侯煒辰 葉柯 李潔 張洋子 許文濤 朱龍佼 李相陽

（1. 北京農學院食品科學與工程學院 食品質量與安全北京實驗室 農產品有害微生物及農殘安全檢測與控制北京市重點實驗室，北京 102206；2. 中國農業(yè)大學食品科學與營養(yǎng)工程學院，北京 100083；3. 中國農業(yè)大學營養(yǎng)與健康系 食品精準營養(yǎng)與質量控制教育部重點實驗室，北京 100083）

大腸桿菌（Escherichia coli）是一種革蘭氏陰性短桿菌，作為正常菌群存在于人或溫血動物的體內，同時也被用作多種基質糞便污染的指標［1-3］。然而，一些進化的大腸桿菌群體已經積累了致病性，對人類造成潛在威脅。

腸出血性大腸桿菌O157: H7 是一種產志賀毒素大腸桿菌，是主要致病性大腸桿菌之一。大腸桿菌O157: H7 是一種罕見的大腸桿菌血清型，1980 年首次作為腸道病原體報道，從食用半熟漢堡后患出血性結腸炎的患者中分離［4］。此后，陸續(xù)報告了由大腸桿菌O157: H7 導致的出血性和非出血性腹瀉以及溶血性尿毒癥綜合征（haemolytic uraemic syndrome，HUS）、出血性結腸炎（haemorrhagic colitis，HC）、血栓性血小板減少性紫癜（thrombocytopenic purpu?ra，TTP），如果未進行及時的治療會危及生命［5-6］。

目前對于大腸桿菌的檢測方法主要依據(jù)國標GB 4789.36-2016［7］、免疫學鑒定法［8］和分子學中基于核酸擴增的檢測方法［9］，此外還有一些光學［10］和電化學［11］等檢測手段。目前的標準檢測方法仍是傳統(tǒng)培養(yǎng)方法，通?；谶x擇性預富集、富集和鍍膜，然后使用菌落形態(tài)、糖發(fā)酵模式和溶血特性來確認疑似菌落。雖然這種方法廉價且簡單，但由于其耗時長且操作繁雜，并不適用于致病菌的快速篩查和即時檢測。

適配體是基于DNA 或RNA 的短單鏈寡核苷酸，當其折疊成獨特的三維結構時，可以選擇性地靶標結合，具有高親和力和特異性［12-13］。目前已有報道多種適配體作為診斷工具和疾病治療藥物靶向不同的目標。利用適配體進行檢測、分析和量化小分子和蛋白質已經成為時下熱點。使用適配體作為探針的一個最重要的優(yōu)點是該技術不需要動物或體內免疫，從而最大限度地減少批次與批次之間的差異［14-15］。

傳統(tǒng)方法由于耗時長，需要培養(yǎng)和核酸提取等步驟，無法滿足快速檢測需求。為了克服這些限制，及時采取措施防止疾病傳播和擴散，本研究旨在開發(fā)一種快速、準確的大腸桿菌檢測方法，以便在醫(yī)療、食品安全和環(huán)境監(jiān)測等領域得到廣泛應用，為保護公共衛(wèi)生和人民的健康提供有力支持。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究涉及的核酸適配體序列在上海生工生物技術有限公司合成（表1）；大腸桿菌、副溶血性弧菌、金黃色葡萄球菌、阪崎腸桿菌、單核增生李斯特菌、鼠傷寒沙門氏菌、兔多克隆抗體由中國農業(yè)大學農業(yè)部農業(yè)轉基因生物安全評估（食品）重點實驗室提供；NaCl、MgCl2、KCl、Na2HPO4、KH2PO4購自國藥集團化學試劑有限公司；乙二胺四乙酸（EDTA）購自山東拓普生物工程有限公司；吐溫20（Tween?20）購自天津富宇精細化工有限公司；1?（3?二甲氨基丙基）?3?乙基碳二亞胺鹽酸鹽（EDC）、N?羥基琥珀酰亞胺（NHS）購自上海麥克林生化科技有限公司；2?（N?嗎啉）乙磺酸（MES）購自南京都萊生物技術有限公司。自配制PBS 緩沖溶液（pH 7.4，8 g NaCl，0.2 g KH2PO4，2.9 g Na2HPO4·12H2O，0.2 g KCl，使用蒸餾水定容至1 L）、PBST 緩沖溶液（1 L PBS 緩沖溶液，0.5 mL Tween?20）、TE（稱取1.211 4 g Tris，0.033 6 g EDTA，使用蒸餾水定容至100 mL。）、SPSS（稱取NaCl 0.45 g，使用蒸餾水定容至50 mL）、BB結合緩沖液（pH 7.5，6.06 g Tris，8.775 g NaCl 和0.476 g MgCl2溶于800 mL 去離子水中，使用蒸餾水定容至1 L）。

