候林慧 鄭赟 榮二花 吳玉香

（山西農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院，太谷 030801）

棉花俗稱“白色黃金”，是世界上最重要的紡織纖維作物，是紡織工業(yè)的重要原料，也是重要的油料作物［1］。中國是世界上最大的棉花生產(chǎn)國和消費國，自1949 年以來培育的優(yōu)質(zhì)陸地棉品種為棉花生產(chǎn)作出了巨大貢獻［2］。棉花栽培種經(jīng)過長期的定向培育和定向馴化，遺傳基礎逐漸狹窄，使棉花栽培種容易受到生物和非生物脅迫。棉屬野生種由于環(huán)境差異和長期自然選擇，形成豐富的遺傳多樣性，具有許多優(yōu)良性狀，如抗病蟲、抗寒、耐干旱、耐鹽堿等［3-4］，成為可被棉花育種應用的優(yōu)質(zhì)種質(zhì)資源。利用野生棉種在栽培棉基因庫中注入新的遺傳變異，以保護其抵御農(nóng)業(yè)環(huán)境的挑戰(zhàn)［5］。棉屬野生種瑟伯氏棉具有很強的抗蟲性，還具有抗寒性和抗黃萎病的特性，能經(jīng)受?8℃- ?6℃的低溫，瑟伯氏棉潛在的優(yōu)良纖維特性是纖維高強力的來源［6］。通過遠緣雜交將野生棉的優(yōu)良基因轉(zhuǎn)移到陸地棉中創(chuàng)制優(yōu)異種質(zhì)材料，是拓寬陸地棉遺傳基礎的有效途徑。

21 世紀初，野生棉優(yōu)良的種質(zhì)資源已經(jīng)得到了我國科研工作者的關注。潘家駒等［7］認為野生種瑟伯氏棉可作為黃萎病的理想抗原，瑟伯氏棉對黃萎病具有高抗性。梁理民等［8］通過陸地棉與斯特提棉的遠緣雜交，培育出抗病的新品種秦遠4 號。李愛國等［9］通過?！辽陵戨s交，成功合成三元雜種一代，并通過多代的選育成功選育出新品種冀棉24號。Cai 等［10］通過對瑟伯氏棉進行冷脅迫，探討了瑟伯氏棉的抗寒機制和新的抗寒調(diào)控網(wǎng)絡，為創(chuàng)造抗寒性的棉花種質(zhì)資源奠定了基礎。Gan 等［11］通過熒光原位雜交對瑟伯氏棉和它的姐妹種以及四倍體栽培種海島棉進行染色體核型分析，為進一步研究D 組棉種的細胞遺傳學和基因組學提供了一個新方向。

陸地棉產(chǎn)量高、抗逆性強，但由于長期的種植，遺傳基礎狹窄，國內(nèi)外對陸地棉與瑟伯氏棉的遠緣雜交報道較少，由于瑟伯氏棉的抗寒性、抗病性等優(yōu)勢，將這些抗逆性的優(yōu)良基因通過遠緣雜交導入栽培棉陸地棉中，對提高棉花的抗性和拓寬遺傳基礎至關重要。

本研究選用中棉所16 號陸地棉為母本，瑟伯氏作父本進行遠緣雜交，合成F1并對其加倍，成功合成人工異源六倍體，對其進行形態(tài)學、細胞學等觀察，并對其進行生理生化和SSR 分子標記鑒定，篩選出育性穩(wěn)定且綜合農(nóng)藝性狀優(yōu)良的異源六倍體。

1 材料與方法

1.1 材料

母本陸地棉品種中棉所16 來源于中國農(nóng)業(yè)科學院棉花研究所，父本野生瑟伯氏棉來源于國家種質(zhì)三亞野生棉圃。具體信息見表1。

表1 研究材料基本信息Table 1 Basic information of research materials

1.2 方法

1.2.1 試驗設計 陸地棉作母本P1，野生瑟伯氏棉作父本P2，進行遠緣雜交，獲得三倍體雜種F1，對F1幼苗進行多倍體誘變得到M0代植株，將M0代植株所得種子播種得到M1代（AADDCC）植株，對4個不同世代P1、P2、F1和M1進行比較鑒定。所用材料均以盆栽的方式保存于山西農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院溫室。

1.2.2 遠緣雜交 早上6：00 左右，將母本陸地棉未開放的花去雄，套上蠟管待用，上午9：00 以后，用父本瑟伯氏棉的花粉給去雄的母本陸地棉授粉，繼續(xù)套上蠟管，滴加25 mg/L 赤霉素保鈴。

