亞細胞定位觀察 采用在煙草葉片中瞬時過量表達的方法，觀察MaMC6 在細胞內(nèi)定位情況。從測序正確的單克隆中提取pCAMBIA1302?MaMC6?GFP 質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌感受態(tài)LBA4404。以轉(zhuǎn)入pCAMBIA1302?GFP 質(zhì)粒的LBA4404 為對照，注射煙草葉片下表皮，黑暗培養(yǎng)1 d，光照培養(yǎng)2 d 后，制片，在激光共聚焦顯微鏡下觀察并拍照記錄。

1.2.5MaMC6 的誘導(dǎo)表達及在大腸桿菌BL21 中的抗性分析 從測序正確的單克隆中提取pET28a?MaMC6質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)BL21。分別將含有重組質(zhì)粒pET28a?MaMC6和空載質(zhì)粒pET28a的大腸桿菌BL21 使用IPTG 誘導(dǎo)表達，再將誘導(dǎo)后的菌液按梯度稀釋為1、10-1、10-2、10-3、10-4的濃度。稀釋后的菌液各取4 μL 滴在含有800 mmol/L NaCl 和800 mmol/L 甘露醇的LB 固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，置于37℃培養(yǎng)進行鹽脅迫和滲透脅迫試驗，另一組置于50℃培養(yǎng)進行高溫脅迫試驗，以正常培養(yǎng)為對照組，12 h 后觀察重組菌和對照菌生長存活情況并拍照。

2 結(jié)果

2.1 MaMC6的克隆

MaMC6由963 個堿基組成，凝膠電泳結(jié)果如下圖1 所示。擴增出接近1 000 bp 的特異性條帶，與預(yù)期大小相近。

圖1 MaMC6 凝膠電泳圖Fig. 1 MaMC6 gel electrophoresis image

2.2 MaMC6生物信息學(xué)分析

MaMC6 由320 個氨基酸組成，分子質(zhì)量約為34.21 kD，等電點為5.99，不穩(wěn)定系數(shù)為35.43 屬于穩(wěn)定蛋白，脂肪系數(shù)為85.97，親水平均系數(shù)為?0.051屬于親水蛋白，不含有跨膜結(jié)構(gòu)。

序列多重比較結(jié)果顯示MaMC6 與其他幾種植物氨基酸序列有較高的相似性，保守結(jié)構(gòu)域與擬南芥metacaspase?9 一致含有一個caspase?like domain，同屬于II 型metacaspase（圖2）。

圖2 MaMC6 與其他植物氨基酸序列多重對比Fig. 2 Multiple comparison of amino acid sequences between MaMC6 and other plants

對包含MaMC6 在內(nèi)的20 個同源氨基酸序列進行對比，使用MEGA?X 構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。圖3 所示，Mametacaspase?9 與Mbmetacaspase?9 有高度的同源性，其次是Zometacaspase?9?like 和OsZIFL1（Zinc Induced Facilitator?Like 1），與Lsmetacaspase?9 同源性較低。

圖3 MaMC6 與其他植物的系統(tǒng)進化樹分析Fig. 3 Phylogenetic tree analysis of MaMC6 and other plants

對MaMC6 蛋白二級結(jié)構(gòu)進行預(yù)測，MaMC6 含有28.12%的α-螺旋、11.25%的β-折疊和60.62%的無規(guī)則卷曲。三級結(jié)構(gòu)預(yù)測如圖4 所示。

圖4 MaMC6 蛋白三級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig. 4 Prediction of the 3-three-dimensional structure of MaMC6 protein

MaMC6順式作用元件分析（圖5）表明其含有較多的光響應(yīng)元件，另外還含有防御和應(yīng)激、玉米素代謝調(diào)控、茉莉酸甲酯、赤霉素、脫落酸等激素響應(yīng)元件。其中防御和應(yīng)激表明該基因可能受外界脅迫誘導(dǎo)表達，參與香蕉的抗逆。