LineGene 9600plus 熒光定量PCR 檢測儀購于杭州博日科技有限公司）；CF1524R 臺式高速冷凍離心機購于杭州恒流科技有限公司；可調式混勻儀旋渦混合器購于北京開源國創(chuàng)科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 抗體-適配體夾心法檢測原理 以免疫磁珠（immune magnetic beads, IMB）和裁剪后得到的具有高親和力的適配體S1?3 為識別分子，搭建生物傳感器檢測致瀉性大腸桿菌O157:H7。IMB 識別靶標上抗原區(qū)域和靶標進行特異性結合，形成IMB?靶標復合物。當在體系中進一步加入適配體S1?3 后，靶標上的適配體結合區(qū)域會進一步被結合，從而形成IMB?靶標-適配體三明治夾心復合物。當加入不同濃度的靶標時，復合物的形成比例也將不同，對其進行qPCR 實驗，根據(jù)其閾值周期數(shù)值（cycle thr?eshold value，Ct）變化即可對靶標進行量化（圖1）。

圖1 抗體-適配體夾心法檢測大腸桿菌原理圖Fig. 1 Schematic diagram of antibody aptamer sandwich method for detecting Escherichia coli

1.2.2 適配體的裁剪 取生長對數(shù)期的大腸桿菌培養(yǎng)物1 mL 于6 000 r/min 4℃離心5 min 移去上清，使用BB 清洗3 遍，再使其重懸于1 mL BB 中。將合成的適配體溶解于BB 中（100 μmol/L）并稀釋至1μmol/L，95℃孵育10 min，冰上立即冷卻10 min 以使核酸變性，便于后續(xù)與靶標的充分結合。取20 μL（1 μmol/L）適配體與180 μL 重懸在BB 中的大腸桿菌于25℃，200 r/min 孵育1 h 后，8 000 r/min 離心5 min，并用BB 漂洗5 次。將漂洗完成的菌體內加入100 μL TE 緩沖溶液，95℃下孵育10 min，立即4℃ 12 000 r/min 離心15 min，將上清稀釋至合適倍數(shù)后做qPCR 擴增模板。qPCR 反應體系總體積為20 μL：0.6 μL FP 和RP，10 μL 2×Universal SYBR qPCR Mix，2 μL 模板Apt，去離子水6.8 μL。反應體系在95℃下預變性10 min；95℃下變性10 s，在60℃下退火及延伸30 s，經過39 個循環(huán)。設置陰性對照組為不加入適配體其他操作相同，利用其Ct 值得出適配體裁剪效果。

1.2.3 免疫磁珠的制備 本實驗采用EDC/NHS 兩步法進行IMB 的制備。取100 μL 磁珠（magnetic beads，MB）至離心管中，磁性分離去除上清液，用200 μL MEST 溶液進行磁性分離洗滌2 次,然后移除上清液。迅速加入新鮮配制的100 μL EDC 溶液和100 μL NHS 溶液到裝有磁珠的離心管中，漩渦混勻使磁珠充分懸浮，25℃活化30 min，期間保持磁珠的懸浮狀態(tài)，200 μL 偶聯(lián)液反復洗滌3 次，磁分離去除上清；向其中加入40 μL 純化抗體置于搖床200 r/min 振蕩1 h，保持MB 處于單分子懸浮狀態(tài)；然后加入100 μL 封閉液孵育30 min，以封閉未反應的活化基團，磁分離洗滌3 次棄上清；最后加入200 μL PBS 緩沖液放于4℃冰箱備用。