1.2.3 多倍體誘變 將種子在培養(yǎng)皿中育苗，待幼苗的種皮脫落，放入廣口瓶培養(yǎng)，待子葉展開之時，將0.2%的秋水仙堿凝膠包裹在幼苗的生長點，蓋上透明罩，保證凝膠水分不流失，48 h 后清除凝膠，沖洗干凈，繼續(xù)培養(yǎng)，保證幼苗健康生長。

1.2.4 形態(tài)學鑒定 對長勢較好的父母本和雜種F1以及誘變后的異源六倍體植株進行形態(tài)觀察，并拍照，包括花、葉片和植株。進入花期之后，對各世代的花進行比較，對各世代的花瓣、苞葉的大小、柱頭的長短以及花藥的數(shù)量進行比較。棉花進入蕾期后，對各世代無蟲害、病害，健康的葉片進行葉長、葉寬和葉面積的測量，同時進行顏色和形狀的比較，從形態(tài)學的角度對各世代進行比較鑒定。

1.2.5 細胞學觀察

（1）氣孔保衛(wèi)細胞和葉綠體數(shù)測定。取不同世代生長良好的葉片洗凈，切取主葉脈周圍1 cm×1cm 大小葉片浸于卡諾氏固定液（無水乙醇∶冰乙酸=3∶1）中脫色10 h 以上；將脫色后的葉片用蒸餾水清洗幾次，取2 mm×2 mm 置于載玻片上，下表皮朝上，用1%的I2?KI 溶液（2 滴）染色2-5 min，蓋上蓋玻片；分別在顯微鏡10×40 倍和10×100 倍下統(tǒng)計氣孔密度（每個世代各取10 個不同視野），以及測量氣孔長度和統(tǒng)計葉綠體數(shù)（每個世代各取30 個氣孔作為重復）。

（2）花粉母細胞減數(shù)分裂及花粉粒統(tǒng)計。在不同世代的開花期，取長3-5 cm 的花蕾，放入卡諾氏固定液（無水乙醇∶冰乙酸=3∶1）之中，12 h 之后將其轉(zhuǎn)移到酒精中，觀察時將花蕾置于干凈的濾紙上，用干凈的解剖針取4-6 個花藥置于干凈載玻片上，用卡寶品紅染液（2 滴）進行染色，用解剖針將花粉母細胞擠出，將肉眼可見的雜質(zhì)去除，蓋上蓋玻片，在酒精燈上微熱，將其固定，最后用濾紙覆蓋染色區(qū)域，輕壓吸去多余的染液。鏡檢，觀察不同世代的減數(shù)分裂行為，統(tǒng)計多分體和花粉粒的數(shù)量，共統(tǒng)計600 個花粉母細胞。

1.2.6 生理生化指標鑒定 取生長狀況良好、均一的親本、雜種和多倍體植株第五節(jié)位的葉片，重復3 次。用愈創(chuàng)木酚顯色法測定過氧化物酶（peroxidase,POD）活性，氮藍四唑（nitro?blue tetrazolium, NBT）光化還原比色法測定超氧化物歧化酶（superoxide dismutase, SOD）活性，紫外吸收法測定過氧化氫酶（catalase, CAT）活性，參照Nakano 等［12］方法測定抗壞血酸過氧化物酶（ascorbate peroxidase, APX）活性，硫代巴比妥酸比色法（thiobarbituric acid, TBA）測定丙二醛（malondialdehyde, MDA）含量，考馬斯亮藍G?250 染色法［13］測定可溶性蛋白含量。

1.2.7 SSR 分子標記鑒定 采用SSR 分子標記鑒定對各世代進行多態(tài)性鑒定，利用CTAB 法對各世代進行DNA 的提取，材料必須選用各世代的幼嫩葉片，SSR?PCR 反應體系包含5 μL 2×Taq PCR MasterMix（含染料）、2 μL 正向和反向引物（10 μmol/L）、2 μL去離子水、1 μL 模板DNA（50 ng/μL）。擴增程序為94℃ 5 min；94℃ 45 s，35℃ 45 s，72℃ 1 min，5 個循環(huán)；94℃ 45 s，52℃ 45 s，72℃ 1 min，35 個循環(huán)；72℃ 10 min；4℃保存。8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，銀染，顯影。SSR 引物序列來自申狀狀等［14］文獻，由生物工程股份有限公司合成，引物序列見表2。