圖5 MaMC6 順式作用元件分析Fig. 5 Analysis of cis-acting elements of MaMC6

2.3 MaMC6的表達分析

2.3.1 鹽脅迫下MaMC6表達分析 經(jīng)100 mmol/L NaCl 處理后，以0 h 為對照組，巴西蕉MaMC6的RT?qPCR 結(jié)果（圖6）可知，在2 h 時出現(xiàn)顯著上調(diào)表達，相對表達量為對照的7.70 倍，隨后表達量開始下降，到24 h 時降至對照的31%。

圖6 MaMC6 在NaCl 處理下的基因表達Fig. 6 Gene expression of MaMC6 under NaCl treatment

2.3.2 鹽脅迫下不同鈣效應(yīng)劑處理后MaMC6的表達分析 從圖7 看出，CaCl2處理后，基因的表達受到抑制，但仍在2 h 時達到最高峰，為對照的3.99 倍。而鈣離子螯合劑EGTA 和鈣離子通道阻礙劑LaCl3提高了MaMC6在鹽脅迫下的相對表達量，處理期間相對表達量均高于NaCl 處理組，但整體變化趨勢相似，在2 h 時達到最高峰，分別為對照的9.92 和11.20 倍。由此推測，適當添加外源Ca2+可以通過抑制PCD 相關(guān)基因的表達，進而緩解由NaCl 誘導(dǎo)的PCD 的發(fā)生，通過EGTA 和LaCl3阻礙外源Ca2+進入胞內(nèi)參與響應(yīng)鹽脅迫的調(diào)控則會加速PCD的發(fā)生。該基因的表達受到外源Ca2+的影響。

圖7 不同鈣效應(yīng)劑對鹽脅迫下MaMC6 表達的影響Fig. 7 Effects of different calcium effectors on the expression of MaMC6 under salt stress

2.4 MaMC6亞細胞定位分析

瞬時轉(zhuǎn)化煙草葉片細胞后，在激光共聚焦顯微鏡下觀察細胞核和細胞膜上有GFP 熒光信號，表明MaMC6?GFP 融合蛋白呈現(xiàn)出細胞質(zhì)和細胞核定位模式（圖8）。

圖8 MaMC6 亞細胞定位Fig. 8 Subcellular localization of MaMC6

2.5 MaMC6在BL21中對非生物脅迫的響應(yīng)

從圖9 可知，在LB 培養(yǎng)基上的對照菌和重組菌的生長情況沒有明顯差別。而在含有800 mmol/L NaCl 和800 mmol/L 甘露醇的LB 培養(yǎng)基上，菌落生長情況在菌液稀釋到10-2梯度時已經(jīng)出現(xiàn)明顯差異，表達MaMC6 蛋白的重組菌的生長情況要優(yōu)于對照菌。高溫脅迫下培養(yǎng)的結(jié)果顯示，pET28a?MaMC6菌落生長情況在菌液稀釋到10-2梯度時開始出現(xiàn)差異，此時重組菌的生長情況要優(yōu)于對照菌,到10-3梯度時高溫基本抑制了含有空載pET28a 質(zhì)粒的對照菌的生長，而此時表達MaMC6 蛋白的菌落仍具有活力。以上結(jié)果表明，MaMC6的表達能提高大腸桿菌BL21 的耐鹽、耐滲透和耐高溫能力。

圖9 MaMC6 在大腸桿菌BL21 中的功能驗證Fig. 9 Functional verification of MaMC6 in Escherichia coli BL21

3 討論

Metacaspases（MCs）屬于植物類caspases 酶的半胱天冬氨酸酶類，通過激活下游具有類caspase 活性的蛋白酶，參與植物生長發(fā)育以及響應(yīng)生物和非生物脅迫誘導(dǎo)的PCD 過程［11］。從香蕉A 基因組數(shù)據(jù)庫鑒定到的MaMC6，利用生物學(xué)信息分析基因的特性。氨基酸序列多重比對以及系統(tǒng)進化樹分析結(jié)果顯示，MaMC6 屬于II 型metacaspases，與唐露等［24］分析結(jié)果相似。跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測顯示MaMC6 沒有跨膜結(jié)構(gòu)，保守結(jié)構(gòu)域分析發(fā)現(xiàn)只含有一個caspase?like domain 與水稻和擬南芥一致［18］。順式作用元件分析顯示其含有防御和應(yīng)激響應(yīng)元件，猜測可能與香蕉的抗逆有關(guān)。