1.2.4 抗體- 適配體夾心qPCR 法檢測大腸桿菌 制備完成IMB 后，加入不同濃度的培養(yǎng)至對數(shù)生長期的大腸桿菌，室溫孵育1 h，使用BB 反復清洗磁珠3 次，以充分去除未結合的靶標。向IMB中加入100 nmol/L 裁剪適配體充分反應30 min，進行3 次磁分離以去除未結合的融合適配體。qPCR反應體系總體積為20 μL：0.6 μL FP 和RP，10 μL 2×Universal SYBR qPCR Mix，2 μL 制備完成的生物傳感器，去離子水6.8 μL。對擴增曲線Ct 值進行數(shù)據(jù)分析?？瞻讓φ詹惶砑影袠宋镔|，其余操作與陽性樣本同步進行。除非特殊說明，所有實驗均進行3 次重復。

1.2.5 條件優(yōu)化 由于生物傳感器是通過兩步反應法完成，且為避免IMB?適配體偶聯(lián)，不改變原始設定IMB?靶標和裁剪適配體孵育時間30 min，對IMB?靶標孵育時間進行優(yōu)化，在30-60 min 內改變反應時間，測定其Ct 值變化，選取IMB?靶標最佳反應時間。

1.2.6 檢測性能探究 在最佳條件下，對生物傳感器在純培養(yǎng)物中定量檢測大腸桿菌的性能進行了探究。將濃度為106CFU/mL 的大腸桿菌進行10 倍梯度稀釋，使用稀釋后的菌液進行1.2.4 的操作，根據(jù)Ct 值和靶標濃度之間的關系繪制標準曲線，利用Ct值對靶標濃度進行量化。

1.2.7 特異性驗證 為探究傳感器是否具有特異性，選取金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、克羅諾桿菌屬（阪崎腸桿菌）、副溶血性弧菌、單增李斯特菌（屬間特異性驗證）和大腸桿菌ATCC 25922、大腸桿菌ATCC 35218、大腸桿菌CICC 10389、大腸桿菌CICC 10663（種間特異性測試）作為非特異性靶標，和大腸桿菌O157: H7進行對比測試傳感器傳感能力。

1.2.8 實際樣品檢測 在實際檢測中，往往無法實現(xiàn)對單純培養(yǎng)基質中大腸桿菌的研究，因此本實驗探究了傳感器在食品基質中的檢測性能。在最佳條件下，對生物傳感器在購自華聯(lián)超市的金典純牛奶基質中定量檢測大腸桿菌的性能進行了探究。對牛奶中3×103、3×104、3×105CFU/mL 的大腸桿菌進行加標回收實驗，測定其回收率和相對標準偏差。

2 結果

2.1 適配體裁剪

在對適配體S1 進行截短前，首先對該適配體的親和力進行評估。通過改變其與菌液結合的適配體的濃度和菌液濃度，評估其Ct 值變化。如圖2 所示，當改變與靶標結合適配體的濃度，從10 μmol/L 變?yōu)? μmol/L 時，其Ct 值呈現(xiàn)了10 倍梯度變化的趨勢（Ct：8.93-12.02）；當改變菌液濃度，從約為108CFU/mL 變?yōu)?07CFU/mL，而不改變適配體濃度1 μmol/L 時，其Ct 值呈現(xiàn)了10 倍梯度變化的趨勢（Ct：12.02-14.96）。且由于適配體濃度在1 μmol/L 時，其梯度變化趨勢更為明顯，后續(xù)裁剪實驗中均采用此濃度與靶標結合。