表2 SSR 引物序列信息Table 2 SSR primers sequence information

1.2.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析 數(shù)據(jù)使用Microsoft Excel 和SPSS 軟件進行統(tǒng)計分析和作圖。

2 結(jié)果

2.1 形態(tài)學鑒定結(jié)果

各世代的花形態(tài)差異很大，由圖1 可知，父本瑟伯氏棉花的形狀近似橢圓形，母本陸地棉的花瓣近似于三角形，雜種三倍體的花大于父母本，其苞葉是介于父母本之間，花瓣形狀近似扇形，大小介于雙親之間，花蕊大小與母本無顯著差異，與父本存在顯著差異，花藥數(shù)量介于雙親之間，顏色為淡黃色。與母本一致，弱于父本，無花斑。異源六倍體花的大小略大于雜種三倍體，但是差異不顯著，花瓣近似扇形，與雜種三倍體相似，花瓣與父本相似都有褶皺，花瓣邊緣較為平滑，無明顯鋸齒，有淡紅色的花斑。苞葉大小介于雙親之間，與雜種三倍體相似，花蕊大小與父母本、雜種三倍體存在顯著差異，花藥數(shù)量大于雙親和雜種三倍體，顏色為橙黃色（圖2）。

圖1 不同世代花的解剖圖和花蕊的比較Fig. 1 Comparison of flower anatomy and stamens of different generations

圖2 不同世代花的形態(tài)比較Fig. 2 Comparison of flower morphologies in different generations

各世代的葉片也存在顯著差異，母本P1陸地棉葉片較大，顏色深綠，有5 裂，葉裂較淺，有茸毛；父本P2瑟伯氏棉葉片較小，顏色淺綠，有3 裂，無茸毛；雜種F1有2 種葉形，一種介于雙親之間，另一種葉片略大，顏色淺綠，葉裂披針形，較深，且3-5裂都有；六倍體后代M1也有2 種葉形，與雜種相似但是更大，出現(xiàn)了寬披針形葉裂。由圖3 可以看出，不同倍性棉花的葉面積存在顯著差異，倍性增加會使葉面積增加，但是葉型并無規(guī)律可循，P1和F1的葉型指數(shù)并無顯著性差異。

圖3 不同世代葉片的比較Fig. 3 Comparison of the leaves in different generations

2.2 細胞學鑒定結(jié)果

為了驗證三倍體和六倍體的育性，通過對雜種三倍體和異源六倍體的減數(shù)行為分別進行觀察，二者的減數(shù)分裂均有正常和異常行為（圖4），三倍體中的多分體較多，多于正常的四分體，而六倍體植株，正常四分體明顯增多。由表3 可知，在三倍體植株的600 個多分體中，單分體有73 個，二分體有25 個，三分體有38 個，正常四分體有146 個，多分體有318 個，分別占比為12.17%、4.17%、6.33%、24.33%和53.00%。在六倍體植株的600 個多分體中，單分體有63 個，二分體有15 個，三分體有17 個，正常四分體有493 個，多分體有12 個，分別占比為10.50%、2.50%、2.83%、82.17%和2.00%。

圖4 不同世代減數(shù)分裂行為的對比Fig. 4 A comparison of meiosis behaviors in different generations（Bar=20 μm）

表3 各世代減數(shù)分裂的對比Table 3 Comparison of meiosis in different generations

葉片的氣孔性狀是指氣孔的大小、氣孔密度和保衛(wèi)細胞對中的葉綠體數(shù)，是判斷植物倍性的重要細胞學指標。通過對雜種三倍體和異源六倍體進行氣孔性狀的統(tǒng)計分析（圖5，表4），結(jié)果表明，雜種三倍體和異源六倍體植株在氣孔密度、氣孔長度和葉綠體數(shù)上都存在著顯著差異（P<0.05）；隨著倍性的增加，氣孔密度呈下降趨勢，而氣孔長度和葉綠體數(shù)均呈上升趨勢。本研究結(jié)果和前人研究結(jié)果一致［15］。