Metacaspase 在參與植物PCD 過程中的作用機制是復(fù)雜的，在擬南芥中AtMC1和AtMC2拮抗控制細胞死亡［12］；過表達辣椒CaMC9，增強植株對病原體的敏感性和細胞的死亡率［32］；水稻OsMCs基因經(jīng)鹽脅迫后的表達情況存在差異，過表達OsMC4基因有助于提高水稻對鹽脅迫的耐受性［19,33］。香蕉根系響應(yīng)鹽脅迫的轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究結(jié)果顯示，外源Ca2+對鹽脅迫誘導(dǎo)香蕉幼苗根系PCD 的調(diào)控可能與MaMCs有密切聯(lián)系［34］。本實驗用100 mmol/L NaCl對巴西蕉細胞進行人工模擬鹽脅迫，使用RT?qPCR分析MaMC6的表達情況?；虮磉_分析結(jié)果顯示，MaMC6在2 h 時的上調(diào)表達倍數(shù)較高。與唐露等［24］在高濃度鹽脅迫（200 mmol/L NaCl）誘導(dǎo)香蕉組培苗MaMCs表達中的結(jié)果存在一定差異，這可能和實驗材料以及脅迫強度不同有關(guān)。另外，在煙草、豌豆、番茄、大豆等植物中均發(fā)現(xiàn)［Ca2+］cyt會影響PCD的發(fā)生［35-38］。為驗證Ca2+是否會影響MaMC6的表達，本實驗在鹽脅迫基礎(chǔ)上添加不同鈣效應(yīng)劑，然后測定MaMC6的相對表達量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CaCl2會降低MaMC6的表達，而EGTA 和LaCl3導(dǎo)致MaMC6的表達升高，這可能與Ca2+能夠緩解植物鹽脅迫有關(guān)。

對MaMC6進行亞細胞定位實驗，MaMC6呈現(xiàn)出細胞質(zhì)和細胞核定位模式，這與擬南芥AtMC9（Atmetecaspase?9）亞細胞定位結(jié)果相似［39］，并且MaMC6和AtMC9在進化分析中有一定的同源性。為進一步鑒定MaMC6的功能，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET28a?MaMC6，將其轉(zhuǎn)入大腸桿菌中分析該基因?qū)γ{迫的耐受性發(fā)現(xiàn)，重組菌株在NaCl、甘露醇和高溫脅迫下的生長情況均優(yōu)于對照，推測MaMC6可能是香蕉抗逆的候選基因。

目前， 關(guān)于香蕉MaMCs以及Ca2+與mete?caspase 的研究較少。本實驗從巴西蕉細胞中克隆到MaMC6，初步驗證了該基因可受鹽脅迫誘導(dǎo)表達并且其表達情況還受Ca2+影響，原核表達驗證了MaMC6 對鹽、干旱和高溫脅迫的耐受性，為香蕉metecaspase 基因家族響應(yīng)非生物脅迫的分子機制研究提供了參考。

4 結(jié)論

從巴西蕉細胞中克隆到MaMC6，該基因編碼320 個氨基酸，屬于穩(wěn)定親水蛋白，不含有跨膜結(jié)構(gòu)，為II 型metacaspase，含有光、激素等響應(yīng)元件。MaMC6受鹽脅迫誘導(dǎo)表達，且在鹽脅迫下的表達受Ca2+影響。MaMC6 呈現(xiàn)細胞質(zhì)和細胞核定位。MaMC6的表達能提高大腸桿菌的耐鹽、滲透和高溫的能力。