圖2 適配體裁剪可行性分析Fig. 2 Feasibility analysis of adaptor clipping

確定適配體S1 具有可行性后，開始對其進行裁剪。通過對其二級結構的預測發(fā)現(xiàn)，其在接近5'端區(qū)域存在一個莖環(huán)結構，推測核心序列位于該區(qū)域，因此首先裁剪得到接近5'端22 nt 的裁剪適配體S1?1，發(fā)現(xiàn)其和原適配體序列相比Ct 值從12.46下降至11.66，親和力有所上升（圖3?A）。雖然變化較小，但相比于原長已經減少了23 nt。第二步驗證了減少的23 nt 序列的冗余。裁剪適配體S1?2 和原始適配體S1 相比，Ct 從12.46 變?yōu)榱?3.69（圖3?B），因此可得出結論減去接近5'端的莖環(huán)結構后的適配體S1?2 的親和力有所下降。第三步繼續(xù)對適配體S1 的中間部分進行探究，保留11-30 位堿基即長達20 nt 的序列S1?3，發(fā)現(xiàn)其和原始適配體相比Ct 值明顯下降，由12.46 下降至9.87，親和力大幅度提升，因此得到核心序列S1?3（圖3?C）。最后對S1?3 繼續(xù)進行裁剪至12 nt 得到適配體S1?3?1，其Ct值為13.28，親和力明顯下降，推測由于序列太短導致其加上引物后占比過小從而失去和靶標結合能力（圖3?D）。

2.2 免疫磁珠的表征

本實驗對IMB 的制備結果進行了動態(tài)光散射表征，主要從粒徑變化和zeta 電位兩方面進行評估。當羧基磁珠與抗體分子經過偶聯(lián)時，激活羧基官能團并形成穩(wěn)定的NHS 酯中間體，形成穩(wěn)定的酰胺鍵，將抗體與羧基磁珠連接起來，由于羧基磁珠表面的羧基官能團帶有負電荷，而抗原分子中的氨基官能團是中性的，因此在偶聯(lián)過程中，抗原的連接會引入正電荷，導致電位點升高。如圖4?A 所示，MB 粒徑約為1 000 nm，與抗體偶聯(lián)后顯著增加至約1 271 nm，表明成功合成了IMB。同時zeta 電位值（圖4?B）表明，偶聯(lián)前后MB 表面上的電荷也發(fā)生了變化，再次驗證IMB 的成功合成。

圖4 IMB 的表征Fig. 4 Characterization of IMB

2.3 可行性驗證

當生物傳感器分別加入IMB、靶標和適配體后，生物傳感器出現(xiàn)較高響應（圖5?A），當菌液濃度在8×106CFU/mL 時，其Ct 值為7.27。當向生物傳感器中加入IMB 和適配體時，傳感器出現(xiàn)較低響應（Ct：18.85），推測由于體系中不存在任何菌細胞時，適配體和IMB 出現(xiàn)了非特異性結合從而出現(xiàn)了較低響應。當向生物傳感器中加入IMB 和靶標時，生物傳感器未出現(xiàn)響應，和預想一致。因此對8×106CFU/mL 菌液連續(xù)10 倍梯度稀釋4 次，測試其傳感能力，結果表明其梯度良好（圖5?B）。

圖5 生物傳感器可行性分析Fig. 5 Feasibility analysis for biosensor

2.4 條件優(yōu)化結果

在適配體裁剪過程中，對菌液清洗去除培養(yǎng)基時，將緩沖液由BB 分別替換為PBS、PBST、TE、SPSS。由圖6?A 可得，除PBS 的Ct 值15.45 接近BB 的Ct 值15.23 外，其余緩沖液結合效果均更差，因此緩沖液確定為BB 結合緩沖液。確定緩沖液類型后，改變緩沖液pH 為5.7、6.6、7.5 和8.4，由圖6?B 可得，適配體和靶標在pH 為7.5 時結合效果最好，因為在中性環(huán)境中適配體穩(wěn)定性更好。由圖6?C可得，孵育溫度在25℃時適配體和靶標結合效果更好，因此選用更便于實驗操作的25℃完成后續(xù)實驗。