圖5 不同世代的氣孔的比較Fig. 5 Comparison of stomatas in different generations（Bar=20 μm）

表4 各世代氣孔的比較Table 4 Comparison of stomatas in different generations

2.3 生理生化指標鑒定結(jié)果

2.3.1 酶活性比較 酶活性是生物體內(nèi)最直觀的生理生化反應指標。本研究主要對超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）、過氧化氫酶（CAT）和抗壞血酸過氧化物酶（APX）以及丙二醛（MDA）和可溶性蛋白的含量進行了測定。這些都是植物體內(nèi)普遍存在且發(fā)揮重要作用的酶。由圖6 可以看出，不同倍性棉花的POD 含量存在極顯著差異，SOD、CAT、APX 的含量存在顯著差異；4 種酶含量的大小順序都是M1＞P1＞F1＞P2，酶的活性呈現(xiàn)出隨不同世代染色體數(shù)目的增加而升高的趨勢，因此，不同材料酶活性的差異可以在一定程度上反映倍性的差異。

圖6 各世代酶活性的比較Fig. 6 Comparison of enzyme activities in different generations

2.3.2 代謝產(chǎn)物的含量 由圖7 可以看出，不同倍性棉花的MDA 含量存在顯著差異，由大到小的順序是P2＞F1＞P1＞M1，隨倍性的增長MDA 的含量出現(xiàn)了負增長的情況，這可能由于M1細胞內(nèi)抗氧化酶含量高促使MDA 維持在較低水平；可溶性蛋白含量也隨倍性的變化存在顯著差異，由大到小的順序是M1＞P1＞F1＞P2。因此，不同材料生理生化反應的代謝產(chǎn)物之間會有明顯不同，也可以在一定程度上反映倍性的差異。

圖7 各世代代謝產(chǎn)物含量的比較Fig. 7 Comparison of metabolite contents in different generations

2.4 SSR分子標記鑒定結(jié)果

為了進一步鑒定雜種三倍體（F1）和異源六倍體，對母本陸地棉、父本瑟伯氏棉、雜種三倍體（F1）和異源六倍體植株進行SSR 分子標記鑒定，通過實驗室前期篩選出的13 對引物，對13 組條帶進行多態(tài)性分析，由表5 可知，共有185 條清晰條帶，其中母本有34 條，父本有21 條，雜種三倍體有59條，異源六倍體植株有61 條，重組條帶分別為4 和6 條，其中，雜種三倍體34 條來自母本，21 條來自父本，4 條為雜種三倍體特有條帶，異源六倍體中有34 條與母本相同，有21 條與父本相同，6 條為特有帶，其中4 條特有條帶與雜種三倍體特有條帶一樣，有2 條是六倍體植株特有條帶，在這13 對引物中，條帶的分子量都保持在500 bp 之內(nèi)，在引物NAU1355、NAU1169 和NBRI_GM7 擴增結(jié)果中（圖8），既擴增出父母本條帶，也擴增出雜種和六倍體的特異性條帶。結(jié)果表明，在母本陸地棉和父本瑟伯氏棉的雜交過程中可能引起了染色體重組和片段交換，后續(xù)驗證還在進行中。同時表明陸地棉和瑟伯氏棉的雜種中存在豐富的遺傳變異，SSR 分子標記鑒定結(jié)果分析證明該雜種是陸地棉和瑟伯氏棉的真雜種。

圖8 SSR 分子標記在不同世代的擴增結(jié)果Fig. 8 Amplification results of SSR markers in different generations

表5 不同世代的 SSR 多態(tài)性分析Table 5 Analysis of SSR polymorphism in different generations

3 討論

3.1 遠緣雜交及多倍化對棉花種質(zhì)創(chuàng)新的重要性

遠緣雜交是實現(xiàn)優(yōu)良農(nóng)藝性狀從一個物種向另一個物種轉(zhuǎn)移的有效途徑，是種質(zhì)創(chuàng)新的重要途徑。棉花遠緣雜交將野生種和栽培種的優(yōu)良性狀進行遺傳重組，創(chuàng)造了大量的種間雜種材料并培育出許多高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、抗逆性強的棉花品種［16］。遠緣雜交之后，由于染色體組的差異，缺少同源染色體，生殖細胞減數(shù)分裂行為異常，導致不育或者雜種衰退，染色體加倍可以改善遠緣雜種減數(shù)分裂的異常行為。通過多倍體實現(xiàn)基因組加倍是植物進化的一個重要過程，并在真核生物核基因組的進化中發(fā)揮了重要作用［17］。多倍體有多種類型，異源多倍體最為常見。異源多倍體經(jīng)歷了遠緣雜交與多倍化2 個階段，與雜種相比，異源多倍體表現(xiàn)出顯著的優(yōu)勢，如更強的生長勢與環(huán)境適應性。多倍化也是恢復育性的一種方法。申狀狀等［18］利用陸地棉與斯特提棉的雜種進行多倍體誘變，獲得育性穩(wěn)定且能夠結(jié)鈴的異源六倍體。