圖6 條件優(yōu)化結果Fig. 6 Condition optimization results

在傳感過程中，IMB 和靶標結合，由圖6?D 可得，在30-50 min 內，Ct 值有所變化，當50 min 以后，結合趨于飽和，Ct 值基本不再發(fā)生變化。為保證IMB 和靶標充分結合，減少IMB 和適配體的偶聯(lián)，選取1 h 作為IMB?靶標孵育時間。

2.5 靈敏度分析

為了確定生物傳感器的檢測限，將在培養(yǎng)條件下的菌液從8×106CFU/mL 連續(xù)10 倍梯度稀釋至8×103CFU/mL。由圖7 可得，隨著細菌細胞濃度的增加，Ct 值也成比例地降低。在（8×103）-（8×106）CFU/mL 范圍內，存在良好的線性關系，線性方程為y=18.973 43-1.858 3LgC，回歸系數(shù)為0.999 74。其中y表示Ct 值，C 表示菌液濃度。通過該線性方程，可以計算出定量限為8×103CFU/mL，檢測限為800 CFU/mL。

圖7 靈敏度測定Fig. 7 Sensitivity measurement

2.6 特異性驗證

首先檢測了裁剪適配體的特異性。由圖8?A 可以看到，當加入相同濃度（100 nmol/L）的適配體時，靶標菌和其他非特異性靶標相比，具有較高響應，Ct 值為9.44，而非特異性靶標副溶血性弧菌（Ct：16.17）、金黃色葡萄球菌（Ct：15.00）、克羅諾菌屬（阪崎腸桿菌Ct：17.94）、單核細胞增生李斯特菌（Ct：18.14）和沙門氏菌（Ct：17.92）均與之有所差距。靶標菌Ct 值和非靶標菌之間存在顯著差異（P<0.05），證明該適配體具有良好的特異性。

圖8 大腸埃希菌 O157∶H7 檢測方法的特異性Fig. 8 Specificity of detection method for E. coli O157∶H7

其次檢測生物傳感器的特異性，向傳感器中加入不同靶標測試其傳感能力。由于不同菌生長情況不同，為盡可能地減小誤差，且更好展現(xiàn)出生物傳感器的特異性，靶標濃度稀釋至8×104CFU/mL，其他均復蘇4 h 后使用。由圖8?B 可以看到，在屬間測試中，當加入靶標菌時，生物傳感器具有較高響應，Ct 值為12.19，而非特異性靶標金黃色葡萄球菌（Ct：24.79）、沙門氏菌（Ct：29.43）、克羅諾菌屬（阪崎腸桿菌Ct：34.22）、副溶血性弧菌（Ct：34.61）、單核細胞增生李斯特菌（Ct：35.06）均與靶標有較大差距，靶標菌Ct 值和非靶標菌之間存在顯著差異（P<0.05）。由圖8?C 可以看到，在種間測試中，當加入靶標菌時，生物傳感器具有較高響應，Ct 值為12.25，而非特異性靶標大腸桿菌ATCC 25922（Ct：33.67）、大腸桿菌ATCC 35218（Ct：29.35）、大腸桿菌CICC 10389（Ct：29.81）、大腸桿菌CICC 10663（Ct：32.26）均與靶標有較大差距，靶標菌Ct 值和非靶標菌之間存在顯著差異（P<0.05）。因此認為該生物傳感器對大腸桿菌O157: H7 具有高度特異性。

2.7 實際樣品檢測

由于生物傳感器最終目的是用于食品中大腸桿菌O157: H7 的檢測，因此有必要將生物傳感器應用于人工污染的食品樣品中，對生物傳感器在食品中的檢測性能進行驗證。市面上的食品樣品被證實沒有可檢測到的病原體。在牛奶樣品中人工接種約108CFU /mL 的大腸桿菌O157: H7。接種4 h 后，通過傳統(tǒng)培養(yǎng)法測得實際細胞數(shù)約為3×107CFU/mL。連續(xù)10 倍梯度稀釋后選取細胞數(shù)為3×103、3×104、3×105CFU/mL 使用生物傳感器對其進行回收實驗，測得其回收率分別為96.3%、103%、108%，RSD 分別為2.15%、2.07%、1.35%（表2）。