不同基因組通過遠緣雜交和加倍進入同一細胞核后，新種質(zhì)中存在大量重復基因和表達調(diào)控方式上的差異，會造成基因組組成和基因表達的強烈反應，如染色體重排、DNA 片段丟失、基因沉默，以及部分同源等位基因在功能和表達量上的分化。另外，有研究報道，在小麥和蕓薹屬等一些植物的多倍化過程中，經(jīng)常會出現(xiàn)以快速的基因組重組和大量基因丟失為特征的二倍化過程，但在棉花和擬南芥等植物中，其基因組序列相對穩(wěn)定，并沒有表現(xiàn)出如此強烈的變化。因此，對遠緣雜交種進行人工誘導染色體加倍，獲得異源多倍體是遠緣雜交種質(zhì)穩(wěn)定遺傳的關鍵。遠緣雜交及多倍化在許多植物的物種形成及進化過程中具有重要作用。

3.2 野生棉在棉花遠緣雜交育種中的應用

棉屬目前有55 個種，只有4 個栽培種，其余的均為野生棉［19］，野生棉在抗逆性等方面都優(yōu)于陸地棉，利用其有益農(nóng)藝性狀對提高栽培棉的產(chǎn)量和品質(zhì)具有很大的作用，野生棉種和栽培棉種之間豐富的遺傳多樣性是棉花育種家進行遺傳育種研究的寶貴資源。通過遠緣雜交將野生棉的優(yōu)良基因?qū)腙懙孛拗?，?chuàng)制出產(chǎn)量高、品質(zhì)好、抗逆性強、抗病蟲害等性狀優(yōu)良的新種質(zhì)，如草棉（G.herbaceumL）和納爾遜氏棉（G.nelsoniiFryx）的抗病性基因成功轉(zhuǎn)入到陸地棉中［20］，Chen 等［21］利用野生種澳洲棉與栽培種陸地棉進行遠緣雜交，成功合成雜種三倍體，并對其進行誘變?yōu)楫愒戳扼w，再將六倍體與野生種綠頂棉進行遠緣雜交，成功合成三元雜種。通過花粉母細胞的減數(shù)分裂行為證實三元雜種的真實性。Meng 等［22］利用野生種異常棉對陸地棉的纖維品質(zhì)和抗病蟲害進行遺傳改良，獲取了異常棉中的優(yōu)良基因，成功獲得了可育的六倍體植株。Zheng等［23］利用細胞質(zhì)雄性不育（CMS）將司篤克氏棉與陸地棉的雜交種進行了全基因組測序，為棉花種質(zhì)創(chuàng)新提供新的思路和理論指導。Masoomi?Aladizgeh等［24］利用了野生種G.robinsonii抗高溫的特性，與陸地棉成功合成異源六倍體，并對其進行了抗高溫的機理探究，揭示了熱帶棉花抗高溫的分子機制。Wei 等［25］研究了野生二倍體棉（G. klotzschianum和G. davidsonii）對高鹽脅迫（高達300 mmol/L NaCl）的初步反應，拓寬了對棉花耐鹽機制的認識，為陸地棉抗鹽遺傳改良奠定了堅實的基礎。本實驗室前期成功合成了陸地棉與擬似棉、陸地棉與斯特提棉的雜種，并成功誘變?yōu)楫愒戳扼w植株，后續(xù)篩選和性狀鑒定還在進行中，期望能篩選出育性穩(wěn)定且生產(chǎn)上有利用價值的新品種。

本研究以陸地棉為母本，瑟伯氏棉作父本，雜交合成陸瑟雜種，秋水仙堿成功加倍為異源六倍體植株，由于瑟伯氏棉具有抗寒性和抗黃萎病等特點，將雜種三倍體和異源六倍體植株進行溫室活體保存，作為下一步抗逆性研究材料的篩選。

4 結(jié)論

陸地棉與瑟伯氏棉遠緣雜種植株的性狀介于雙親之間，異源六倍體植株略大于雜種三倍體，表現(xiàn)出顯著的雜種優(yōu)勢及多倍化優(yōu)勢；細胞學結(jié)果表明三倍體雜種不育的主要原因，也證明了異源六倍體的育性在恢復；SSR 分子標記從分子水平證實了遠緣雜種的真實性，同時表明雜種在雜交過程中發(fā)生了親本的基因重組。