表2 實際樣品檢測Table 2 Actual sample testing

3 討論

大腸桿菌O157: H7 是最主要的致病菌之一，常與食源性疾病相關，每年都會引起疾病發(fā)生和甚至造成死亡，因此對其構建檢測方法十分有必要。傳統(tǒng)常規(guī)培養(yǎng)法雖然準確度高，但耗時耗力。因此近年來更為快速的基于抗原和抗體的特異性結合的免疫學技術備受青睞。辛思培等［16］建立了一種針對大腸桿菌O157: H7 的雙抗夾心化學發(fā)光酶聯(lián)免疫檢測方法，檢測限為2.5×104CFU/mL，雖然與傳統(tǒng)ELISA 方法相比有更好的特異性和靈敏度,但仍需擴增培養(yǎng)10 h，同時單純的免疫學檢測方法易出現(xiàn)假陰性和假陽性結果。核酸類的分子檢測方法是檢測大腸桿菌和其他食源性病菌的常用手段。除了單一技術的使用，研究者們也已經嘗試將免疫學與分子學技術相結合，王淑娟等［17］開發(fā)了一種基于金屬有機骨架免疫磁珠富集結合多酶恒溫核酸快速擴增的檢測大腸桿菌O157:H7 的方法，檢測限為1.18×105CFU/mL。

近年來生物傳感器技術在致病菌菌株檢測方面取得了巨大的進步，并成為一種備受大眾認可的通用分析工具［18］。樊凱等［19］開發(fā)了用于檢測食品中大腸桿菌O157:H7，通過測量HRP 酶催化之后的過氧化氫的氧化還原電流，來實現(xiàn)電化學免疫生物傳感器，能在（5.2×10）-（5.2×106） CFU/mL 的動態(tài)檢測范圍內實現(xiàn)食品中大腸桿菌的檢測。以適配體作為識別原件，將生物識別事件轉化為可測量的物理或化學信號，信號檢測與處理系統(tǒng)則負責將信號轉化為可讀的結果的優(yōu)勢更為突出。

本文章利用免疫磁珠的捕獲作用和磁分離，并通過多克隆抗體和裁剪得到的適配體搭建生物傳感器。使用傳統(tǒng)的PCR 檢測由于取樣小，磁珠技術在檢測的過程中可以排除樣品基質性質的干擾，從而提高檢出率，縮短樣品中病原菌富集的時間［20］。在前人研究的基礎上，將45 nt 長的適配體序列裁剪至20 nt，得到其核心序列。從核酸文庫中選擇的全長適配體長度一般約為80 nt，但發(fā)揮靶體接觸作用的區(qū)域通常為10-15 nt［21］。在某些條件下，非必需核苷酸的存在會干擾適配體與靶分子的結合。多余的和不必要的核苷酸被消除后會提高其親和力。當在體系中進一步加入適配體S1?3 后，靶標上的適配體結合區(qū)域會進一步被結合，從而形成IMB?靶標-適配體三明治夾心復合物。加入不同濃度的靶標時，復合物的形成比例也將不同，使用實時熒光定量PCR 對靶標進行檢測，可以根據(jù)其Ct 值變化即可對靶標進行量化，最終實現(xiàn)對大腸桿菌O157：H7 的定量檢測。將該生物傳感器引入紙基技術或微流控技術，可以實現(xiàn)高通量的樣品處理和便捷快速檢測，能夠進一步縮短在實際應用中的檢測時間。

4 結論

本文成功構建了一種用于檢測大腸桿菌O157:H7 的抗體-適配體夾心生物傳感器。實現(xiàn)了對大腸桿菌O157: H7 在（8×103）-（8×106） CFU/mL 范圍內的定量檢測，該檢測限為800 CFU/mL，該方法具有良好的特異性，操作簡便成本低廉，可以在2 h內完成檢測。